(整理)转运体临床前研究评价指导标准以及实验方案

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转运体临床前研究评价的一些实验方案

FDA推荐主要研究的七个转运体及其底物、抑制剂
转运体 推荐特异底物 推荐特异抑制剂

P-gp/MDR1
地高辛、洛派丁胺、小檗碱、伊立替康、阿霉素、长春碱、紫杉醇、非索非那定 环孢霉素、奎尼丁、
Tariquidar、维拉帕米

BCRP/MXR
米托蒽醌、氨甲蝶呤、拓扑替康、伊马替尼、伊立替康、他汀类、硫酸结合物、卟啉类化合物 雌（甾）酮、17β-雌二
醇、fumitremorgin C

OATP1B1 Bromosulphophthalein、oestrone-3-sulphate、oestradiol-17β-glucuronide、他汀类、瑞格列奈、缬沙坦、奥美沙坦、葡萄糖醛酸胆红素、胆红素、胆汁酸 沙奎那韦、利托那韦、洛匹那韦、利福平、环孢霉
素

OATP1B3 Bromosulphophthalein、缩胆囊素8、他汀类、地高辛、非索非那定、替米沙坦糖苷、替米沙坦、缬沙坦、奥美
沙坦、oestradiol-17β-glucuronide、胆汁酸

利福平、环孢霉素、利托

那韦、洛匹那韦

OAT1 对氨基马尿酸盐、阿德福韦、西多福韦、齐多夫定、拉米夫定、扎西他宾、阿昔洛韦、替诺福韦、环丙沙星、甲氨蝶呤 丙磺舒、新生霉素
OAT3 Oestrone-3-sulphate、非甾体抗炎药、头孢克洛、头孢唑肟、利尿磺胺、布美他尼 丙磺舒、新生霉素
OCT2 N-Methylpyridinium、四乙铵、二甲双胍、心得乐、普鲁卡因胺、雷尼替丁、金刚烷胺、阿米洛利、奥沙利铂、
varenicline

西咪替丁、吡西卡尼、西

替利嗪、睾酮、奎尼丁

*底色为黄色的表示潜在临床可用。
七个转运体主要分布组织/细胞
转运体 主要分步组织及细胞

P-gp/MDR1
小肠上皮细胞、肾近曲小管、肝细胞（胆小管面）、
脑内皮细胞

BCRP/MXR
小肠上皮细胞、肝细胞（胆小管面）、肾近曲小管、
脑内皮细胞、胎盘、干细胞、乳腺
OATP1B1 肝细胞（窦状隙面）
OATP1B3 肝细胞（窦状隙面）
OAT1 肾近曲小管、胎盘
OAT3 肾近曲小管、脉络丛、血脑屏障
OCT2 肾近曲小管、神经元
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外排转运体(P-gp、BCRP)
1.作用底物鉴定
FDA总体要求： 所有药物都需要进行鉴定是否为P-gp、BCRP的底物
流程如下：

注：1. P-gp 底物鉴定决策树对BCRP近似适用。
2. 除了传统双向转运评价方法外，表达P-gp/BCRP的外翻囊泡，固体支持物上的细胞
单层（转染P-gp/BCRP、使用阳性对照），也可以运用到底物鉴定实验中。

2.抑制作用鉴定
FDA总体要求： 所有药物都需要进行鉴定是否对P-gp、BCRP有抑制作用。
注：1、P-gp 抑制剂鉴定决策树对BCRP近似适用。
2、除了传统双向转运评价方法外，表达P-gp/BCRP的外翻囊泡，固体支持物上的细胞
单层（转染P-gp/BCRP、使用阳性对照），也可以运用到抑制剂鉴定实验中。
[I1]为临床最大给药剂量下所达到的最大稳态血浓；[I2]为临床最大口服给药剂量下将胃
肠道容积视为250ml时药物在胃肠道的最大浓度。

实验方案：
1. Caco-2细胞：
准备工作：Caco2细胞培养传代，选择对数生长状态细胞种板，培养21天，测细胞
电阻以及做单层细胞模型验证实验（甘露醇以及地高辛）
双向转运实验：
用hanks平衡盐溶液(HBSS)将培养好的细胞洗涤2～3次。最后一次洗涤后测定
跨上皮电阻值以监控细胞质量。然后在细胞层的基底面一侧( basolateral side, BL)换
上HBSS, 在绒毛面一侧(apical side, AP)换上含有待测药物的HBSS, 以及相反操作,
在37℃恒温摇床中释药, 模拟体内吸收情况, 间隔一定时间取样。计算
表观渗透系数(Papp)计算公式为:

其中为渗透速率,Co为供药室中被测药物的初始浓度,A为细胞单层的表面积
计算Pb->a/Pa->b比值。
2. 囊膜转运：（ABC转运体囊泡是从杆状病毒感染的昆虫细胞表达获得）
流程：
首先进行NME抑制性试验，得到NME的IC50值。（需要先考察需要特异底物浓度、
转运实验时间） 可能产品说明书中能够提供案例说明上述考察项
然后进行NME底物确证实验（选用IC50值上下的两个浓度进行实验）

NME抑制性试验过程：
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底物+AMP 阳参+底
物+ATP
底物+ATP+不同浓度考察药物（0μM及后续升高浓度） n=2

反应体系：可能产品说明书中能够提供。
后处理方法：加入0.2ml的冰冷缓冲液终止反应，转运液迅速抑制96孔滤板，通过
F级玻璃纤维滤膜（0.7μm孔径）进行快速真空抽滤，滤膜冲洗后，加入0.2ml洗
脱液，真空抽滤收集滤液。
评价方法：将药物浓度为0时的底物转运率记为100%，计算体系中加入不同浓度
药物时的相对转运率，IC50值为相对转运率为50%时的体系药物浓度。

NME底物确证实验（n=2）

阳参+ ATP ATP+考察药物（IC50附近选择两个浓度） 不同时间点终止反应 AMP+考察药物（IC50附近选择两个浓度） n=2
反应体系和后处理方法同上
评价方法：计算各时间点、各浓度主动转运进入膜囊（ATP）和非特异性吸附(AMP)
的药量之比。若比值随药物浓度增加、随时间增加而增加，则说明为底物。

3. 细胞转染：（见最后）

附：
ATPase实验ATP酶分析能够提供关于一个分子和转运体亲和力的信息，但是无法提供

转运速率。（初步判断是否为底物）

实验方案：
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阴性 AMP + 药 阳性对照 ATP +特异底物 ATP+不同浓度药物(n=2)
不同
时间
点（5,
15,30,
45,60
min）

反应体系：可能产品说明书中有推荐。
后处理方法：10%SDS终止反应。加入200μl显色剂（35mM钼酸铵+15μM乙酸锌：10%坏
血酸），37℃孵育20min并测定750nm紫外吸收。若随药物浓度、随时间增加Pi生成量明显
增加，判断药物为转运体底物。

溶质载体转运体：
底物鉴定实验：
由于各转运体分布差异，在药物清除中的作用不同。需要首先进行在体实验，了解
药物的主要清除途径。
实验概述：将同批次大鼠随机分为四组。
组一 静脉给药，收集各时间点血浆，并算得总清除率。
组二 静脉给药，收集各时间段尿液，算得肾清除率。
组三 制作胆管插管模型，静脉给药，收集各时间段胆汁，算得肝清除率。
组四 静脉给菊粉，收集各个时间段尿液，算得肾小球率过滤。
将所得结果进行比较。

1.鉴定是否为OAT1/3、OCT2底物

2.鉴定是否为OATP1B1、OATP1B3底物
需要做的实验：（见最后）
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抑制作用鉴定实验：
1. OCT、OAT抑制剂鉴定

2. OATP抑制剂鉴定

细胞转染实验：
选用HEK293T细胞
实验基本流程：
设计目的基因PCR所需引物 细菌中所含目的基因的质粒DNA的抽提PCR  PCR产物回
收 酶切，构建重组质粒 制备感受态细胞 转化 获取质粒DNA并进行阳性克隆PCR
筛选
HEK293T细胞复苏、传代 转染 检测蛋白表达情况

测定方法学考察
考察药物对HEK293T细胞毒性
细胞转运实验：
（需要先考查时间、浓度、pH对细胞摄取药物影响的情况）

抑制细胞转运实验