ssRNA-Seq

1 / 17 RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理 在开始详细讲解RNA测序之前，我们先来了解一下它的基本步骤： 1. 建库：提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。 2. 测序：然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序（每个样本测序reads在DNA测序中，读数是对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对（或碱基对概率）的推断序列。深度为10-30 Million reads。） 3. 分析：先比对/拼装测序片段到转录本，通过计数、定量，样本间过滤和标准化，以进行样本组间基因/转录本统计差异分析。 大致了解这个过程之后，我们就先从建库开始了解 建库的难点在于提纯出mRNA, 一般在我们抽离出的RNA中rRNA占比很大，其他还会有tRNA、microRNA等。我们需要从抽离出的RNA中提取出mRNA，并建立cDNA文库。 这里以应用最广泛的Illumina公司的Truseq RNA的建库方法为例来进行介绍。 首先，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的（使mRNA更稳定，翻译不容易出错）特点，用带有poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，这样磁珠就和带poly(A)尾巴的mRNA结合在一起了。 接下来，就回收磁珠，把这些带poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。再用镁离子溶液（或者超声波）进行处理，把mRNA打成小段。 然后，利用这些被打断的mRNA片段，以随机引物进行逆转录，得到第一链cDNA。 再根据第一链cDNA合成出ds-cDNA。 对cDNA在平末端进行3’端加A碱基（腺苷酸）（adapter接头上带了T碱基头，为了和adapter配对） 2 / 17 在双链cDNA的两端加分别上Y型接头 再经PCR扩增经筛选的目的基因，就得到可以上机的测序文库了。 这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。 因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是带有Poly(A)的那些序列。那么如果mRNA发生了降解，也就是mRNA断掉了，那么磁珠所吸附下来的片段，都是那些靠近3'端的那些断片，而那些5'端的断片，是吸附不下来的。会在富集过程中被洗脱掉。这样进行数据分析的时候，就会发生一定的数据偏差。 同时，为了保证能够测到尽可能完整的mRNA序列，Illumina公司建议：先对总RNA进行一次质量检测。 一般是用Agilent公司出品的Bioanalyzer 2100毛细管电泳仪，对总RNA样本进行一次电泳质检。根据18S和28S这两个核糖体RNA的电泳峰是否高、是否尖，来判断RNA的质量。这两个峰越高、越尖，也就说明RNA的降解就越少，完整度就越高。 同时系统会自动打分。这个分值，叫“RIN”值。也就是RNA的完整度评分值。是“RNA Integrity Number”的英文首字母缩写。这两个峰越高、越尖，那么打分，也会越高。（之前说过，越高越尖说明RNA完整度越好）RIN值最高是10分，最低是0分。 Illumina公司推荐用RIN值在8.0以上的RNA进行建库和测序。 Illumina测序即二代测序技术通常是RNA-seq测序中最常用的。接下来，我们简单了解一下它的原理。先说flow cell ，它是含有管道的一片玻璃，是测序反应发生的位置。 然后在接上接头之后，我们首先要进行桥式PCR。 3 / 17 首先是右图第一步接好接头，然后将DNA样品调整到合适的浓度加入到flowcell中，再加入特异的化学试剂。就可以使得序列的一端与flowcell上面已经存在的短序列通过化学键十分强健地相连。如左图。图中不同的颜色表示的是两种不同的接头，分别对应序列之前加入的两种接头。 连接以后就正式开始桥式PCR。首先进行第一轮扩增，将正向链序列补成双链。加入NaOH强碱性溶液破坏DNA的双链，并洗脱。留下从固定的接头上延续出来的反向链，正向链被洗脱。得到右图的第二步。 加入缓冲溶液，这时候序列自由端的部分就会和旁边的接头进行配对，形成桥状。得到右图的第三步。 进行一轮PCR，在PCR的过程中，序列是弯成桥状，所以叫桥式PCR，一轮桥式PCR可以使得序列扩增1倍。也就是右图的第四步。 然后用碱液进行解链，由于合成是各有一端是延续在接头上的，不会被洗脱。从而得到两条固定好的序列。如右图的第五步 我们一直重复第3步到第5步，就可以得到就会得到一个具有完全相同序列的簇，一般叫cluster。就是第6步 利用多个序列进行桥式PCR就会得到多个簇。 形成簇之后，加入带不同荧光标记的含有叠氮基团的dNTP和聚合酶，由于叠氮基团的存在（又称为可逆阻断终止技术），一个循环只能延长一个碱基，即一个碱基结合到测序链上为一个循环，当结合上一个碱基后，把其他dNTP和酶用水冲掉，然后进行激光扫描，根据激光扫描颜色判断是哪个碱基，根据互补原则反推出结果。再切掉叠氮基团，进入新的循环，加入新的dNTP和酶，再延长碱基，冲掉dNTP和酶，再激光扫描。如此往复，就可以测出序列的内容。如图，我们每轮读一个碱基，将每一轮的碱基按顺序组合，就可以得到待测序列了。 我们回到文中的图片。这个流动池图，就是刚才我们所说的原理，不同颜色代表不同碱基。我们根据颜色就可以读出这一轮循环所接上去的碱基。 4 / 17 说完了测序，我们回到数据分析。第一步，一般需要进行Data Cleaning。就是把从原始数据（Raw Data）到干净数据（Clean Data）的过程。Illumina测序仪下机的数据通常为Bcl格式，是将同一个测序通道（Lane）所有样品的数据混杂在一起的，所以公司一般不会提供Bcl文件。测序公司使用Illumina官方出品的Bcl2FastQ软件，根据Index序列分割转换成每个样品的FastQ文件，打开长这样：每一条序列（read）包含四行，第一行是read的ID，第二行是序列，第四行是序列中每个碱基的测序质量。 原始数据没法直接分析，是因为部分reads测序质量较低，可能会误导后续结果，因此需要对低质量碱基太多或N（未能识别的碱基）太多的reads进行去除； 此外，部分测序文库的插入片段太短，导致测到的是两侧的接头序列，这些序列接头也需要从reads中去除。最后，我们也会对清洗前后的Raw Data和Clean Data进行评估，评估内容包括碱基质量、序列长度、碱基比例、GC含量、重复序列等。一般测序公司都会提供clean data。就不详细赘述了。 然后呢，需要把测到的RNA片段，先mapping(比对)到基因组上。 这张图我们可以看到，在外显子表达的时候，由于中间有内含子存在，使得两端外显子表达之后再连接。这个带有junction site 的部分，我们再测序后称为junction reads。了解到的几种mapping方法，都是先放置non-junction reads 部分再根据对 junction reads进行处理（根据junction Library或切断为seed）。也就是我们最后看到的这样，把序列比对上基因组。 可是对于用于分析没有参考基因组和基因注释的物种，我们是没法进行比对的。所以我们需要进行序列组装。以Cufflinks软件为例。 首先，先不要看下面的三个转录本，假设只知道上面的已经比对好的reads。Cufflinks会识别这些不会出现在同一个转录本的reads即不相容。例如比较清晰的蓝色和黄色，如果在一个转录本，那么，黄色应该在相同的位置断开，而不是跨过去。如图中所示，经识别不同颜色片段两两互不相容的，同一颜色的片段， 5 / 17 彼此是相容的。 那么，通过将每个相容的片段作为节点并和它最近且相容的片段相连。就可以得到所谓的重叠图。 在此基础上，我们基于精简原则。Cufflinks在能够覆盖所有reads的路径中选择出互不相连且最少的一组路径，作为最优路径。我们怎么理解这个最优路径呢，互不相连且最少。那不符合这个原则，我们可以走出什么样的路径呢？比如这样的，这样的。路径就会变得很复杂，没有这个必要。选择最优途径，即覆盖了所以reads，又减少了不必要的重复工作。 最终呢，我们就得到了这样的三个转录本集合。 我们可将序列组装想像成从大量片段的文字中拼凑出一整篇文章的过程：被测序的分子就是那篇文章，而测序片段就是那段文章中，随机切取出来的句子。其中一种重建出这段文章的方式，就是找到句子中重叠的部分，因为一旦找到够多重叠的部分，我们就有机会将每个句子连接到一起，进而得到原始的文章。 好了，说完组装之后呢，我们回到这个数据分析。 那么在比对或者是组装完了之后，可以先看一下，有多少的RNA片段，是在靠近基因的5'端的位置，又有多少片段在是靠近基因的3'端的位置。 那么这张图上，就是把所有的基因，都按其外显子的长度，拉直。然后来看，比对上的片段。 这样一个比对的结果，就可以让我们看见前面Poly(T)磁珠在抓mRNA的时侯。捕获下来的这些mRNA是不是完整的，如果捕获下来的这些mRNA大部分是完整的话，那么这个图形靠近5'端的曲线就会显得比较饱满。它的高度会和3'端的高度差不多。 6 / 17 反之，如果这根曲线的3'端是很高的，而5'端是比较低的，我们就可以初步判断，这个RNA有一定程度的降解。 因此，我们可以推断在捕获过程当中，有相当一部分（mRNA），它的5'片段因为与3'片段的Poly(A)片段的尾巴断开了，所以，没有被捕获下来。所以，这个RNA，是有一定程度降解的。 在知道了测序的质量之后，接下大家来要关注的就是不同样本之间、各个基因的mRNA的表达量的差异。 在做这些比较的过程当中，目前最常用的，对基因表达量进行相对定量的一个指标（也叫归一化方法），就是RPKM值。那么RPKM，是Reads Per Kilobase of exon model perMillion mapped reads的英文的首字母缩写。 大概意思就是每一百万条可以比对到基因组上的，Read当中，有几条是可以比对到某个特定基因的，这个数值再除以该基因的外显子的长度，得到的这样一个最终的比值。好，再来一遍，每一百万条比对到全基因组的read中，有几条可以比对到特定基因上面去。几条这个数值再除以该基因的外显子的长度，得到一个最终的比值。 基本构成我们是知道了，那我们接下来，在详细的分步地对这个公式进行一下解释。 首先，就是比对到某个基因的外显子上的Read数，去除以这次所测到的、全部可以比对到基因组上的Read数。这个比较容易理解就是：这个基因所表达出来的mRNA它所被测到的片段，来和所有被测到的、可以Mapping(比对）到基因组上的片段来进行比较。这个的意义是什么呢？因为在是随机抽样的情况下，可以认为这个mapped到特定转录本的read数正比于该基因（也就是特定转录本）的表达量，那么我们就可以得到该特定基因的表达量在总表达量中的占比。 这点是比较容易理解的。 7 / 17 那么比较费解的是，为什么还要除以第二项，就是“除以这个外显子的长度”。这是因为建库过程当中，RNA被打断（并逆转录）成若干个180-200BP左右的小片段，如果一个基因的长显子越长，那么它所产生的mRNA就越长，那么mRNA越长，被打出来的小片段就越多，那么它的read数就越多。 我们来假设，一个A基因，它的mRNA的长度，假设它是500bp，那么它的mRNA可能被打成2 个，200Bp左右的小片段；还有一个B基因，如果这个B基因的mRNA是200bp长，那么它刚好就是自成一个200bp的小片段。 我们来看，A基因是2个小片段，而B基因是1个小片段，所以，A基因在测序过程当中，它被测到的概率就会比B基因整整大出去一倍。那当我们检测到时，就可能会认为A基因的表达量是B基因的2倍。那么结合我们之前的公式来看，我们的mapped read读数也就是分子的确是A是B的两倍。 但其实我们知道这是不对的，我们可以看出，他们的表达量是一样的，只是A基因比较长。这就是我们为什么要把刚才第一项比出来的比值，然后再除以这个外显子的长度。通过上面的解释，我们就可以理解：除以这个外显子的长度，它的目的，是修正这个mRNA长度所引起的mRNA的Read数的偏差。 通过这种修正，就能够还原出一个比较真实的、原始的表达拷贝数状态。 这个，就是“RPKM”指标的原理。 那么作为一种针对全转录组的分析，我们希望是一次看到一个整体的样本（表达）差异的情况。而不仅仅是看少数几个基因的表达差异。 所以，科学家做了一种叫“火山图”的一个图形，来比较形象地来说明样本之间的表达差异。 那么我们来看这张图。 看最上面，我们知道对照样本为ALD，检测样本为ABF。然后，我们先明确一下。在差异表达火山图中的每一个点，都表示一个基因。一个什么样的基因呢？就是

rna-seq统计相对表达量的算法

RNA-seq（RNA-sequencing）是一种用于测定转录组中RNA分子相对丰度和表达水平的技术。通过RNA-seq可以对不同条件下的基因表达进行比较和分析，从而揭示基因调控和功能。

相对表达量的统计是RNA-seq分析的重要步骤之一，它可以用来比较不同基因在不同样本中的表达水平。相对表达量是指同一样本中不同基因的表达量之间的相对关系，而不是绝对表达量的大小。相对表达量的统计算法主要包括RPKM（Reads Per Kilobase of

transcript per Million mapped reads）和FPKM（Fragments Per

Kilobase of transcript per Million mapped fragments）。

RPKM是一种常用的相对表达量统计方法，它考虑了测序深度和基因长度的影响。RPKM的计算公式为：

RPKM = (10^9 * C)/(N * L)

其中，C表示基因的测序读数（count），N表示所有基因的总测序读数，L表示基因的长度（以kb为单位）。RPKM的值越大，表示基因的表达水平越高。

FPKM是在RPKM的基础上进行修正的方法，考虑了测序片段的长度和测序深度的影响。FPKM的计算公式为：

FPKM = (10^9 * C)/(N * L * F)

其中，C表示基因的测序片段数，N表示所有基因的总测序片段数，L表示基因的长度（以kb为单位），F表示测序片段的长度（以bp为单位）。FPKM的值也代表了基因的相对表达水平，值越大表示表达水平越高。

相对表达量统计的算法并不仅限于RPKM和FPKM，还有其他一些方法，如TPM（Transcripts Per Million）和DESeq等。这些方法在考虑了测序深度、基因长度、片段长度等因素的基础上，通过数学模型和统计分析，得出基因的相对表达量。不同的方法适用于不同的研究目的和数据特点，研究人员可以根据实际情况选择合适的方法。

rnaseq数据分析流程

RNA-seq数据分析流程。

RNA测序（RNA-seq）是一种用于研究转录组的高通量测序技术，它可以帮助科研人员了解基因表达和转录本结构。在本文中，我们将介绍RNA-seq数据分析的一般流程，包括数据预处理、基因表达分析和功能注释等步骤。

1. 数据预处理。

首先，我们需要对原始的RNA-seq数据进行质量控制（QC）。这包括使用软件如FastQC来评估测序数据的质量，检测是否存在低质量的碱基或测序错误。接下来，我们需要对数据进行去除接头（adapter trimming）和过滤低质量读（quality filtering）。这些步骤可以使用工具如Trimmomatic或Cutadapt来完成。最后，我们需要对清洗后的数据进行比对到参考基因组（alignment），这可以使用软件如HISAT2或STAR来完成。

2. 基因表达分析。

一旦我们获得了比对到参考基因组的数据，我们就可以开始进行基因表达分析。首先，我们需要对比对结果进行计数，这可以使用软件如featureCounts或HTSeq来完成。然后，我们需要对表达数据进行标准化，例如使用DESeq2或edgeR来进行基因表达的差异分析。最后，我们可以使用一些可视化工具如ggplot2或heatmap来展示基因表达的模式和差异。

3. 功能注释。

最后，我们可以对不同表达的基因进行功能注释。这包括对差异表达基因进行富集分析（enrichment analysis），例如富集在特定的通路（pathway）或生物学过程（biological process）中。这可以使用工具如DAVID或Enrichr来完成。此外，我们还可以对差异表达基因进行蛋白质-蛋白质相互作用分析（protein-protein

interaction analysis），例如使用STRING数据库来预测蛋白质之间的相互作用网络。

RNA测序（RNA-Seq）是一种重要的高通量测序技术，它可以用来研究基因表达水平、寻找新基因和发现剪切变体等。下面我们将从浅入深地介绍RNA测序的原理。

1. 什么是RNA测序？

RNA测序是一种用来测量和分析细胞或组织中所有RNA分子的技术。它可以帮助科学家了解哪些基因在特定条件下被表达、表达水平如何以及RNA的剪切变体等信息。

2. RNA测序的基本步骤

RNA测序的基本步骤包括：RNA提取、RNA片段化、建库、测序和数据分析。首先，需要从样本中提取RNA，然后将RNA进行片段化处理，接着进行建库（library preparation），然后进行高通量测序，最后对测序数据进行分析。

3. RNA提取

RNA提取是RNA测序的第一步，它的目的是从细胞或组织中提取出RNA。常用的RNA提取方法包括TRIzol法、磁珠法和柱式法等。提取到的RNA需要经过质量检测，确保RNA的质量符合测序要求。

4. RNA片段化

RNA片段化是将提取到的RNA分子切割成较短的片段，通常是碱基对的长度。片段化可以通过化学方法或酶切方法来实现。片段化后的RNA可以用于建库和测序。

5. 建库 建库是将片段化的RNA转化为可以被测序仪读取的文库。在建库过程中，需要进行首末端修复、连接接头、PCR扩增等步骤。建库的质量和效率对后续的测序和数据分析有着重要影响。

6. RNA测序

建库完成后，接下来就是进行高通量测序。RNA测序通常采用Illumina测序平台，通过测序仪对建库后的文库进行测序，生成原始的测序数据。这些数据可以包括数百万到数十亿条不同长度的RNA片段序列。

7. 数据分析

最后一步是对测序数据进行分析。数据分析的内容包括清洗数据、比对到参考基因组、估计基因表达水平、发现新基因和剪切变体、进行差异表达分析等。常用的数据分析工具包括TopHat、Cufflinks、DESeq2等。

总结

RNA测序技术的原理包括RNA提取、片段化、建库、测序和数据分析等步骤。这些步骤的每一步都需要精确的操作和严格的质量控制，才能确保获得可靠的测序数据。RNA测序技术的发展为科学家们提供了一个强大的工具，可以在基因表达水平上进行全面、精确的研究，对于生命科学领域的发展具有重要意义。