医学免疫学—淋巴细胞

该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规 模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及 药敏试验等。
CCK8法与其他检测法的优势
实验材料
小鼠、75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4） 红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液 、胎牛血清、刀豆蛋白A、CCK8检测试剂 盒
眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、 无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管、微量 移液器、枪头、血球计数板、计数器
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋 巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增 加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等 形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过 程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色 镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
96孔板布局
PBS孔
调零孔 未刺激组 刺激组
K8检测：培养结束后，每孔（调零组、未 刺激组、刺激组）加入10 μL CCK8溶液，将 培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测 定在450nm处吸光度。
优点：简便易行，仪器简单 缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关 ，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶 核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入 到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入 淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的 转化程度。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激 ，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛 、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象， 所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了 解T细胞功能

• TI-Ag刺激B发生免疫应答不依赖T细胞 • TI-Ag只能刺激B细胞产生IgM • B细胞对TI-Ag不产生再次免疫应答和免疫记忆
第三节 B细胞对TI抗原的应答
B细胞对TI抗原应答的意义
1. 在感染早期发挥作用。 2. 能有效地杀灭具有荚膜多糖的细菌。
细胞免疫应答与体液免疫应答的主要区别 持续时间 抗体类别 抗体亲和力 抗原性质 需要的抗原剂量
长（5-10天） 低 短
IgM为主 低
TD-Ag 、TI-Ag 大
短（2-3天） 高 长
IgG为主 高
TD-Ag 小
本章重点内容
1、B细胞识别抗原的特点及活化的双信号模型。 2、TD抗原诱导体液免疫应答过程中Th对B细胞的辅助作用。 3、比较初次免疫应答和再次免疫应答的特点。 4、抗体分子的免疫学效应。
第二节 体液免疫应答的一般规律
初次免疫应答（primary response）
概念——机体第一次接触某抗原所产生的免疫应答.
再次免疫应答（secondary response）
概念——机体再次接触相同抗原所产生的免疫应答.
第二节 体液免疫应答的一般规律
初次与再次体液免疫应答的特点比较
特征
初次应答
本章重点讲述B细胞对TD抗原的应答。
第一节 B细胞对TD抗原的应答
一、B细胞对TD抗原的识 别
BCR复合物
(一）B细胞 经由BCR识别抗原
第一节 B细胞对TD抗原的应答
（二）BCR识别抗原的特点：
1、BCR可直接识别多种抗原物质（天然蛋白、 多肽、核酸、多糖、和小分子化合物）
2、BCR既可特异识别完整蛋白质的天然空间构象 又可识别蛋白质降解暴露的表位构象； 故无需APC的提呈，也不受MHC限制

功能基因 （有转录活性） 6
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（二）基因重排 （形成功能基因）
H链为例
V…D…J…C V…DJ…C
VDJ…C
VDJC
随机重排可形成的多样性为65276=10530
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VH基因的重排可诱导VL基因的重排 V…J…C VJ…C VJC
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（四）BCR多样性产生的机制
1. 组合造成的多样性
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第十一章 B 淋巴细胞
一、B细胞表面分子 二、B细胞亚群分类 三、B细胞的功能
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第二节、B细胞亚群分类：
按表达CD5划分：
表面分子： BCR: 发生分化分布 补充更新 针对43;
B2细胞(普通Ｂ细胞)
CD5 -
SmIgM
SmIgD、 SmIgM
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第一节 B细胞表面分子
三. 协同刺激分子
1. CD40分子： 配体：T细胞上CD40L。 作用：是辅助B细胞充分活化的最重要分子
2. CD27, 配体： CD70 3. CD70， 配体： CD27 4. CD80/CD86, 仅在活化B细胞表达
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第一节 B细胞表面分子
四. 其它膜表面分子： 1. 丝裂原受体：脂多糖(LPS)受体。 2. MHC分子：B细胞表达MHC-I类和II类分子。 3. 细胞因子受体：如IL-2R、IL-4R、IL-5R等。 4. 补体受体、 Fc受体:
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B细胞分化成熟与BCR
骨髓内Ag非依赖性分化成 原B细胞 熟
Ag
外周Ag刺激 后分化成熟
SmIgD
SmIgM
SmIgM SmIgD
前B细胞 幼稚B细胞 成熟B细胞

IgD and IgM normal
IgD
IgM
IgM
IgD IgM
BB
IgD
IgM IgD
Mature B cell exported to the
periphery
4、Ig基因重排（gene rearrangement）
• Ig的基因结构(胚系基因)
– κ链基因-- 2号染色体长臂 λ链基因-- 22号染色体短臂 H链基因-- 14号染色体长臂
Immature B cell recognises MULTIVALENT
self Ag
Immature
BB
YY
B
Clonal deletion by apoptosis
Negative selection-Anergy
Immature B cell recognises
soluble self Ag No cross-linking
两个主要变化: • 体细胞高频突变 • Ig转类（同种型转换）
三、抗原识别受体多样性产生机制
1、组合造成的多样性 多个V（D）J基 因片段，VDJ、VJ随机重组
2、连接的多样性（连接的不精确性）
3、体细胞高频突变
第二节 B淋巴细胞的表面分子
（一）BCR复合体
1. BCR分子： – 即SmIg（膜表面免疫球蛋白） – 成熟B细胞含有：SmIgM和SmIgD – 负责结合天然抗原
IL-4 , IL-5, IL-10
B
第1信号
Th
第十一章 B 淋巴细胞
(B Lymphocytes)
• 目的要求：
• 1． 掌握B淋巴细胞发育过程。 • 2． 掌握 BCR复合体的组成及功能。 • 3． 掌握 B淋巴细胞亚群、功能。 • 4． 熟悉 B淋巴细胞表面共受体、共

IgV区基因的重排主要通过重组酶的作用实 现的。
浙中医大 微免教研室 刘文洪
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重组酶包括：①重组激活酶基因（RAC）②末端脱 氧核苷酸转移酶③DNA外切酶，DNA合成酶等。
重组酶作用：可以从众多的V(D)J基因片段中个选择 1个V片段，1个D片段和一个J片段重排在一起，形 成V(D)J连接，最终表达为有功能的BCR
4.体细胞高频突变：在已完成Ig基因重排的基础上 ，成熟B细胞在外周淋巴器官生发中心接受抗原刺 激后发生。不仅能增加抗体的多样性，而且可导致 抗体的亲和力成熟。
浙中医大 微免教研室 刘文洪
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（三）B细胞在中枢免疫器官中的分化发育
造血干细胞→淋巴样干细胞→祖B细胞→前B细胞 →未成熟B细胞→成熟B细胞
CD32 有a和b两种亚型，其中b亚
型即FcγRIIB ，负向调控B细胞 的活化及抗体的分泌。
浙中医大 微免教研室 刘文洪
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Fc受体 (1) 组成：主要为FcγRⅡ-B1分子，含一个ITIM
（immuno-receptor tyrosine-based inhibitory motifs）免疫受体酪氨酸抑制基序基序。
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第一节 T细胞的分化发育
HSC在骨髓中分化成淋巴样祖细胞。可经血液循 环进入胸腺，在胸腺中完成T细胞的发育，成为成 熟T细胞，再经血液循环进入外周淋巴器官，主要 定居于外周淋巴器官的胸腺依赖区，接受抗原刺 激发生免疫应答。
高 糖类 多反应性 IgM>IgG
低/无 低/无
B-2 -
出生后 由骨髓产生
低 蛋白质 单特异性,尤其在免疫后 IgG>IgM
高 有
浙中医大 微免教研室 刘文洪
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第四节 B细胞的功能

2
3
T淋巴细胞
HSC
淋巴样前体细胞
成熟T细胞
T
骨髓
胸腺
外周淋巴器官
从淋巴样前体细胞发育为成熟T细胞的过程 中伴随有T细胞表面标志的一系列变化。
依据T细胞表面标志的不同，可将其 分为不同亚群。各亚群T细胞既相互 协作，又有各自的功能特点，从而 发挥其各自的免疫学功能。
4
T淋巴细胞
T细胞的分化发育 T细胞的表面标志 T细胞的亚群及功能
IL-2的受体
γ
α
βγ β
α
低亲和力 中亲和力 高亲和力
IL-2R
静止的T细胞仅表 达低亲和力受体
活化的T细胞表 达高亲和力受体
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丝裂原受体
T细胞表面上存在 丝裂原受体，丝裂 原与之结合后可刺 激T细胞转化为淋 巴母细胞，诱导T 细胞的增殖。
TCR
常见的T细胞丝裂原有 刀豆素A（ConA）、 植物血凝素（PHA）、 美洲商陆（PWM）
免疫细胞—淋巴细胞
掌握：T、B细胞的表面分子及其生物学作用；T、B细胞亚 群及功能。
熟悉：T细胞在胸腺内的发育（阳性选择和阴性选择）。 了解：B细胞的分化发育过程。
1
淋巴细胞概述
NK
淋巴细胞
B
T、B细胞参与适应性免疫应答，它们在 免疫应答的过程中互相制约、互相协助， 共同完成对抗原物质的识别、应答和清 除，从而维持机体内环境的稳定。
T祖细胞 CD4– CD8-TCR-CD3
胸腺皮质
阳性选择
CD4+ CD8+ TCR 及CD3低表达
获得MHC限制性
皮髓质交界处 CD4+ ♥
胸腺髓质
阴性选择
♥Байду номын сангаасCD4+

必要条件：胸腺微环境 主要事件：功能性TCR的表达； 自身MHC限制性的形成； 自身免疫耐受的形成。
第一节 T细胞的分化发育
Chapter 1 Differentiation and Development of T cells
一、T细胞在胸腺中的发育
1．TCR的胚系基因结构 V区基因：V、D（TCRβ链、δ链）、J基因片断； C区基因：C基因片断。
二、CD8+杀伤性T细胞的功能
第四节 T淋巴细胞的功能
Chapter 4 Functions of T cells
三、调节性T细胞的功能
抑制免疫应答
教学要求和目标
1．熟悉T细胞的分化发育。
2．掌握T细胞表面主要的分子及其作用。 3．熟悉T细胞的亚群。 4．掌握T细胞的功能。
功能性TCR的表达
阳性选择——获得MHC限制性 阴性选择——获得自身免疫耐受性
第一节 T细胞的分化发育
Chapter 1 Differentiation and Development of T cells
二、T细胞在外周淋巴器官中的分化发育

初始T细胞（naï ve T cell）
第三节 T细胞的亚群
TCR－CD3：
TCR识别抗原所产生的活化信号由CD3分子转导到T细胞 内，因为CD3分子胞浆区有ITAM。
注意：
TCR不能直接识别蛋白质抗原表面的表位， 只能特异性识别APC或靶细胞表面的抗原肽－MHC分子 复合物（pMHC）——“双识别”。
第二节 T细胞的表面分子及其作用
Chapter 2 T cells Surface Molecules and Their Functions
（一）CD4+Th细胞的亚群

• CD4和CD8分子的主要功能: （1）辅助TCR识别抗原 （2）参与T细胞活化（第一）信号的转导。
是TCR的共受体
CD4基本结构及作用
CD4分子是由一条肽链 组成的跨膜蛋白。胞外 区具有4个Ig样结构域， 其中远膜端的2个结构 域能够与MHCⅡ类分 子的β2结构域结合。
CD8基本结构及作用
CD8分子由α和β肽链组成， 2条肽链均为跨膜蛋白，由二 硫键连接。胞外区各含一个 Ig样结构域， 能够与MHCⅠ 类分子的α3功能区结合 。
7．LFA-1和ICAM-1
T 细 胞 表 面 的 淋 巴 细 胞 功 能 相 关 抗 原 -1 （LFA-1）与APC细胞上细胞间黏附分子1（ICAM-1）相互结合，介导T细胞与APC 或靶细胞的黏附。T细胞也可表达ICAM-1， 同APC、靶细胞或T细胞自身表达的LFA-1 结合。
四、丝裂原受体及其他表面分子
（四）T细胞发育的阴性选择（negative selection)
部位：胸腺皮髓交界处、髓质，主要由胸腺
DC、Mφ起选择作用。
SP
胸腺DC、Mφ
高亲和力结合自身肽:MHC-Ⅰ类分子
凋亡或无能
CD8+T
不结合 自身肽:MHC-Ⅰ类分子
成熟CD8+T细胞
高亲和力结合 自身肽:MHC-Ⅱ类分子
凋亡或无能
2．CD3的结构和功能 1) 是成熟T细胞又一特征性表面标志。
2）是TCR-CD3复合体中信号转导的亚单位， 将TCR接受的抗原刺激信号转导至细胞内，使T 细胞活化。
3) 组成与结构：由、、、、五种
肽链组成。两两形成二聚体与TCR组成复合体。
4）每条肽链胞质区较长，均含有 免疫受体 酪氨酸激活基序（ITAM），由18个aa组成，含2 个YxxL/V保守序列。

T LYMPHOCYTE
T LYMPHOCYTE
阳性选择与阴性选择
• 阳性选择：即双阳性胸腺细胞的 TCR与胸腺基质细胞表面的 MHC 分子 以适当亲和力结合，导致克隆增殖，分化成功能性 T 细胞的过程。
阳性选择赋予成熟T细胞具有识别和结合MHC的能力，保存了与自己MHC 结合的、受 MHC 限制的、对外来抗原发生特异性反应的细胞克隆，是T细胞 成熟的一种方式
TCR基因结构
链基因结构：位于第14号染色体上，由V、J、C三种基因片段组成 链基因结构：位于第7号染色体上，由V、D、J、C四种基因片段组成 链基因结构：位于第7号染色体上，由V、J、C三种基因片段组成 链基因结构：位于第14号染色体上，由V、D、J、C四种基因片段组成
1. 重排多样性 2. 链和 链配对多样性
3. 不精确连接 4. N区核苷酸插入 （ 、b 链均发生）
TCR多样性和CDR3
肽 TCR
MHC
V区：CDRs
CDR1 CDR2 CDR3
MHC 肽
CDR3决定特异性（克隆水平） 多样性（个体水平）
医学免疫学
上海第二医科大学免疫教研室
医学免疫学
medical immunology
T LYMPHOCYTE
T 淋巴细胞:来自卵黄囊、胎肝及骨髓的 T 细胞 的前体干细胞，经血流输送至胸腺，从胸腺的浅皮 质区至深皮质区、髓质区移行，并在胸腺微环境中 分化、发育、成熟。故称其为胸腺依赖性淋巴细胞 （thymus dependent lymphocyte)。
胸腺细胞的阳性选择，获得MHC限制性 胸腺细胞的阴性选择，获得自身免疫耐受性 T细胞受抗原刺激在外周淋巴器官的进一步分化 TCR、CD4、CD8分子的表达是T细胞不同发育阶段的主要标志。