人钙调神经磷酸酶Aα RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

CRBP-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定作者：陈波，李建平，戴途，吴志勇，罗蒙，孙勇伟【摘要】目的：构建大鼠视黄醇结合蛋白-1(cellular retinol-binding protein- I ，CRBP-1)基因RNAi（RNA interference，RNAi）慢病毒载体。

方法：针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1 基因RNAi 有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA，退火形成双链DNA，与经Hpa I 和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体，PCR 筛选阳性克隆，测序鉴定。

结果：PCR 鉴定与DNA测序证实合成的含CRBP-1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。

结论：成功构建大鼠CRBP-1基因RNAi 慢病毒载体。

【关键词】 RNA干扰；视黄醇结合蛋白-1；慢病毒[Abstract] Objective：To construct a lentiviral vector of RNA interference（RNAi） of rat cellular retinol-binding protein I (CRBP-I) gene. Methods：The effective sequence of siRNA targeting CRBP-I gene was confirmed in our previous study. The complementary DNA containing both sense and antisense Oligo DNA of the targeting sequence was designed，synthesized and cloned into the pGCL-GFP vector，to construct a lentiviral vector which expressed short hairpin RNA(shRNA)， and it was identified by PCR and DNA sequencing. Results：PCR identification and DNA sequencing demonstrated that insertion of oligonucleotide of the lentivirus RNAi vector containing CRBP-I shRNA was right.Conclusion：The lentivirus RNAi vector of rat CRBP-I was constructed successfully.[Key words] RNA interference；Cellular retinol-binding protein I；Lentivirus肝星状细胞（hepatic stellate cells， HSC）的激活过程是肝脏胶原产生和肝纤维化形成的中心环节[1]，在肝纤维化逆转过程中也起重要作用，2002年Uchio K[2]在用CCl4制备大鼠肝纤维化模型中发现，活化第5天的HSC中CRBP-1表达明显增加，而视黄醇脂滴消失，提示CRBP-1与肌成纤维样细胞的形成密切相关。

USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定目的构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。

方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列，序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和XhoⅠ。

寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链，5′端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。

连接产物经转化、培养，提取其质粒，提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定，鉴定正确的质粒进行测序。

构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA與包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。

通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况，对病毒滴度和感染效率进行检测。

结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。

与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×107 TU/ml。

结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。

标签：USP22；慢病毒载体；构建；鉴定肿瘤细胞中基因表达具有组织特异性，USP22泛素水解酶属去泛素化酶DUB基因家族成员，其普遍表达表明其功能的保守性，因此，USP22被归类为肿瘤干细胞的标记基因而引起高度关注[1]。

国内外学者研究发现，USP22基因过表达与结直肠癌[2]、肺癌[3]、胃癌[4]、食管癌[5]、乳腺癌[6]等恶性肿瘤的浸润、转移和预后差高度相关。

沉默USP22基因表达，能显著抑制膀胱癌[7]、结直肠癌[8]细胞增殖，由此推测USP22基因可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。

本研究通过基因工程技术构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在人鼻咽癌细胞中的作用机制提供实验基础。

1 材料与方法1.1 实验材料、试剂及仪器pLL3.7慢病毒表达载体及包装载体质粒购自广州永诺生物科技有限公司。

［文章编号］　１６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０１－００１１－０４［收稿日期］　２０１１－１０－０７［基金项目］　国家自然科学基金资助课题（３０８７１３９０，３０６７２３３１，３０８００４１５）［作者简介］　代　炜（１９７８－），男，辽宁省葫芦岛市人，主治医师，医学博士，主要从事肿瘤信号转导通路的研究。

［通信作者］　孙长伏（Ｔｅｌ：０２４－２２８９１０２６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈａｎｇｆｕｓｕｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ）ＰＡＫ４基因ＲＮＡｉ慢病毒载体的构建与鉴定代　炜１，张红艳２，李彦姝２，李　妍２，孙长伏１（１．中国医科大学口腔医学院口腔颌面外科口腔颌面－头颈肿瘤外科，辽宁沈阳１１０００２；２．中国医科大学细胞生物学教研室细胞生物学卫生部重点实验室，辽宁沈阳１１０００１）［摘　要］　目的：构建ＰＡＫ４基因ＲＮＡｉ慢病毒载体，并对其在涎腺腺样囊性癌细胞株ＳＡＣＣ－８３细胞中干扰效率进行鉴定。

方法：针对ＰＡＫ４基因ＲＮＡｉ有效靶序列，合成Ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡ，退火形成双链ＤＮＡ，与经ＡｇｅⅠ和ＥｃｏＲⅠ酶切后的ｐＧＣｓｉｌ－ＧＦＰ载体连接产生ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ慢病毒载体，ＰＣＲ筛选阳性克隆，测序鉴定。

用ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ载体、ｐＨｅｌｐｅｒ１．０载体和ｐＨｅｌｐｅｒ　２．０质粒共转染包装细胞２９３Ｔ细胞，包装产生慢病毒，以２９３Ｔ细胞绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）的表达水平测定病毒滴度。

结果：ＰＣＲ扩增出插入片段，测序证实成功构建了ＰＡＫ４－ｓｈＲＮＡ慢病毒载体ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ。

包装并浓缩慢病毒，滴度为２Ｅ＋９ＴＵ·ｍＬ－１。

将病毒感染ＳＡＣＣ－８３细胞，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测ＰＡＫ４的ｍＲＮＡ表达下调７０％以上。

结论：成功构建了ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ病毒载体并建立了ＳＡＣＣ－８３－ｓｈＰＡＫ４ｉ细胞模型，为ＰＡＫ４在肿瘤信号转导通路中的研究提供工作基础。

［关键词］　ＲＮＡ干扰；ＰＡＫ４基因；质粒构建；慢病毒；癌，腺样囊性［中图分类号］　Ｒ７３９．８７ ［文献标志码］　ＡＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ＰＡＫ４ｇｅｎｅＤＡＩ　Ｗｅｉ　１，ＺＨＡＮＧ　Ｈｏｎｇ－ｙａｎ２，ＬＩ　Ｙａｎ－ｓｈｕ２，ＬＩ　Ｙａｎ２，ＳＵＮ　Ｃｈａｎｇ－ｆｕ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｒａｌ　Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｒｏｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ－Ｈｅａｄ　ａｎｄ　Ｎｅｃｋ　Ｔｕｍｏｒ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）ｏｆ　ＰＡＫ４ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ＰＡＫ４ｓｈＲＮＡ　ｉｎ　ＳＡＣＣ－８３ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡ　ｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｓｉＲＮＡ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＰＡＫ４ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅｐＧＣＳＩＬ－ＧＦＰ　ｖｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＰＡＫ４ｉｓｈＲＮＡ　ｗａｓ　ｎａｍｅｄ　ａｓ　ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ，ａｎｄ　ｉｔｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ　ＨＥＫ－２９３Ｔｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ　ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ，ｐＨｅｌｐｅｒ１．０ａｎｄ　ｐＨｅｌｐｅｒ２．０．Ａｌｌ　ｖｉｒｕｓ　ｓｔｏｃｋｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒｏｆ　ｖｉｒｕｓ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＧＦＰ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔｔｈｅ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ　ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ　ｏｆ　ＰＡＫ４ｓｈＲＮＡ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓｗａｓ　２Ｅ＋９ＴＵ·ｍＬ－１．Ｔｈｅ　ＳＡＣＣ－８３ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｗａｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＰＡＫ４ｇｅｎｅｗａｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ａｂｏｕｔ　７０％ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ　ｉｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ａｎｄ　ＳＡＣＣ－８３－ｓｈＰＡＫ４ｉｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｃｅｌｌ　ｍｏｄｅｌ　ｉｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｉｔ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ＰＡＫ４ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＰＡＫ４ｇｅｎｅ；ｐｌａｓｍｉｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ；ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ；ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ａｄｅｎｏｉｄ　ｃｙｓｔｉｃ１１第３８卷　第１期２０１２年１月吉　林　大　学　学　报　（医　学　版）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．１　Ｊａｎ．２０１２ Ｐ２１活化激酶（Ｐ２１－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｋｉｎａｓｅ，ＰＡＫ）为一类保守的丝氨酸／苏氨酸激酶，是Ｃｄｃ　４２和Ｒａｃ１下游重要的效应器。

人SNCG基因shRNA慢病毒载体质粒的构建及鉴定李文怡;范余娟;徐红;范江涛;孙丹【摘要】Objective To construct short hairpin RNA (shRNA)lentiviral vector plasmid of human SNCG gene and to detect the changes of SNCG mRNA and protein expression in human endometrial carcinoma cells HEC-1-A and Ishikawa after transfection.Methods Three SNCG gene specific shRNA sequences were designed,which were SNCG-KD1,SNCG-KD2 and SNCG-KD3,ing Lipofectamine 2000 to construct a lentiviral vector plasmid in 293T cells.Hu-man endometrial carcinoma HEC-1-A and Ishikawa cells were transfected with SNCG-KD1,SNCG-KD2 and SNCG-KD3 lentiviral vector ing real-time PCR to detect the expression of SNCG mRNA,and Western blotting to detect SNCG protein expression.Results Age I and EcoR I were used to connect the three groups of positive transformation.The specific bands were in agreement with the predicted results by 1% agarose gel electrophoresis.The results of the analysis and identification of Lite Chromas (VERSION 2.01)gene sequencing were in agreement with GeneBank database align-ment,which showed that the synthesis of three pairs of shRNA Oligo DNA SNCG sequences SNCG-KD1,SNCG-KD2 and SNCG-KD3 inserted correctly.After the three lentiviral vectors were transfected into HEC-1-A and Ishikawa cells,the ex-pression of SNCG mRNA and protein in HEC-1-A and Ishikawa cells was significantly decreased (P <0.05).Conclusion Three shRNA SNCG lentiviral vector plasmids are successfully constructed and transfected intoHEC-1-A and Ishikawa cells,which may effectively knock down the SNCG gene and inhibit the expression of SNCG mRNA and protein in HEC-1-A and Ishikawa cells.%目的：构建人SNCG基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体质粒，并观察用其转染后人子宫内膜癌HEC-1-A 和 Ishikawa 细胞 SNCG mRNA 和蛋白的表达变化。

动物医学进展,2021 ,2(1)69-74ProgressinVeterinary Medicine靶向SynDIG1的shRNA 慢病毒载体的构建及功能鉴定李亚琳，史秀超，权美平(渭南师范学院环境与生命科学学院,陕西渭南714099)摘 要：为了构建靶向突触分化诱导基因1(SynDIG1 )的shRNA 慢病毒表达载体，设计出SynDIG1的 siRNA 的靶点序列,并合成含干扰序列的双链DNA 发卡结构shRNA,合成的Oligo 经过退火分别与双酶切处理后的pLKO. 1-GFP 载体连接。

将构建的重组质粒pLKO. 1-GFP-SynDIG1 shRNA 转化到DH5a 感受态细菌中，过夜培养后挑选阳性克隆子，扩增后提取DNA 进行质粒测序，得到两个序列正确的重组质粒。

用这些重组质粒转染HEK293T 细胞以及大鼠海马神经元细胞，蛋白免疫印迹及细胞免疫荧光检测SynDIG1 shRNA 对外 源性和内源性SynDIG1表达的敲减作用。

进一步用重组质粒转染HEK293T 细胞产生慢病毒颗粒，用病毒颗粒 感染DIV2和DIV14的神经细胞,免疫印迹检测SynDIG1的表达。

结果表明这两个重组质粒均能够有效地抑制外源性和内源性SynDIG1的表达，对HEK293T 中瞬时表达的SynDIG1敲减率达到75%，其慢病毒颗粒感染对早期神经细胞中内源性SynDIG1的表达抑制也很明显。

用pLKO. 1-GFP 成功构建了能够有效抑制外源性 和内源性SynDIG1表达的重组质粒，为探讨RNA 干扰技术抑制神经细胞SynDIG1基因表达的相关研究奠定基础，为研究SynDIG1基因在神经传导和突触发育及其可塑性调节中的作用提供了有力工具。

关键词：SynDIG1 ；慢病毒；shRNA ；基因敲减技术中图分类号:S852. 615；Q789突触分化诱导基因(synapse differentiation in ­duced gene1,SynDIG1)是一种高度保守的跨膜蛋 白，在中枢神经系统的兴奋性突触传递和突触可塑性调节中起着重要的作用［1］。

人类microRNA—1246慢病毒抑制载体的构建以及鉴定目的构建microRNA-1246慢病毒抑制载。

方法针对microRNA-1246成熟体的反义核苷酸片段，应用基因重组技术将目的基因片段克隆到GV280慢病毒载体中，通过酶切、PCR、DNA测序验证重组克隆的成功构建，将GV280-mir-1246down、Helper1.0、Helper2.0共转染293T细胞获得重组慢病毒，浓缩提纯病毒液并检测病毒滴度，用病毒液感染siha细胞，通过检测绿色荧光蛋白（GFP）验证GV280-mir-1246down在siha细胞的表达情况，用嘌呤霉素筛选GV280-mir-1246down稳转细胞株。

用细胞计数的方法检测细胞的生长率。

结果①对菌落进行PCR鉴定筛选出构建正确的慢病毒载体，DNA测序证实插入的基因序列正确；②GV280-mir-1246down、Helper1.0、Helper2.0共转染293T细胞产生重组慢病毒；③目的mir-246down被慢病毒成功导入siha细胞中，同时达到稳定表达，转到率几乎达100%，荧光显微镜下能直接观察到GFP；④细胞计数结果显示在siha细胞中microRNA-1246的下调细胞的生长速度减弱。

结论成功构建microRNA-1246慢病毒抑制载体，建立siha细胞mir-1246-down的稳转株，microRNA-1246在siha细胞中下调的siha细胞的增殖能力下降.这为研究microRNA-1246在宫颈鳞癌siha细胞的作用及其机制提供了可靠的基础。

Abstract：Objective To construct and identify a lentiviral vector for microRNA-1246 inhibiton.Methods The gene sequences of microRNA-1246 Antisenseolignuclleotides were chosen，the antisense sequences of microRNA-1246 were designed and linked into linearized GV280 vector. The recombinants were screened and identified by colony PCR and DNA sequencing，The GV280-mir-246down，Helper1.0、Helper2.0 were mixed in suitable proportion and then transfected into the cell of 293T to get recombinant lentiviral vector.The concentrated and purified of virus bulk were detected the drops of it，indeed the virus was used to infect the carcinoma cell of Cervical squamous of siha .The GV280-mir-1246down，s expression in the siha cell tested by testing the GFP.Results ①The corrected of recombination lentiviral vector was screened from the bacterial which was anthenticated by PCR，DNA testing proved that the inserted gene sequence was correct . ②The cells of 293T which was transfected GV280-mir-1246down、Helper1、0 and Helper2.0 produced recombinant lentiviral vector.③The target gene sequences were successfully inserted into siha cell by GV280 lentiviral vector ，the recombinant lentiviruses which carring mir-246down could infect and deliver mir-246down and GFP genes to siha cells. The infection efficiency was almost 100%. Conclusion The lentiviral microRNA inhibitor vector has been successfully constructed，which provides a stable tool for further study of therole of microRNA-1246 on cervical cancer.Key words：Lentiviral vector；MicroRNA；Inhibiton vector；Cervical cancer；Cell proliferationMiRNA是一类由20-23个碱基组成的非编码单链RNA，MiRNA 与靶基因mRNA的非翻译区域的碱基互补配对，MiRNA与靶基因mRNA结合形成沉默复合体使mRNA降解，从而阻碍mRNA的翻译[1]。

Smad4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定季国忠;张发明;翟惠虹;范志宁;樊代明;王学浩【期刊名称】《第四军医大学学报》【年(卷),期】2006(27)7【摘要】目的:构建Smad4基因RNAi慢病毒载体. 方法:针对已经筛选确定的Smad4基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Mlu I和Cla I酶切后的pLVTHM载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shSmad4慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定. 用LV-shSmad4,pCMV-dR8.74和pMD2G 3质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度. 结果:PCR和测序证实,成功构建Smad4 shRNA的慢病毒载体LV-shSmad4. 包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为5×1010 pfu/L. 结论:成功构建人Smad4基因RNAi慢病毒载体.【总页数】3页(P600-602)【作者】季国忠;张发明;翟惠虹;范志宁;樊代明;王学浩【作者单位】南京医科大学第二附属医院消化科,江苏,南京,210011;南京医科大学第二附属医院消化科,江苏,南京,210011;第四军医大学西京医院消化研究所,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院消化研究所,陕西,西安,710033;南京医科大学第二附属医院消化科,江苏,南京,210011;第四军医大学西京医院消化研究所,陕西,西安,710033;南京医科大学第一附属医院肝胆外科,江苏,南京,210029【正文语种】中文【中图分类】R394【相关文献】1.增殖抑制基因（HSG）RNAi 慢病毒载体的构建与鉴定 [J], 楼煜清;李榕;刘洁琳;张岩巍;刘雅;王佐广;温绍君;韩宝惠2.PC4基因RNAi慢病毒载体的构建及有效靶序列鉴定 [J], 张真中;杨春杰;钱三立;李冰玉;邹云增3.人PETA-3／CD151基因RNAi慢病毒载体的构建及沉默效应鉴定 [J], 王绍清;王俊平;徐凤琳;艾中伟;刘婷4.靶向人CD106基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定 [J], 孙乐刚;于婷婷;刘玲;李朝晖;付洪海;王丽芳5.GTP结合蛋白4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定 [J], 刘勋;陈明;杨志惠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

慢病毒包装原理介绍慢病毒包装系统简介及应用、慢病毒包装简介及其用途慢病毒(Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。

由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。

采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。

在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶川启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶川有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A 尾。

当RNA聚合酶川遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3'端形成1~4个U。

U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶川依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达?21ntRNA和?50ntRNA茎环结构(stem loop )。

在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA ;也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶川启动子和4?5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。

人notch1-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定张燕;张明芳;林玲;郑志竑【期刊名称】《福建医科大学学报》【年(卷),期】2009(43)3【摘要】目的构建人notch1-shRNA慢病毒表达载体,为Notch信号通路的相关研究奠定基础.方法根据人notch1基因mRNA序列设计并合成两条互补的DNA 单链寡核苷酸,将退火后形成的双链连接于pENTR/U6质粒,通过与pLenti6/BLOCK-iT-DEST载体的LR重组,构建notch1-shRNA慢病毒表达载体,经脂质体介导入293FT细胞,包装成慢病毒.用该慢病毒感染人神经母细胞瘤系SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western blot法检测细胞notch1基因的表达.结果目的序列成功连接于载体并包装成较高滴度的慢病毒,细胞mRNA和蛋白质的检测均表明构建的notch1-shRNA慢病毒表达载体LR-ND-A能显著抑制SH-SY5Y细胞notch1基因的表达.结论成功构建人notch1-shRNA慢病毒表达载体.【总页数】6页(P211-216)【作者】张燕;张明芳;林玲;郑志竑【作者单位】福建医科大学,基础医学院生物化学与分子生物学系、分子医学研究中心,福州350004;福建医科大学,基础医学院生物化学与分子生物学系、分子医学研究中心,福州350004;福建医科大学,基础医学院生物化学与分子生物学系、分子医学研究中心,福州350004;福建医科大学,基础医学院生物化学与分子生物学系、分子医学研究中心,福州350004【正文语种】中文【中图分类】R394.2;R394.11;R373.9【相关文献】1.人肝再生增强因子基因慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 薛峰;王伯庆;尹继炜;易超2.人转铁蛋白受体基因慢病毒表达载体的构建和鉴定 [J], 杨志军;郭永坤;张业森;戴宜武;姚学勤;徐如祥3.含人干细胞白血病基因的重组慢病毒表达载体的构建及鉴定 [J], 于建超;王江平;李应龙;钱彪;倪钊;王新敏;李强;王文晓;王勤章4.构建及鉴定人生存素基因的慢病毒表达载体 [J], 赵亮;张国庆;马学晓;杨堃;胡有谷;陈伯华5.构建及鉴定人生存素基因的慢病毒表达载体 [J], 赵亮;张国庆;马学晓;杨堃;胡有谷;陈伯华;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。