三七总皂甙对新生鼠窒息致脑损伤时细胞凋亡及HO-1表达的影响

祝大丽等三七总皂甙对新生鼠窒息致脑损伤时细胞凋亡及ＨＯ一１表达的影响第１３期　

三七总皂甙对新生鼠窒息致脑损伤时细胞凋亡及ＨＯ一１表达的影响①　

祝大丽何平②　朱萍李秀云　王雪　王瑞娇　

昆明医科大学第二附属医院儿科（云南昆明）　６５０１０１　

中国图书分类号Ｒ３３２　文献标识码Ａ　文章编号１００１．４４１１（２０１５）１３－２０８３－０４；ｄｏｉ：１０．７６２０／ｚｇｆｙｂ￣Ｊ．ｉｓｓｎ－１００１—４４ｌ１．２０１５．１３．４２　【摘要】　目的：探讨三七总皂甙（ＴＰＮＳ）对新生鼠窒息致脑损伤时脑细胞凋亡率及血红素氧合酶一１（ＨＯ－１）表达的　

影响。方法：取７日龄新生ｓＤ大鼠８８只，随机分为对照组（Ｉ组）、常压窒息模型＋生理盐水组（Ⅱ组）和常压窒息模型＋　ＴＰＮＳ干预组（Ⅲ组），对照组８只，余每组４Ｏ只。将新生鼠分别放入５５　ｍｌ的磨口瓶中（瓶中装５ｇ钠石灰），待新生鼠安静后，　

Ⅱ组及Ⅲ组紧塞瓶盖０．５　ｈ，取出后复氧２　ｈ，窒息后Ⅲ组立即腹腔注射ＴＰＮＳ　１００　ｍｇ・ｋｇ～、ＩＩ组腹腔注射相同容积生理盐水，　

以后每隔１２　ｈ腹腔注射１次，注射后放回母鼠身边继续喂养，分别在窒息后６　ｈ、２４　ｈ、４８　ｈ、７２　ｈ和７天处死；Ｉ组放入５５　ＩＩｌｌ　

磨口瓶中０．５　ｈ，不盖瓶盖，取出后复氧２　ｈ，放回母鼠身边继续喂养，６　ｈ后全部处死。用ＴＵＮＥＬ法测定脑细胞凋亡率，行免　疫组化检测ＨＯ一１。结果：①Ⅱ组和Ⅲ组细胞凋亡率高于对照组（Ｐ＜Ｏ．０５），在４８　ｈ达高峰。②Ⅲ组（除６　ｈ组外）细胞凋亡率　

表达水平明显低于Ⅱ组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。③ＩＩ组及Ⅲ组ＨＯ一１高于对照组（Ｐ＜０．０５），在２４　ｈ达高峰。④Ⅲ组　

ＨＯ一１的表达高于Ⅱ组（Ｐ＜０．０５）。结论：ＴＰＮＳ可降低新生鼠窒息致脑损伤时脑细胞凋亡率的表达（Ｐ≤０．０１），增加ＨＯ－１蛋　

白的表达，对窒息导致的新生鼠缺氧缺血性脑损伤具有明显保护作用。　【关键词】　新生鼠窒息三七总皂甙细胞凋亡率血红素氧合酶一１　

Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　ｓａｐｏｎｉｎ　ｏｎ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ＨＯ－１　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　

ｒａｔｓ　ｗｉｔｈ　ｂｒａｉｎ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａｓｐｈｙｘｉａ　

ＺＨＵ　Ｄａ一　，ＨＥ　，ＺＨＵ　Ｐ　ｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＰｅｄｉａｔｒｉｃｓ，ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＫｕｎｍｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　

Ｕｎｉｖｅｍｉｔｙ。Ｋｕｎｍｉｎｇ　６５０１０１。Ｙｕｎｎａｎ。Ｃｈｉｎａ　

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　ｓａｐｏｎｉｎ（ＴＰＮＳ）ｏｎ　ｂｒａｉｎ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｈｅｍｅ　ｏｘｙ－　

ｇｅｎａｓｅ－１（ＨＯ－１）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈ　ｂｒａｉｎ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａｓｐｈｙｘｉａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｅｉｇｈｔｙ－ｅｉｇｈｔ　７一ｄａｙ一０ｌｄ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ＳＤ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅ－　

ｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐ　Ｉ，８　ｒａｔｓ），ｏｒｄｉｎａｒｙ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ａｓｐｈｙｘｉａ　ｍｏｄｅｌ＋ｓａｌｉｎｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐⅡ，４Ｏ　ｒａｔｓ），ａｎｄ　ｏｒｄｉｎａｒｙ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ａｓｐｈｙｘｉａ　ｍｏｄｅｌ＋ＴＰＮＳ　ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐⅢ，４０　ｒａｔｓ）．Ｔｈｅ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｐｕｔ　ｎｔｏ　ｂｏｔｔｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｇｒｏｕｎｄ　ｓｔｏｐｐｅｒ（５５　ｍｌ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　５　ｇ　ｓｏｄａ　ｌｉｍｅ），ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｑｕｉｅｔ，ｔｈｅ　ｃａｐｓ　ｏｆ　ｂｏｔｔｌｅｓ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　１１　ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　１１Ｉ￣，ｅｒｅ　ｐｌｕｇｇｅｄ　ｆｏｒ　

ｈａｌｆ　ａｎ　ｈｏｕｒ，ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅ－ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｗｏ　ｈｏｕｒｓ，ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐⅢｗｅｒｅ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｎｔｒａｐ－　

ｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＰＮＳ（１００　ｍｇ・ｋｇ　），ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｉ１　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｏｒｍａｌ　ｓａｌｉｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓａｎｌｅ　ｖｏｌ－　

ｕｍｅ，ｔｈｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ｅｖｅｒｙ　１２　ｈｏｕｒｓ，ａｆｔｅｒ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｐｕｔ　ｂａｃｋ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｍａｔｅｒｎａｌ　ｒａｔｓ，ｔｈｅｎ　ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｐｕｔ　ｔｏ　ｄｅａｔｈ　ａｔ　６，２４，４８，７２　ｈｏｕｒｓ　ａｎｄ　７　ｄａｙｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　１　ｗｅｒｅ　ｐｕｔ　ｉｎｔｏ　ｂｏｔｔｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｇｒｏｕｎｄ　ｓｔｏｐｐｅｒ（５５　ｍ１）ｆｏｒ　ｈａｌｆ　ａｎ　

ｈｏｕｒ，ｔｈｅｎ　ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅ－ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｗｏ　ｈｏｕｒｓ　ａｎｄ　ｐｕｔ　ｂａｃｋ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｍａｔｅｒｎａｌ　ｒａｔｓ，ａｆｔｅｒ　ｓｉｘ　ｈｏｕｒｓ，ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｐｕｔ　ｔｏ　ｄｅａｔｈ．　ＴＵＮＥＬ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｒａｔｅ，ＨＯ－１　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　ＩＩ　ａｎｄ　ｇｒｏｕｐⅢｗｅｒｅ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｉ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｃｈ　ｐｅａｋｅｄ　ａｔ　４８　ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅ　

ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐⅢ（ｅｘｃｅｐｔ　ａｔ　６　ｈｏｕｒｓ）ｗａｓ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐⅡ（Ｐ＜０．０５）．ＨＯ－１　ｅｘｐｒｅｓ－　

ｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　ＩＩ　ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　１１１　ｗｅｒｅ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｉ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｃｈ　ｐｅａｋｅｄ　ａｔ　２４　ｈｏｕｒｓ．　

ＨＯ－Ｉ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　１１１　ｗａｓ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　ＩＩ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴＰＮＳ　ｃａｎ　ｒｅｄｕｃｅ　

ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｂｒａｉｎ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＯ－１　ｉｎ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈ　ｂｒａｉｎ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａｓｐｈｙｘｉａ，ｗｈｉｃｈ　ｈａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉ—　ｃａｎｔ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｉｎ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈ　ｈｙｐｏｘｉｃ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｂｒａｉｎ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａｓｐｈｙｘｉａ．　

［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　Ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔ；Ａｓｐｈｙｘｉａ；Ｔｏｔａｌ　ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　ｓａｐｏｎｉｎ；Ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｒａｔｅ；Ｈｅｍｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１　

新生儿窒息的本质是缺氧…，窒息缺氧对机体　

可造成全身多脏器损害，其中脑对缺氧最敏感，缺氧　

主要引起脑水肿及神经元的坏死。本研究通过建立新　

生ＳＤ大鼠常压窒息模型观察三七总皂甙（ＴＰＮＳ）　

对新生鼠窒息致脑损伤时脑细胞凋亡率及血红素氧合　

①云南省科技厅面上基金资助项目［２０１０ＺＣ１２８］　②通讯作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｋｅｄｅｎｇ１９９０＠１６３．ｃｏｒｎ　酶一１（ＨＯ一１）的影响。　

１材料与方法　

１．１材料７日龄体重１２～１５　ｇ健康ｓＤ大鼠８８只　

（雌雄不拘），由昆明医科大学实验动物中心提供。　

ＴＰＮＳ由昆明中药厂生产。原位末端标记（ＴＵＮＥＬ）　

检测试剂盒购自南京凯基生物科技公司，ＨＯ一１试剂　

盒购自武汉博士德生物公司。　１．２方法　

１．２．１分组将新生７日龄ｓＤ鼠８８只分为：①Ｉ　

组（对照组，８只）；②Ｉ１组（窒息＋ＮＳ组，４０只），　

包括窒息后６　ｈ、２４　ｈ、４８　ｈ、７２　ｈ和７天（即ＩＩ　１、　

Ⅱ２、Ⅱ３、Ⅱ４、Ⅱ５组）；③ｍ组（窒息＋ＴＰＮＳ组，　

４０只），包括窒息后６　ｈ、２４　ｈ、４８　ｈ、７２　ｈ和７天　

（即ｍ１、ｍ２、Ⅲ３、Ⅲ４、ＨＩ５组）。　

１．２．２模型制备将ＳＤ鼠放入５５　ｎ　ｌ的磨口瓶中　

（瓶内放５　ｋｇ钠石灰），等动物安静后塞紧瓶盖，密　

闭３０　ｍｉｎ，取出后立即复氧２　ｈ。Ⅲ组窒息后即刻腹　

腔注射ＴＰＮＳ　１００　ｍｇ・ｋｇ～，Ｕ组腹腔注射相同容积　

的生理盐水，以后每隔１２　ｈ重复腹腔注射一次，注　

射后放回母鼠身边继续喂，分别于窒息后６　ｈ、２４　ｈ、　

４８　ｈ、７２　ｈ和７天处死小鼠。Ｉ组放入５５　ｍｌ磨口瓶　

中０．５　ｈ，不盖瓶盖，取出后复氧２　ｈ，放回母鼠身边　

继续喂养，６　ｈ后全部处死。小鼠处死后快速剥离脑　

组织，用冰生理盐水冲洗后浸入４％多聚甲醛中固定　

１２～４８　ｈ，做石蜡包埋切片，行ＴＵＮＥＬ法测定脑细　

胞凋亡率，用免疫组化检测ＨＯ一１。　

１．２．３结果判断每张切片随机取５个视野，经４００　

倍目镜计数阳性细胞数（细胞核呈现棕黄色为阳性细　

胞），切片边缘视野不计，以排除“边缘效应”的干扰。　

阳性指数以阳性细胞占所有细胞的百分率（％）表示。　

１，３统计学方法　采用ＳＰＳＳ　１７．０统计软件进行统　

计学处理，结果用（Ｅ￣ｓ）表示，组内比较采用　检　

验，组问两两比较采用配对样本ｔ检验，以Ｐ＜０．０５　

为差异有统计学意义。　

２结果　

２．１卡方检验显示　①Ⅱ组各时间点细胞凋亡率表　

达水平不同，差异有统计学意义（　＝５５．３０５，Ｐ＜　

０．００１），见表１。②Ⅲ组各时间点细胞凋亡率表达水　中国妇幼保健２０１５年第３Ｏ卷　

平不同，差异有统计学意义（　＝６７．１８７，Ｐ＜　

０．００１），见表２。③１Ｉ组各时间点ＨＯ一１蛋白的表达　

不同，有统计学差异（　＝１８．７１７，Ｐ＜０．０１），见表