使用Real-Time PCR粪便中检测艰难梭状芽孢杆菌
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中国卫生检验杂志２（Ｘ）８年４月第１８卷第４期ＣｈｉｎｅｓｊｏｕｒｎａｌｏｆＨｅ砍ｈＬ公洲ｌｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＰｒＺ佣８；Ｖｏｌｌ８Ｎｏ４６５３【微生物检测方法］使用Ｒｅａｌ一Ｔｉｍ。ＰｃＲ粪便中检测艰难梭状芽抱杆菌
史跃杰，杨玉林，王海颖（河南省中医院检验科，郑州４５侧Ｘ〕２）［摘要」目的：探讨Ｒｅａｌ一ＴｉｍｅＰｃＲ对粪便检测艰难梭菌的可行性。方法：以组织培养细胞毒素试验为标准，参考艰难梭菌的毒素刀Ｂ基因相应的引物和分子信标探针，对标准菌株和粪便提取的ＤＮＡ实行Ｒｅａｌ一ＴｉｍｅＰＣＲ扩增。结果：Ｒｅａｌ一ＴｉｍｅＰＣＲ的敏感度为％．９％；特异性为１０％；阳性预测值为１０％；阴性预测值为９８．３％。结论：Ｒｅａｌ一ＴｉｍｅＰＣＲ与传统诊断方法相比具有快速、敏感、特异等优点，可以提高艰难梭菌的检测水平。［关键词］Ｒｅａｌ一ＴｉｍｅｐＣＲ；艰难梭状芽抱杆菌；ｔｃｄ＾；ｔｃｄＢ【中图分类号］伪３一３３［文献标识码」Ａ［文章编号」１仪碎一８６８５（２ｏｏ８）０４一０６５３￣０２
ＤｅｔｅｃｔｉｎｇＣｔｏｓｔｒｉ过ｉｕｍｄ功介ｉｌｅｉｎｆｅｃｅｓｂｙｒｅａｌ一ｔｉｍｅＰＣＲｓｈｉｌ乞￡神，Ｙａｎｇｙｕ一ｌｉｎ，肠ｎｇＢｄｉ一户ｎｇ（Ｄｅｐａｒｔｎｌｅｎｔｏｆ肠ｂｏｒａｔ衅Ｔｅｓｔ，Ｈｅｎａｎｌ，ｒｏｖｉｎｃｉａｌＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＨｏｓｐｉ山，Ｚｈｅｎ部ｈｏｕ４５（Ｘ刃２，Ｃｈｉｎａ）
［Ａ咏ｒａＣｔ］ｏｂｊ．ｄｉｖｅ：ＴＯｓｔｕ街ｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣ肠，ｔｒ记范ｕｍｄ必锐ｉｌｅｉｎｆｅｃｅｓ场Ｒｅａｌ一ＴｉｍｅＰＣＩＬＭｅｔｈｏｄｓ：Ａｃ－ｃｏ司ｉｎｇｔｏｔｈｅＰｒｉｍｅｒｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎＰｒｏ阮ｓｏｆｔｈｅｔｏｘｉｎＡａｎｄｔｏｘｉｎＢＯｆＣｌｏ‘ｔｒｉ汉ｉｕｏｄ刃云〕ｉｌｅ，ｔｈｅｎａｍｐｌｉｆｉｅｄｔｈｅＤＮＡｏｆｓｔａｎｄａｒｄＣ肠３ｔ司ｉｕｎｚｄ（养ｉｌｅａｎｄｆｅｃｅｓ场ｒｅａｌ一ｔｉｍｅＰＣＩＬＲｅｓｕｌｔｓ犷ｆ卜ｅｓｅ、ｉｔｉｖｉｌｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｒｅａｌ一ｔｉｍｅＰＣＲｗｅｒｅ９６．９％ａｎｄｌ（Ｘ）％．ＴｈｅｌＪＯｓｉｔｉｖｅｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｖａｌｕｅａｎｄｔｈｅｎｅ邵ｌｉｖｅｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｖａｌｕｅｗｅｒｅｌ（Ｘ）％ａｎｄ９８．３％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｒｅａｌ一ｔｉｍｅＰＣＲｃａｎｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＣ肠ｓｔｒ记１咖ｄ必锐ｉｌｅｉｎｆｅｃｅｓｆｏｒｉｔｓｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｃｃ币ｃｉｔｙａｎｄｅｆｉｃｉｅｎ叮・［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｒｅａｌ一ＴｉｍｅＰＣＲ；Ｃ肠３ｔ蒯１ｏｄ功反了ｉｌｅ；ｔｅｄＡ；ｔｃｄＢ
许多严重腹泻患者常常找不出病因，部分原因是忽视了艰难梭状芽抱杆菌（Ｃｌｅｓｔｒｉ汉ｉｕｌｎｄ必安山，以下称艰难梭菌）的检测。艰难梭菌，严格的肠道厌氧菌，是造成医院性腹泻、抗生素相关性腹泻、结肠和伪膜性肠炎主要的致病因素，与其产生的毒性产物Ａ、Ｂ毒素有关［’，ｚ］。此类菌近年来在欧美蔓延较快，已经引起当地人们重视，在我国尚未大面积流行，但应引起我们的关注。 检测艰难梭菌方法一般有：厌氧培养法、酶免疫法、传统ＰＣＲ、组织培养细胞毒素试验。厌氧培养法除需昂贵的厌氧培养设备外，接种要求也比较苛刻，难于普及开展；酶免疫法虽然方便快速，但缺乏灵敏度，阳性检出率较低ｔ’．’Ｊ；传统ＰｃＲ扩增完成后，需要对产物进行电泳、显影等一些繁琐步骤；组织培养细胞毒素试验虽然被认为是从粪便中检测艰难梭菌的金标准［５，６］，但至少需耗时２４一４８ｈ的培养期，并且只能测毒素Ｂ。所以很有必要寻找一个简单、快速、特异、全面的实验方法对艰难梭菌感染进行早期诊断，我们参考国外相关文献采用Ｒｅａｌ一ｔｉｍｅＰＣＲ的方法直接从粪便标本中快速检测所有产毒素（Ａ、Ｂ）艰难梭菌的实验研究，现报道如下。９１份粪便标本来源于住院腹泻患者，所有标本在收到后至检测前都贮存于４℃。１．２方法１．２．１传统体外细胞毒素试验用菌液或粪便滤液做毒素Ｂ体外细胞毒素试验（Ｂｉｏｗｈｉｔａｋｅｒ，美国）发现星样聚集状特征的细胞证明有艰难梭菌的存在。试验的特异性被抗毒素中和试验（Ｔｅｃｌｉｌａｂ，Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ，ＶＡ美国）来验证。１．２．ＺＤＮＡ提取（１）用ＱＩＡａｍｐＤＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ）试剂盒来提取标准菌株的基因组ＤＮＡ（参考厂家说明书）。（２）用同样的方法对７５川水样便标本或同体积未成形便的悬浮液提取ＤＮＡ。１．２．３引物及分子信标探针由Ｔｈｅｒｍｏ公司合成［７］见表１。
表１本实验所用的引物和荧光分子信标探针引物或探针靶基因寡核普酸序列口刁，）①扩增子大，］、（师）引物
１材料与方法１．１菌株来源 １４例标准菌株来源于美国标准菌库（ＡＴＣＣ）。粪便标本：
〔作者简介」史跃杰（１９７１一），男，本科，主管技师，主要从事微 生物检验研究。
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万方数据６５４中国卫生检验杂志２０８年４月第１８卷第４期Ｃｈｉｎ，Ｊｏｕｍ滋ｏｆＨｅａｌｔｈｌａｌｘｊｒａｔｏｒｙＴｅＣｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＰｒＺｏｏｓ；ｖｏｌｌ８Ｎｏ４１．２．４ＰｃＲ多重扩增［７］引物Ａ（从ｔｃｄＡ４４２到ｔｃｄＡ５７９）０．７林Ｍ，引物Ｂ（从ｔｃｄＢＺ“７到ｔｃｄＢ２７４６）０．４５卜Ｍ，分子信标探针浓度各０．３林Ｍ，ｓｍＭＭ邵１：，１２．２５此牛血清白蛋白，０．ＺｍＭ四种中的每一种ｄＮＴＰ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），５０ｍＭＴｒｉｓ一ＨＣＩ，１６ｍＭ（ＮＨ；）２５０４，２．ＳＵ幻ｅｎＴ明（ＡｂＰｅｎｔｉｄｅｓ，Ｉｎｃ．）和Ｔａｑｓｌａｒｔ抗体（ａｏｎｔｅｃｈ）结合，模板是２闪
标准菌纯化基因组ＤＮＡ或从粪便中获得的ＤＮＡ，总体积２５闪。ＰＣＲ扩增９５℃４５５，４５循环（９５℃４５，５７℃１５，，７２℃８，）。荧光信号超过设定的背景噪声闭值即代表扩增物阳性。１．２．５敏感性和特异性试验用６株艰难梭菌和８株非艰难梭菌中分别纯化的ｉｎｇ（约等于２ｘｌ护基因拷贝／ＰｃＲ）基因组ＤＮＡ扩增，测定此方法的敏感性和特异性。１．２．６利用传统细胞毒素试验和Ｒｅａｌ一ｔｉｍｅＰＣＲ分别对９１份粪便标本检测ｔｅｄＡ和ｔｃｄＢ。
１０．０％（在３１份ＰＣＲ阳性标本中，两种方法检测均阳性）；ｄ阴性预测值９８．３％（两种方法测５９份阴性／以〕ＰＣＲ阴性标本）。
２结果 Ｒｅａｌ一ｔｉｍｅＰＣＲ方法标准菌株检测灵敏度１０％（所有６株艰难梭菌均测出ｔｅｄＡ和ｔｅｄＢ）见表２；标准菌株检测特异性是１０％（所有８株非艰难梭菌尤其是携带相似致死毒素基因的污泥梭菌ｒｓ］都没有被检测到扩增信号）见表Ｚｎ
３讨论 传统检测艰难梭状芽抱杆菌的方法除了灵敏度低、耗时长、操作繁琐外，还有一个重要缺点是漏检率高，因为它们大多只能检测毒素Ｂ而忽略了毒素Ａ。Ｒｅａｌ一ＴｉｍｅＰＣＲ由于采用了双对引物和分子信标荧光探针进行多重扩增，与传统方法相比具有特异性强、灵敏度高、范围宽、简便、快速等优点。 在本研究中，３２份细胞毒素试验阳性的标本，而ＰｃＲ试验３１份阳性，其中一份为阴性结果，分析其原因可能是：ａ细胞毒试验的假阳性；ｂＤＮＡ提取的失误（因为粪便标本的浓度以及同源性有差异）；ｃ毒素基因变异（突变或缺失我们的ＰＣＲ引物和分子信标的相应符合区）。另外一些其它病因而腹泻的病人样本有时也被ＰＣＲ检出弱阳性，这些病人可能是艰难梭菌的无症状携带者，因为此病原体可被５０％婴儿、２０％的住院病人、２％的健康成年人无症状携带［ｓ．，］。 结果表明，Ｒｅ日一ＴｉｍｅＰＣＲ在粪便中直接测定艰难梭菌的毒素基因ｔｃｄＡ和ｔｅｄＢ是可行的，较传统方法有更大的改进和完善，将为提高艰难梭菌感染的诊、治水平以及控制感染方面起到积极作用。表２１４例标准菌株的Ｔ曰产物和权ｄ基因测定结果［参考文献１
标准菌株传统Ｔｃｄ测定，．．Ｊ，．．Ｊ，．．Ｊ１１内‘１）ｒ．ＬｌｅｓｅｓＬｌｅｓｅｓＬ，．．Ｊ，．．Ｊ『、）６』．．Ｌ卜．．ＬＣ肉斥山（Ａ冗Ｃ４３５９４）Ｃ询味公（Ａ代Ｃ４３５％）Ｃ询斥迹（ＡＴＣＣ４３５劳）Ｃ询斥浅（冉冗Ｃ４３６印）Ｃ咬句蹄沁（Ａ冗Ｃ蝴９）Ｃ内斥旋（ＶＰｌｌ（丫石３）Ｃ扣成赵自（Ａ代Ｃ叨１４）Ｃ如以如绷（冉代Ｃ２５７６３）Ｃ．阮咖诚肠（Ａ代ＣＳ姗）Ｃ详少１叹护．（Ａ冗Ｃ１３１２４）ｃ．ｈａ，加交．（Ａ代Ｃ１９４０１）Ｃ侧月，１（Ａ代Ｃｌ少ｋ）２）Ｃ护ｈｅ肋山（Ａ冗ＣＩ９４０３）乙仍１汇（Ａ咒Ｃｌｌ７７５）划Ａ（＋）ＴｃｄＢ（＋）侧Ａ（＋）ＴｃｄＢ（＋）ＴｃｄＡ（＋）ＴｃｄＢ（＋）侧Ａ（＋）韧Ｂ（＋）倒Ａ（＋）ＴｃｄＢ（＋）ＴｃｄＡ（＋）ＴｃｄＢ（＋）倒Ａ（一）侧Ｂ（一）例Ａ（一）倒Ｂ（一）ＴｃｄＡ（一）ＴｃｄＢ（一）侧Ａ（一）ＴｃｄＢ（一）乳ｄＡ（一）孔ｄＢ（一）倒Ａ（一）ＴｃｄＢ（一）倒Ａ（一）ＴｃｄＢ（一）口几ｄＡ（一）ＴｃｄＢ（一）Ｒｅａｌ一Ｔｉ二代Ｒ侧定
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