关注大骨节病软骨损伤的早期生物学标志
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DOI ：10.3760／cma.j.issn.2095-4255.2014.04.001
资金资助：国家自然科学基金（30972556、30630058、30371252）；高等学校博士点专项基金（20090201110049）；科技部国际合作专项（2006DFA336610）；陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项（2009ZDKG-79）
作者单位：710061西安交通大学医学部公共卫生学院地方病研究所、卫生部微量元素与地方病重点实验室、教育部环境与疾病相关基因重点实验室
大骨节病（Kashin 鄄Beck disease ）是一种损害透明软骨并导致软骨内化骨障碍的地方性骨关节病，自1849年发现以来，大骨节病的环境因素、软骨损伤分子生物学发生机制、早期诊断与有效防治措施的研究一直是国内外关注的重点。
近年来，随着病区综合防治措施的有效落实，农村经济发展和膳食结构改善，儿童大骨节病总体发病趋势已得到有效的控制，尽管西部地区如青藏高原仍有儿童大骨节病发生，但东部病区已达到消除的水平。
由于大骨节病致病因素及软骨早期损害的生物学特征未明，加之缺乏细胞和动物模型，至今难以确定引起软骨原发性坏死的环境致病物质及其生物学机制。
近10年来，大骨节病软骨损伤的生物学研究已经从环境可疑因素、人群、个体、器官、组织水平向软骨细胞损害的相关基因、蛋白和代谢表型方向发展。
已知骺软骨、骺板软骨和／或关节软骨深层带状或片状凝固性坏死是本病早期原发性损害的重要病理学依据，但由于活体软骨取材困难，难以实际应用于大骨节病临床早期诊断中。
为了应对大骨节病严重流行时期防治工作的迫切需要，我国在继发于软骨深层坏死后出现的软骨坏死灶钙化、横骨梁形成、瘢痕性骨组织等为主要病理学基础上，将显现的掌指骨干骺端临时钙化带和骨端轻度X 线异常征象定为儿童早期大骨节病的临床诊断标准（WS ／T 207鄄2010、WS ／T 207鄄2001、GB 16003鄄1995），但存在问题是难以与正常儿童指骨变异、骨软骨疾病鉴别，更难区分亚临床早期病例。
核磁共振成像技术较常规X 线片能更清晰地显示儿童手部指骨异常改变，但病理学变化的基础仍是软骨细胞坏死
后继发性钙化、骨化的影像显现，仍难以反映软骨原发性损害的变化。
因此，如何基于大骨节病儿童骺软骨、骺板软骨和／或关节软骨深层带状或片状凝固性坏死时或之前，发现和确定大骨节病早期损害的疾病标志物，对推进大骨节病病因、发病机制的研究有重要科学意义。
大骨节病存在软骨细胞去分化、细胞过度凋亡、蛋白聚糖丢失、线粒体功能障碍和细胞自噬功能低下的现象。
这些证据表明，大骨节病软骨损伤已涉及基因、蛋白表达、代谢调控和细胞信号转导的异常。
采用Agilent 全基因组表达谱芯片在成人大骨节病患者外周血单核细胞中筛选出97个相关基因，在软骨细胞中筛选出79个相关基因。
大骨节病软骨与骨关节病软骨差异显著不同的基因有233个，其中以硫酸软骨素N 鄄乙酰氨基半乳糖胺转移酶（CsGalNAcT ）、Smad 蛋白家族9（SMAD9），丝氨酸／苏氨酸激酶11（STK11），谷胱甘肽过氧化物酶7（GPX7）和转化生长因子β1（TGF β1）等10个基因表达差异最为显著，涉及软骨细胞外基质代谢、软骨退变和细胞凋亡转导途径等。
籍此为基础，采用大骨节病临床筛查研究，筛选出能判别Ⅰ度与Ⅱ度大骨节病外周血单核细胞差异表达基因，其准确率为91.0%，交叉验证后准确率为82.0%。
大骨节病儿童除与成人血液和软骨共同表达的基因外，还有涉及软骨发育障碍的差异表达基因。
这些结果表明，大骨节病病区环境因素损害软骨细胞的基因，且在儿童与成人大骨节病、不同程度的病情之间显著不同。
因此，进一步确定大骨节病儿童软骨中差异表达基因与软骨细胞坏死的关系，极有可能确定大骨节病早期损害的生物标志物。
大骨节病除差异表达基因谱与正常人和骨关节病不同外，其蛋白质表达与代谢组学特征也不同。
应用基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱（MALDI 鄄TOF ／TOF ）技术，发现以功能阐释和靶标为目标，大骨节病软骨细胞有27个差异表达蛋白质点不同于正常软骨细胞，功能主要涉及代谢异常，
关注大骨节病软骨损伤的早期生物学标志
郭雄
【关键词】
大骨节病；
软骨损伤；
生物标志；
基因表达；
蛋白组学
·
述评·
细胞结构异常和氧化应激反应，表明大骨节病软骨细胞在差异表达蛋白质的亚细胞定位和分子功能方面存在代谢和合成机制异常；应用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱蛋白组学芯片技术，发现大骨节病患者血清中质荷比（m／z）15886、5336、6112等16个蛋白的表达水平不同于病区内、外正常对照和骨关节病患者，其中3个蛋白标志物构建的大骨节病疾病分类树模型，预测大骨节病的特异度达到88.89％，灵敏度达到86.36％。
应用凝集素芯片技术，检测到大骨节病患者血清中糖蛋白O型糖链Galβ1鄄3GalNAcα鄄Ser／Thr（T）或GalNAcα鄄Ser／Thr （T）的含量降低，表明大骨节病患者血清糖蛋白组成与正常人存在差异，与大骨节病软骨蛋白多糖代谢障碍的研究结果相一致；应用氢谱核磁共振检测大骨节病患者及正常儿童、成人血清代谢物，大骨节病患者苏氨酸、丙氨酸和支链氨基酸（包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）含量降低，甘氨酸和谷氨酸含量升高。
已有研究表明，支链氨基酸与组氨酸的比率可作为骨关节炎诊断的潜在生物标记物。
除血清以外，唾液、尿液和关节液代谢物检测也可提供大骨节病病理生理异常的信息。
然而，这些已初步筛选出与大骨节病软骨损伤和临床表现相关的差异蛋白和代谢表型变化，是否可作为大骨节病的疾病标志，以及是否可作为临床早期诊断大骨节病的辅助检查方法，均值得深入研究。
大骨节病软骨细胞的损害涉及多个基因通路和细胞转导信号的异常。
采用贝叶斯方差分析和基因组富集分析，发现慢性缺氧诱导的线粒体损伤和细胞凋亡信号途径在大骨节病的发病机制中发挥重要作用。
利用信号网络分析筛选出死亡受体信号通路、凋亡信号通路和Wnt信号通路等与大骨节病软骨损伤显著相关，其中CsGalNAcT鄄1、Wnt3a和β连环蛋白（β鄄catenin）等在大骨节病软骨中的表达不同于正常人。
与正常软骨组织比较，大骨节病软骨组织中c鄄Jun氨基末端激酶（JNK）和p38信号转导通路相关因子基因和蛋白的表达显著增高；比较体外培养大骨节病和骨关节病软骨细胞，均发生明显的含有死亡域的FAS相关蛋白鄄半胱氨酸鄄天冬氨酸蛋白水解酶（FADD鄄Caspase）依赖性细胞凋亡，且两种软骨细胞凋亡均与死亡受体途径有关，其中大骨节病软骨细胞凋亡主要与凋亡相关蛋白因子／死亡受体4鄄含有死亡域的FAS相关蛋白鄄半胱氨酸鄄天冬氨酸蛋白水解酶（FAS／DR4鄄FADD鄄Caspase）信号系统有关，而骨关节病软骨细胞与凋亡相关蛋白因子／死亡受体4／死亡受体5鄄含有死亡域的FAS相关蛋白鄄半胱氨酸鄄天冬氨酸蛋白水解酶（FAS／DR4／DR5鄄FADD鄄Caspase）信号系统有关。
这些结果提示，大骨节病关节软骨细胞损伤涉及内源性和外源性凋亡信号通路途径，当促凋亡信号和抑制凋亡信号在失衡状态下，其特点为前者显著强于后者。
以往，国内外研究者针对大骨节病的病因先后提出50余种可疑环境致病因素，目前主要集中在粮食T鄄2毒素中毒或／和低硒营养上。
至今确认大骨节病始动致病因素仍存在两个亟待解决的问题：一是用环境低硒或／和粮食T鄄2毒素超常聚集解释大骨节病的灶状分布流行病学特征证据尚不充分；二是至今尚未获得大骨节病软骨组织中是否存在何种真菌毒素及其代谢产物，硒水平究竟缺乏到何种程度。
已证实，单一T鄄2毒素及与低硒复合可致雏鸡、小型猪和大鼠关节软骨深层坏死等病变，但与人类大骨节病软骨细胞坏死的特征不完全一致。
针对同一环境暴露因素存在大骨节病和克山病，但其损伤靶器官不同的特征，利用基因芯片技术筛选出了两种病共同和不同的差异表达基因。
这些结果表明，单一环境因素难以完全解释大骨节病的发病特征。
环境危险因素作用导致的基因和蛋白表达改变，可参与调控个体对环境危险因素的反应，影响疾病的发生和发展。
利用国际环境反应基因数据，发现大骨节病软骨和血液中存在与脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T鄄2毒素等多种真菌毒素和低硒相关的环境反应基因，与大骨节病病区玉米脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T鄄2毒素含量显著高于非病区及可致雏鸡、小型猪和大鼠关节软骨细胞坏死相关。
因此，如何确定这些真菌毒素与低硒何为主辅特异性致人类儿童软骨损害而不致动物出现类似人类大骨节病特征性的变化，将又是大骨节病病因发病机制研究面临的一个挑战。
针对大骨节病病因与发病机制研究中存在诸多的科学难题，有必要利用现代分子生物学和整合组学技术，深入研究大骨节病软骨早期损害的生物学特征及其与环境可疑因素的因果关系，尽可能从环境、人群、疾病中间表型、细胞、基因和蛋白多个水平确定大骨节病软骨原发性坏死的分子生物学机制及其环境致病因素。
籍此为基础，建立大骨节病分子早期诊断技术，解决亚临床诊断和疾病预警的难点问题，为推进控制和消除大骨节病进程提供科学依据。
（收稿日期：2013鄄06鄄30）
（本文编辑：王丹娜）。
