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小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及生物学特性分析

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小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及生物学特性分析刘寿生;雷俊霞;黎阳;项鹏;周敦华【摘要】[Objective] To establish an effective way for isolation and expansion of mouse adipose-derived stromal cells (ADSC), and to observe the biological characteristics of mouse ADSC. [Methods] ADSC were obtained from adipose of BALB/C mouse, isolated and purified in vitro to determine cell morphology, immunophenotype, differentiation potentiality, clone formation ability, growth kinetics and immunoloregulation characteristics in the lymphocyte proliferation inhibition test; T lymphocytes (1 ?105) were cultured in the presence of ConA (ConA was 20 μg/mL), and ADSC of different number interacted with activated T lymphocytes respectively. Experiment was divided into 8 groups by the different number of ADSC: A group as positive control (ConA+T lymphocytes), B group (ADSC 1× 103+ConA+T lymphocytes), C group (ADSC× 1 04+ConA+T lymphocytes), D group (ADSC 2 × 104+ConA+T lymphocytes), E group as negative control (T lymphocytes), F group (ADSC1 ×103), G group (ADSC1 × 104), H group (ADSC 2 × 104), F, G, H were reference groups. The ability of T lymphocyte proliferation was measured by cck-8 method. [Results] ADSC showed plastic-adherent, fibroblastic-like morphologic characteristics, cell proliferation was inadequate and cell morphology changed to flat, enlarged shapes with the passage increasing. ADSC at passage 3 highly expressed CD29 and CD44, moderately expressed Sca-1, weakly expressed CD34, CD45, and CDllb.Three passaged ADSC could be induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes, and had strong ability to shape colony forming unit-fibroblasts (CFU-Fs). Doubling time of three,five, and eight passaged ADSC was (22 ?3)h, (24 ?3)h, and (30 ?3)h, respectively. The proliferation rate after passage 5 slowed down gradually. ADSC could suppress T lymphocyte proliferation, the inhibition ratios of B, C, and D group were 20. 78%, 47. 94%, and 60.70%, respectively, which was similar to bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC). [Conclusion] ADSC can be isolated and expanded effectively by using adherent culture, they possess general characteristics of mesenchymal stem cells, in addition, they are easier to be purified and their proliferation rate is faster compared with BMSC,so ADSC may be a good multipotential cell candidate for the future cell replacement therapy.%[目的]建立一种有效的分离、培养小鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)的方法,从而为小鼠间充质干细胞(MSC)的来源提供更广阔的选择,以利于MSC在小鼠模型中的研究.[方法]体外分离、纯化BALB/C小鼠ADSC,进行细胞形态、表面标志、成脂及成骨分化潜能鉴定、克隆形成能力、生长动力学等方面的研究,并通过淋巴细胞增殖抑制试验研究其免疫调节特性:用终浓度为20μg/mL的ConA作用于T淋巴细胞(1×105个),以不同数量的ADSC分别与活化T淋巴细胞作用,根据ADSC数量不同实验分为A组(ConA+T细胞)、B组(ADSC 1×103/孔+ConA+T细胞)、C组(ADSC 1×104/孔+ConA+T细胞)、D组(ADSC 2×104/孔+ConA+T细胞),同时E组(单纯T细胞)作为阴性对照组,F组(ADSC 1×103孔)、G组(ADSC 1×104/孔 )、H组(ADSC 2×104/孔)作为参照组.用CCK-8法检测作用前后T细胞功能.[结果]ADSC镜下形态呈贴壁、梭型,且随着代数的增加,细胞逐渐增大；第3代ADSC高表达CD29和CD44,中表达Sca-1,低表达或不表达CD34、CD45、CD1 1b;第3代ADSC可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;第3代ADSC有很强的集落形成能力；第3代ADSC倍增时间为(22±3)h,第5代ADSC 倍增时间为(24±3)h,第8代ADSC倍增时间为(30±3)h,第5代后的ADSC增殖速度随着代数的增加逐渐减慢;ADSC可以抑制T淋巴细胞的增殖,B、C、D组的抑制率分别为20.78％、47.94％、60.70％,抑制能力和骨髓间充质于细胞(BMSC)相似.[结论]通过贴壁培养可以从小鼠脂肪中分离培养出高纯度ADSC,该方法效率高,培养出的ADSC具有BMSC的一般特性,且与BMSC相比更易纯化,具有更快的增殖速度,有望作为小鼠MSC的有效来源.【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2012(033)003【总页数】6页(P299-304)【关键词】间充质干细胞;小鼠;骨髓;脂肪组织;免疫调节【作者】刘寿生;雷俊霞;黎阳;项鹏;周敦华【作者单位】中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120;中山大学中山医学院,广东广州510080;中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120;中山大学中山医学院,广东广州510080;中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120【正文语种】中文【中图分类】R725.5;R329.4间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）最初是在骨髓中分离出来的，但后来在脂肪组织、肌肉组织、牙根、胎盘、羊水及脐带血中均分离出MSC［1］。

MSC 具有促进组织修复［2］、免疫调节［3］和造血支持［4］的作用，故其在临床上有广泛的应用前景。

小鼠是研究造血和免疫的有效动物模型。

目前骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）一直是小鼠MSC最主要的来源，但由于小鼠骨髓中MSC含量很少（约106个骨髓单个核细胞中含2～5个MSC），而且MSC大多靠近骨髓腔密质骨的表面［5］，故而用标准的冲出骨髓进行贴壁法培养很难获得足够多的较纯的MSC，大大阻碍了MSC在小鼠模型中的研究。

脂肪组织已经被证明是一种重要的MSC来源，这种MSC称为脂肪来源的间充质干细胞（adiposederived stromal cells，ADSC）。

对人类脂肪间充质干细胞的研究表明，与其他组织相比，脂肪组织中含有大量的MSC，易于在体外培养扩增［6］。

但ADSC在小鼠脂肪中的含量如何，是否易于纯化和扩增，其生物学特性如何，目前文献报道不多，本文就小鼠ADSC的基本生物学特性及其免疫调节功能进行研究。

1 材料与方法1.1 实验动物和主要试剂健康 6～8周龄 SPF级 BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠均为雌性（中山大学实验动物中心）；DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基（Gibco公司）；标准胎牛血清（Bioind 公司）；2.5 g/L 胰蛋白酶（Bioind 公司）；I型胶原酶（Gibco 公司）；抗小鼠单克隆抗体：Anti-CD11b-FITC、Anti-Scal-1-FITC、Anti-CD34-FITC、Anti-CD29-PE、Anti-CD44-PE、Anti-CD45-PE（eBioscience公司）；成脂诱导液及成骨诱导液（广州威佳公司）；cck-8（dojindo公司）；刀豆蛋白 A（ConA）（sigma公司）。

1.2 ADSC的分离培养及形态学观察取6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠5只，脱脊处死后750 mL/L乙醇消毒8 min，钝性分离腹股沟内侧皮下脂肪组织，用PBS清洗2遍以除去上面的毛发。

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MSC

MSC


为什么MSC的免疫下调作用只能存在一段时间呢，会不会 的免疫下调作用只能存在一段时间呢， 可能和MSC在体内保留的数量有关，MSC在异基因受体 在体内保留的数量有关， 的体内能持续存在吗？ 的体内能持续存在吗？

AML AML来源的 来源的MSC不表达 不表达CD105，在体外增殖能力差，丧失多向分化能 来源的 不表达 ，在体外增殖能力差， 支持造血功能也存在缺陷。研究者们推测AML骨髓中的白血病细 力，支持造血功能也存在缺陷。研究者们推测 骨髓中的白血病细 胞克隆、异常的细胞因子等与MSC之间存在相互作用，这可能影响了 之间存在相互作用， 胞克隆、异常的细胞因子等与 之间存在相互作用 MSC的生物学特性 的生物学特性
MSCs不能激活T细胞，也不是CD8+细胞毒T细胞的靶 目标。CD8+T淋巴细胞能杀伤供者铬标记的单个核细胞 却不能杀伤同一供者来源的MSCs。此外杀伤细胞抑制 性受体(KIR)不相合时，自然杀伤细胞也不能杀伤 MSC。

MSC的免疫调节性 的免疫调节性


成熟DC启动免疫排斥及 反应， 成熟 启动免疫排斥及GVHD反应，未成熟（iDC）及淋巴样 诱导免 启动免疫排斥及 反应 未成熟（ ）及淋巴样DC诱导免 疫耐受。 疫耐受。 体外实验证明MSC抑制了 抑制了CD4+单核细胞向 的分化；Msc在Dc成熟的 单核细胞向DC的分化 体外实验证明 抑制了 单核细胞向 的分化； 在 成熟的 过程中下调APC相关分子，如CD1a、CD40、CD80、CD83、CD86和 相关分子， 过程中下调 相关分子 、 、 、 、 和 HLA-DR的表达，体系去除 的表达， 并加入DC的诱导剂后可逆反这种抑制作 的表达 体系去除MSC并加入 的诱导剂后可逆反这种抑制作 并加入 这说明此作用是可逆的； 共培养后的DC与单纯 相比， 用，这说明此作用是可逆的；与Msc共培养后的 与单纯 相比，其 共培养后的 与单纯DC相比 刺激CD4+增殖的能力有所减弱，炎性因子如 增殖的能力有所减弱， 刺激 增殖的能力有所减弱 炎性因子如IFN-γ、IL-12、TNF-α分泌 、 、 分泌 减少，炎性银子如IL-10分泌增加。 分泌增加。 减少，炎性银子如 分泌增加 最近研究报道MSC不仅对单核细胞来源 不仅对单核细胞来源DC,并且对 并且对CD34+细胞来源的 细胞来源的DC 最近研究报道 不仅对单核细胞来源 并且对 细胞来源的 的分化和功能也有抑制作用。虽然在MSC抑制 抑制CD3和CD28抗体刺激的 抗体刺激的T 的分化和功能也有抑制作用。虽然在 抑制 和 抗体刺激的 细胞的增殖体系中无APC的存在，但结果提示，MSC抑制 的发育和成 的存在， 抑制DC的发育和成 细胞的增殖体系中无 的存在 但结果提示， 抑制 熟时其免疫调节功能的机制之一。 熟时其免疫调节功能的机制之一。
MSC干细胞

MSC干细胞


脊髓损伤动物模型
干细胞注射液
间充质干细胞治疗肝病技术，为传统医学难以解决的病毒性
肝炎导致肝硬化、肝功能衰竭提供新的治疗途径。该技术
2009年得到总后卫生部批准，在临床进行科研性质的使用 间充质干细胞修复脑中风后中枢神经损伤科研项目，2009年 在北京市科委立项，并得到专项科研经费资助； 获得“人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液及其制备方法” 专利技术（ZL201010551722.8），并于2010年12月10日在 药监局注册；
UC-MSC治疗肝硬化
患者胡某，男性，48岁，诊断为肝硬化早期，脾功能亢进。
病情简介：腹胀， 纳差，精神萎靡，乏力，牙龈出血，鼻衄，不能正 常工作。超声提示，脾大，门脉增宽。
07 年 11月第一次 MSC 治疗。 2 个月后腹胀、乏力减轻，食欲增加，牙 龈出血减轻，鼻出血消失。超声提示，脾脏缩小，门脉变窄。化验显 示，肝功能指标基本恢复正常。 08年3月21日行第二次MSC治疗，目前已经正常工作。
MSC促进皮肤移植成功
MSC的多向分化能力
MSC在人体的分布
胰腺 骨髓
脐血
胎盘 胎肝
间充质干细胞
脐带 脂肪
胎肺
骨骼肌
羊水
真皮
骨膜
不同来源MSC的比较
脐带间充质干细胞 成人骨髓间充质干细胞
多潜能性、增殖能力强 天然生物资源 低抗原性，无免疫排斥，调节免疫 MSC产率高,1MSC/1600MNC 细胞纯净，病毒污染风险低 易产业化和临床应体来源、无免疫排斥 MSC产率低,1-10MSC/106MNC 有病毒感染风险
有限临床应用
脐带间充质干细胞(UC-MSC)
体外培养扩增获取人UCMSC
原代贴壁
体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及向心肌样细胞的诱导分化

体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及向心肌样细胞的诱导分化

体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及向心肌样细胞的诱导分化张卫泽;陈跃武;陈永清;哈小琴;马凌;秦勉;洪志斌【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2006(010)037【摘要】目的:体外分离培养成人脂肪组织来源的间充质干细胞,探索其基本生物学特性及向心肌细胞诱导分化的潜能,为心肌再生提供理想的自体干细胞来源.方法:实验于2005-01/12在解放军兰州军区兰州总医院医学实验中心完成.取本院微创外科中心一急性单纯性阑尾炎患者大网膜脂肪组织(取得家属同意并告知仅用作实验室研究).体外分离成人脂肪组织来源的间充质干细胞并传代扩增培养.采用相差显微镜及透射电镜观察细胞形态学特点,四氮唑蓝比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及CD44、CD34的表达,第4代细胞用5-氮胞苷诱导使其向心肌细胞分化,免疫细胞化学鉴定心肌样细胞.结果:①分离培养的脂肪间充质干细胞经传代纯化后细胞形态呈均-梭形生长,电镜显示细胞较为幼稚,核大,核仁明显,常染色质多,异染色质少,细胞器结构及种类简单,以粗面内质网和线粒体为主.②细胞生长曲线呈"S"形,第1和2天为细胞生长潜伏期,第3天开始进入对数生长期,第7天达顶点,群体细胞倍增时间为18～20 h.③流式细胞仪检测91.83%细胞CD44表达阳性、CD34阴性.④细胞周期分析显示76.2%细胞处于G0/G1期,S期细胞占8.7%,G2/M细胞占15.1%.⑤5-氮胞苷诱导后4周免疫细胞化学显示部分细胞缝隙连接蛋白-43表达阳性,表达率约为(29.0±1.2)%.结论:成人脂肪组织存在细胞活力旺盛的间充质干细胞且易于体外分离扩增,并在体外一定条件下具有向心肌细胞分化的潜能,可望成为心肌再生医学理想的自体干细胞种子来源.【总页数】2页(P14-17,插图37-2)【作者】张卫泽;陈跃武;陈永清;哈小琴;马凌;秦勉;洪志斌【作者单位】解放军兰州军区兰州总医院心内科,甘肃省,兰州市,730050;兰州大学临床医学院,甘肃省,兰州市,730000;解放军兰州军区兰州总医院心内科,甘肃省,兰州市,730050;解放军兰州军区兰州总医院医学实验中心,甘肃省,兰州市,730050;解放军兰州军区兰州总医院心内科,甘肃省,兰州市,730050;解放军兰州军区兰州总医院心内科,甘肃省,兰州市,730050;兰州大学临床医学院,甘肃省,兰州市,730000【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.5-氮胞苷对脂肪间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的影响 [J], 李国庆;张卫泽;马凌;陈永清;秦勉;韩娟萍;张耀辉2.体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及诱导分化为心肌细胞的研究 [J], 任刚;边云飞;武晓佳;武卫东;肖传实3.成人脂肪间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验观察 [J], 张卫泽;陈跃武;哈小琴;陈永清;秦勉;马凌;郭建巍;洪志斌4.培养基血清浓度对5-氮胞苷诱导脂肪间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的影响 [J], 李国庆;张卫泽;马凌;陈永清;秦勉;韩娟萍;张耀辉5.体外培养成人脂肪间充质干细胞及向平滑肌细胞诱导分化 [J], 郭泽君;边云飞;薛君;武卫东;肖传实因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

低氧培养对间充质干细胞生存与生长的影响

低氧培养对间充质干细胞生存与生长的影响

低氧培养对间充质干细胞生存与生长的影响张君;汪保和【摘要】Cultruing mesenchymal stem cells ( MSCs) under hypoxia condition could influence their characteristics of survival and growth, such as vitality, proliferation, senesce, dealth, and so on. The mechanism of MSCs resistance/sensitivity to hypoxia impact is complex and multiple. It involves in energy metabolism, HIFs signal pathway and others signal pathways and kinds of molecules of regulation or transduction. Because of the difference of MSCs source, the methods of isolation, the cell surface markers, the way of establishing hypoxia environment and others methodological fac-tors. It seems that the currently available experimental data on hypoxia impact to MSCs are so contradictory. It is necessary to summarize recent researches on the survival and the growth of MSCs under low oxygen conditions in order to lay the foun-dation for establishing the best culture system of MSCs in future and the research of the clinical application of MSCs.%低氧培养能影响间充质干细胞( Mesenchymal stem cells, MSCs)细胞活力、增殖能力、衰老、死亡等生存和生长相关特性,其分子机制复杂多重,涉及能量代谢途径、低氧诱导因子( HIFs)信号通路以及诸多其他信号通路、调控和转导分子。