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大鼠肌肉注射移植人脐带间充质干细胞的安全性张美荣;张学峰;胡建霞;王丽;张桂芝;高宏;苗志敏;王颜刚【摘要】方法:SPF级雄性Wistar大鼠51只,取3只作为空白对照,剩余48只随机均分为4组:低、中、高浓度细胞移植组分别于大鼠左下肢腓肠肌外侧肌肉注射2.5×109 L-1,5×10L-1,1.5×1010L-1人脐带间充质干细胞悬液,共注射2个位点,每个位点注射0.1 mL,2个位点间隔约0.5cm;溶媒对照组同法注射50g/L葡萄糖溶液.分别于注射后1d及1,2,4周进及血小板、乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶轻度炎症反应性升高;高浓度细胞移植可引起肌肉注射局部明显炎症反应.提示人脐带间充质干细胞免疫原性极低,在掌握了细胞移植的适宜浓度及剂量的前提下,以肌肉注射的方式进行异种移植不会引起受者严重的免疫排斥反应.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2010(014)027【总页数】4页(P4997-5000)【关键词】肌肉;安全性;注射;人脐带间充质干细胞;干细胞移植【作者】张美荣;张学峰;胡建霞;王丽;张桂芝;高宏;苗志敏;王颜刚【作者单位】青岛大学医学院附属医院干细胞研究中心,山东省,青岛市,266003;青岛大学医学院附属医院干细胞研究中心,山东省,青岛市,266003;青岛大学医学院附属医院干细胞研究中心,山东省,青岛市,266003;青岛大学医学院附属医院干细胞研究中心,山东省,青岛市,266003;青岛大学医学院附属医院干细胞研究中心,山东省,青岛市,266003;青岛大学医学院附属医院干细胞研究中心,山东省,青岛市,266003;青岛大学医学院附属医院干细胞研究中心,山东省,青岛市,266003;青岛大学医学院附属医院干细胞研究中心,山东省,青岛市,266003【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言间充质干细胞又称多能基质细胞，是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层[1]。
干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）ﻫ一、前言二、干细胞制剂得质量控制(一）干细胞得采集、分离及干细胞(系）得建立ﻫ(二)干细胞制剂得制备ﻫ(三）干细胞制剂得检验ﻫ(四)干细胞制剂得质量研究三、干细胞制剂得临床前研究ﻫ（一)安全性评价（二）有效性评价名词解释参考文献ﻫﻫﻫ一、前言干细胞就是一类具有不同分化潜能,并在非分化状态下自我更新得细胞。
干细胞治疗就是指应用人自体或异体来源得干细胞经体外操作后输入(或植入）人体,用于疾病治疗得过程。
这种体外操作包括干细胞得分离、纯化、扩增、修饰、干细胞(系）得建立、诱导分化、冻存与冻存后得复苏等过程。
用于细胞治疗得干细胞主要包括成体干细胞、胚胎干细胞及诱导得多能性干细胞(ｉＰＳＣ）。
成体干细胞包括自体或异体、胎儿或成人不同分化组织,以及发育相伴随得组织(如脐带、羊膜、胎盘等）来源得造血干细胞、间充质干细胞、各种类型得祖细胞或前体细胞等。
目前国内外已开展了多项干细胞（指非造血干细胞）临床应用研究,涉及多种干细胞类型及多种疾病类型。
主要疾病类型包括骨关节疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应（GＶHD)、脊髓损伤及退行性神经系统疾病与糖尿病等。
其中许多干细胞类型，就是从骨髓、脂肪组织、脐带血、脐带或胎盘组织来源得间充质干细胞,它们具有一定得多向分化潜能及抗炎与免疫调控能力等。
用于干细胞治疗得细胞制备技术与治疗方案，具有多样性、复杂性与特殊性.但作为一种新型得生物治疗产品，所有干细胞制剂都可遵循一个共同得研发过程,即从干细胞制剂得制备、体外试验、体内动物试验，到植入人体得临床研究及临床治疗得过程.整个过程得每一阶段,都须对所使用得干细胞制剂在细胞质量、安全性与生物学效应方面进行相关得研究与质量控制。
ﻫ本指导原则提出了适用于各类可能应用到临床得干细胞(除已有规定得造血干细胞移植外)在制备与临床前研究阶段得基本原则。
每个具体干细胞制剂得制备与使用过程，必须有严格得标准操作程序并按其执行，以确保干细胞制剂得质量可控性以及治疗得安全性与有效性.每一研究项目所涉及得具体干细胞制剂，应根据本指导原则对不同阶段得基本要求,结合各自干细胞制剂及适应证得特殊性,准备并实施相关得干细胞临床前研究.ﻫ二、干细胞制剂得质量控制ﻫ(一)干细胞得采集、分离及干细胞（系)得建立ﻫ1、对干细胞供者得要求ﻫ每一干细胞制剂都须具有包括供者信息在内得、明确得细胞制备及生物学性状信息。
缺氧条件下人脐带源性间充质干细胞增强缺氧诱导因子-1α表达促进肺腺癌细胞增殖Li Chang;Zhao Chengling;Chen Shijun;Chen Yuqin【摘要】目的探讨缺氧条件下缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在人脐带源性间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hucMSCs)促进肺腺癌A549细胞增殖过程中的可能机制.方法分离培养和鉴定hucMSCs,分别与肺腺癌A549细胞、干扰了HIF-1α 基因的A549细胞在常氧或缺氧条件下进行共培养,荧光定量PCR和Western blot 法分别检测HIF-1α 和生存素(survivin)表达水平,MTT法检测细胞增殖力,划痕实验分析细胞迁移力.结果 MTT和划痕实验检测显示,常氧条件下,hucMSCs共培养的A549细胞增殖能力、迁移能力较无hucMSCs共培养的细胞明显减弱;缺氧条件下,A549细胞增殖力和迁移力较常氧培养的A549细胞明显增强,hucMSCs共培养使二者进一步增强,沉默HIF-1α 则使二者减弱,hucMSCs共培养不改变沉默HIF-1α 对细胞增殖力和迁移力的影响.荧光定量PCR和Western blot检测显示,缺氧培养时,A549细胞内HIF-1α 和survivin表达明显上调,hucMSCs共培养明显增强缺氧对HIF-1α 和survivin表达的上调作用;沉默HIF-1α 抑制缺氧对A549细胞HIF-1α 和survivin表达的上调,hucMSCs共培养不改变沉默HIF-1α 对HIF-1α 和survivin表达上调的抑制.结论缺氧条件下,hucMSCs共培养导致肺腺癌A549细胞HIF-1α 和survivin表达上调,从而使A549细胞的增殖和迁移能力增强.【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》【年(卷),期】2019(028)002【总页数】7页(P108-114)【关键词】肺腺癌;缺氧;人脐带源性间充质干细胞;缺氧诱导因子-1α;生存素【作者】Li Chang;Zhao Chengling;Chen Shijun;Chen Yuqin【作者单位】;;;【正文语种】中文【中图分类】R734.2肺癌是目前危及人类生命健康的恶性肿瘤，也是国内外死亡率较高的恶性肿瘤之一[1]。
干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）一 前言二 干细胞制剂的质量控制（一）干细胞的采集、分离及干细胞（系）的建立（二）干细胞制剂的制备（三）干细胞制剂的检验（四）干细胞制剂的质量研究三 干细胞制剂的临床前研究（一）安全性评价（二）有效性评价名词解释参考文献一 前言干细胞是一类具有不同分化潜能，并在非分化状态下自我更新的细胞。
干细胞治疗是指应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后输入（或植入）人体，用于疾病治疗的过程。
这种体外操作包括干细胞的分离、纯化、扩增、修饰、干细胞（系）的建立、诱导分化、冻存和冻存后的复苏等过程。
用于细胞治疗的干细胞主要包括成体干细胞、胚胎干细胞及诱导的多能性干细胞（♓）。
成体干细胞包括自体或异体、胎儿或成人不同分化组织，以及发育相伴随的组织（如脐带、羊膜、胎盘等）来源的造血干细胞、间充质干细胞、各种类型的祖细胞或前体细胞等。
目前国内外已开展了多项干细胞（指非造血干细胞）临床应用研究，涉及多种干细胞类型及多种疾病类型。
主要疾病类型包括骨关节疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应（☝✞☟）、脊髓损伤及退行性神经系统疾病和糖尿病等。
其中许多干细胞类型，是从骨髓、脂肪组织、脐带血、脐带或胎盘组织来源的间充质干细胞，它们具有一定的多向分化潜能及抗炎和免疫调控能力等。
用于干细胞治疗的细胞制备技术和治疗方案，具有多样性、复杂性和特殊性。
但作为一种新型的生物治疗产品，所有干细胞制剂都可遵循一个共同的研发过程，即从干细胞制剂的制备、体外试验、体内动物试验，到植入人体的临床研究及临床治疗的过程。
整个过程的每一阶段，都须对所使用的干细胞制剂在细胞质量、安全性和生物学效应方面进行相关的研究和质量控制。
本指导原则提出了适用于各类可能应用到临床的干细胞（除已有规定的造血干细胞移植外）在制备和临床前研究阶段的基本原则。
每个具体干细胞制剂的制备和使用过程，必须有严格的标准操作程序并按其执行，以确保干细胞制剂的质量可控性以及治疗的安全性和有效性。
人脐带间充质干细胞分离、鉴定方法及其治疗难治性免疫性血小板减少症的有效性及安全性研究黄斯勇;梁英民;白喜龙;伍艳兰;胡彬;王刚锋;王颖;张蓉;罗红香;徐静【摘要】Objective To investigate the separation and identification methods of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs)and its effectiveness and safety in treating refractory immune thrombocytopenia(ITP). Methods A total of 6 patients with refractory ITP were selected in Xi′an Gaoxin Hospital from December 2016 to July 2017.Umbilical cord was collected from mature healthy parturients underwent caesarean section,enzymatic digestion method was used to separate and culture hUC-MSCs,BD FACSCalibur Flow Cytometer was used to detect the immunophenotyping of hUC-MSCs,and the differentiation ability of hUC-MSCs was evaluated by osteosynthesis and adipogenesis induced differentiation experiment.All of the 6 patients received intravenous infusion of hUC-MSCs(1×106/kg),thereinto patient with PLT equal or less than 50×109/L 1 month after intravenous infusion of hUC-MSCs received repeat intravenous infusion of hUC-MSCs.All of the 6 patients were followed up for 3 months at least,the expiration date was 2017 -11 -01;clinical effect,relapse and incidence of adverse reactions during the treatment were observed,and flow cytometry was used to detect the expression of peripheral blood lymphocyte subsets. Results Enzymatic digestion results showed primarily cultured cells growth adheres to the wall and schistose conjugation little by little,with homogeneousform;inverted phase contrast microscope showed fibroblast-like cells with long fusiform and flowing water shape growth adheres to the wall,and the cellular morphology was good,meanwhile as the cells propagation,the cellular morphology did not occurred obvious change.Flow cytometry detection results showed that,expressions of CD73,CD90 and CD105were significantly high in hUC-MSCs(all over 98.0%),while expressions ofCD3,CD11band CD19were significantly low or negative.Osteosynthesis and adipogenesis induced differentiation experiment showed that,hUC-MSCs can differentiate into osteoblast and adipocyte.After intravenous infusion of hUC-MSCs,3 cases got complete response,2 cases were effective,1 case was invalid,the total effective rate was 5/6;1 case occurred relapse during the follow-up,but repeat intravenous infusion of hUC-MSCs was still effective.After intravenous infusion of hUC-MSCs,peripheral bloodCD+3CD+4T - lymphocyte ratio, CD+3CD+8T-lymphocyte ratio orCD+19B-lymphocyte ratio was not statistically significantly different with that before intravenous infusion of hUC-MSCs,respectively(P>0.05),while CD+16CD+56natural killer cells ratio and CD+4CD+25CD-127T helper cells ratio were statistically significantly higher than those before intravenous infusion of hUC-MSCs(P < 0.05). During the treatment,2 cases occurred mild fever and completely relieved after symptomatic treatment;1 case occurred steroid dependence and cured after anti-virus therapy. Conclusion Enzymatic digestion method is effective to separate and culture hUC-MSCs;flow cytometry,osteosynthesis and adipogenesis induced differentiation experiment can effectively identify thedifferentiation ability of hUC-MSCs;hUC-MSCs has good recent clinical effect in treating refractory ITP with mild adverse reactions,may be a new therapeutic method for refractory ITP.%目的探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)分离、鉴定方法及其治疗难治性免疫性血小板减少症(ITP)的有效性及安全性.方法选取2016年12月—2017年7月西安高新医院收治的难治性ITP患者6例.脐带取自足月剖宫产健康产妇,采用酶消化法分离、培养hUC-MSCs,BD FACSCalibur流式细胞仪检测hUC-MSCs免疫表型,成骨、成脂诱导分化实验评估hUC-MSCs分化能力.6例患者均静脉输注hUC-MSCs(1×106/kg),输注后1个月如患者血小板计数≤50×109/L可重复输注1次.所有患者至少随访3个月,随访截至2017-11-01,观察患者临床疗效、复发情况及治疗期间不良反应发生情况,并采用流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群表达情况.结果采用酶消化法分离、培养hUC-MSCs,可见原代细胞贴壁生长并逐渐融合成片状,形态均一,倒置相差显微镜下观察细胞类似于成纤维细胞,成长梭形流水状贴壁生长,细胞形态良好,并随着细胞传代,细胞形态未发生变化.流式细胞术检测结果显示, hUC-MSCs高表达CD73、CD90、CD105,表达量均>98.0%;不表达或低表达CD3、CD11b、CD19.成骨、成脂诱导分化实验结果显示,hUC-MSCs能向成骨细胞、脂肪细胞分化.输注hUC-MSCs后,6例患者完全反应3例,有效2例,无效1例,总有效率为5/6;随访期间复发1例,再次输注hUC-MSCs后仍有效.hUC-MSCs输注前后患者外周血CD+3CD+4T淋巴细胞比例、CD+3CD+8T淋巴细胞比例及CD+19B淋巴细胞比例比较,差异无统计学意义(P>0.05);hUC-MSCs输注后CD+16CD+56自然杀伤细胞(NK细胞)比例和CD+4CD+25CD-127辅助性T细胞(Treg细胞)比例均高于hUC-MSCs输注前(P<0.05).本组患者治疗期间2例出现轻度发热,对症处理后完全缓解;1例患者出现激素依赖,经抗病毒治疗后痊愈.结论采用酶消化法能有效分离、培养hUC-MSCs,流式细胞术及成骨、成脂诱导分化实验能有效鉴定hUC-MSCs分化能力,且hUC-MSCs治疗难治性ITP的近期疗效较好,不良反应轻微,可能成为难治性ITP的新治疗方法.【期刊名称】《实用心脑肺血管病杂志》【年(卷),期】2017(025)012【总页数】7页(P16-22)【关键词】免疫性血小板减少症;脐带;间充质干细胞;细胞分离;治疗效果【作者】黄斯勇;梁英民;白喜龙;伍艳兰;胡彬;王刚锋;王颖;张蓉;罗红香;徐静【作者单位】710075陕西省西安市,西安高新医院血液科;710075陕西省西安市,西安高新医院血液科;710075陕西省西安市,西安高新医院血液科;710038陕西省西安市,空军军医大学唐都医院疾病预防控制科;710075陕西省西安市,西安高新医院血液科;710075陕西省西安市,西安高新医院血液科;710075陕西省西安市,西安高新医院血液科;710075陕西省西安市,西安高新医院血液科;710075陕西省西安市,西安高新医院血液科;710075陕西省西安市,西安高新医院血液科【正文语种】中文【中图分类】R558.2人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是从人脐带华通胶中分离出来的一种基质细胞，在疾病治疗方面具有广阔的应用前景，已成为国内外研究热点之一。
干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)一。
前言二。
干细胞制剂得质量控制(一)干细胞得采集、分离及干细胞(系)得建立(二)干细胞制剂得制备(三)干细胞制剂得检验(四)干细胞制剂得质量研究三.干细胞制剂得临床前研究(一)安全性评价ﻩ(二)有效性评价名词解释参考文献一.前言干细胞就是一类具有不同分化潜能,并在非分化状态下自我更新得细胞。
干细胞治疗就是指应用人自体或异体来源得干细胞经体外操作后输入(或植入)人体,用于疾病治疗得过程。
这种体外操作包括干细胞得分离、纯化、扩增、修饰、干细胞(系)得建立、诱导分化、冻存与冻存后得复苏等过程、用于细胞治疗得干细胞主要包括成体干细胞、胚胎干细胞及诱导得多能性干细胞(iPSC)、成体干细胞包括自体或异体、胎儿或成人不同分化组织,以及发育相伴随得组织(如脐带、羊膜、胎盘等)来源得造血干细胞、间充质干细胞、各种类型得祖细胞或前体细胞等。
目前国内外已开展了多项干细胞(指非造血干细胞)临床应用研究,涉及多种干细胞类型及多种疾病类型。
主要疾病类型包括骨关节疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应(GVHD)、脊髓损伤及退行性神经系统疾病与糖尿病等。
其中许多干细胞类型,就是从骨髓、脂肪组织、脐带血、脐带或胎盘组织来源得间充质干细胞,它们具有一定得多向分化潜能及抗炎与免疫调控能力等。
用于干细胞治疗得细胞制备技术与治疗方案,具有多样性、复杂性与特殊性。
但作为一种新型得生物治疗产品,所有干细胞制剂都可遵循一个共同得研发过程,即从干细胞制剂得制备、体外试验、体内动物试验,到植入人体得临床研究及临床治疗得过程。
整个过程得每一阶段,都须对所使用得干细胞制剂在细胞质量、安全性与生物学效应方面进行相关得研究与质量控制。
本指导原则提出了适用于各类可能应用到临床得干细胞(除已有规定得造血干细胞移植外)在制备与临床前研究阶段得基本原则。
每个具体干细胞制剂得制备与使用过程,必须有严格得标准操作程序并按其执行,以确保干细胞制剂得质量可控性以及治疗得安全性与有效性。
脐带间充质干细胞制备存储标准脐带间充质干细胞（Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells，WJ-MSCs）是一种来源于脐带的多潜能干细胞，具有广泛的临床应用前景。
为了确保脐带间充质干细胞的制备和存储质量，制定脐带间充质干细胞制备存储标准非常重要。
脐带间充质干细胞的制备和存储标准应包括以下几个方面：1.取材标准：脐带是脐带间充质干细胞的主要来源，因此在制备和存储过程中需要确保脐带的质量。
取材时，应确保脐带来自经过筛选和检测的健康母亲，脐带的无菌处理应符合相关规定。
2.分离和培养标准：脐带间充质干细胞的分离和培养是制备过程中的关键步骤。
应采用符合相关规定的分离和培养方法，确保脐带间充质干细胞能够获得最佳生长和增殖环境。
3.鉴定标准：在制备过程中，需要对脐带间充质干细胞进行鉴定。
鉴定标准可以包括表面标记物的检测、多向分化潜能的检测等指标，以确保制备的细胞具有干细胞的特性。
4.冻存标准：为了确保脐带间充质干细胞的长期保存，应采用合适的冻存方法和条件。
冻存标准可以包括冷冻液的选择、冷冻速率的控制、冷冻样品的保存温度等指标。
5.质量控制标准：脐带间充质干细胞的制备和存储过程中应进行严格的质量控制。
质量控制标准可以包括细胞数目的检测、细胞活力的检测、无菌检测等项目，以确保制备的细胞符合质量要求。
在制定脐带间充质干细胞制备存储标准时，需要参考国内外相关的法规和标准。
同时，制定标准时需要考虑到国内的实际情况和相关研究的最新进展。
制定标准应充分结合实际情况和科学研究，确保标准的可行性和科学性。
脐带间充质干细胞的制备和存储标准对于保证脐带间充质干细胞的质量和应用的安全性具有重要意义。
符合标准的脐带间充质干细胞可以应用于临床医学领域，对于治疗一些疾病和促进组织再生具有重要的作用。
因此，制定脐带间充质干细胞制备存储标准是当务之急，对于推动相关领域的研究和应用具有重要的意义。
中华行为医学与脑科学杂志2020年12月第29卷第12期Chin J Behav Med Brain Sci‘December2020,Vol.29,No.12•1061•・基础研究・人脐带间充质干细胞外泌体对创伤性脑损伤后神经功能的保护作用张震文严菁兴I彭晓明I唐珂'李晓红"'甘肃中医药大学附属医院脑病科，兰州730000；2甘肃中医药大学中西医结合学院，兰州730000；3中国人民武装警察部队特色医学中心脑科中心，天津300072；"天津大学医学工程与转化医学研究院300072通信作者：李晓红,Email:lixiaohongl2@【摘要】目的探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCM-SCs)外泌体对创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后神经保护的作用及可能机制。
方法分离、培养HUMSCs并提取外泌体，使用透射电镜和蛋白免疫印迹方法进行外泌体鉴定;将60只健康雄性SPF级SD大鼠按照随机数字表法分为3组，分别为假手术组5=20)、TBI对照组5=20)、外泌体治疗组5=20),采用电子脑皮质损伤撞击仪建立大鼠TBI模型，采用改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score,mNSS)和Morris水迷宫实验(Morris water maze,MWM)评估大鼠的神经功能运动和空间记忆功能，使用免疫荧光法检测胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和小胶质细胞特异性蛋白离子钙结合衔接分子1(ionized calcium binding adaptor molecule-1,IBA1)活化表达水平。
TUNEL检测大脑皮质损伤区细胞凋亡的变化。
人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析摘要：目的：探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学。
方法：培养人脐带间充质干细胞并采用超滤序贯超离法提取外泌体，通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、蛋白质定量、蛋白质印迹法及蛋白组学分析等技术鉴定。
结果①所抽取的外泌体分散度比较好，而且均匀。
②，外泌体粒径分布的高峰为（129.5+8.7) nm，它的膜表面是带有负电荷的，其浓度为8.375>109颗粒/ml，平均 zeta电位为（-28.1+3.6) mV。
③ 外泌体中存在着一类特殊的膜蛋白，即CD9,CD63等。
④蛋白质组学研究发现外泌体中的大部分蛋白都具有较高的活性，它们涉及到 RNA剪接、 mRNA加工、蛋白质折叠等生物学过程，涉及到 RNA/DNA等基因材料的合成、加工、降解等过程。
结论：经研究发现，人脐带间充质干细胞外泌体与其母系细胞存在某种“同质”、“差别”，且这些“差别”的蛋白质功能与其自身的免疫学特性都不相关，从而证实人脐带间充质干细胞外泌体具有较小的免疫学活性及较高的安全性。
关键词：人脐带间充质干细胞；外泌体;蛋白组学:免疫原性引言：间充质干细胞起源于中胚层，它是一种能够在各种组织中进行定向分裂并进行自身增生的干细胞，它可以从各种组织中被提取，比如脐带、子宫内膜息肉、月经期血液、骨髓、脂肪组织等，由于它的来源多样化，并且可以大规模地获取，所以它在实验和临床上都有着非常重要的研究价值。
本课题拟通过分离人脐带间充质干细胞源性外泌体，并通过比较两者的蛋白质组水平上的差别，验证其在体外的免疫活性，进而验证其在临床上的应用前景，并评估其在临床应用中的应用前景。
一、资料与方法1.1一般资料选取本企业2021年8月至2022年8月该时间段接受人脐带充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学分析的足月产新生儿脐带50例。
1.2方法1．2.1人脐带间充质干细胞培养及鉴定(1)人脐带充质干细胞的原代培养法：6小时之内，对所收集的脐带进行清洗，并将其两侧有瘀斑或瘀斑的部位，用 PBS对其周边及脐静脉进行彻底的清洗，并将其切割为1毫米×1毫米×1毫米的小段，并将其放置在18 wt的 DMEM全培养剂（Rh)+1 wt青链霉索 V+ DMEN （DMEM）浸润的T75玻璃瓶底部，底部向上，放置在37℃，5%体积分数的 DMEM全培养剂（DMEM）浸润的玻璃瓶中，2小时后将玻璃杯倒置，倒入5 mL DMEM全培养剂，第2日再更换玻璃杯，并用2 mL TrypL酶解，使其达到70%-80%的水平，按1:4的比例进行传代，获取生长良好3-6代细胞。
E6(R2)人用药品注册技术要求国际协调会ICH协调指导原则ICH指导委员会2016年11月9日当前版本：第四阶段中文编译：中国GCP联盟 & 临床研究大汇E6(R1)译者序公元1996年，ICH-GCP正式发布R1版，彼时之中国，了解GCP的人仅限于当时中国卫生部培养的数百名医学专家，规范的临床试验法规与体系还在起草中。
1998年3月卫生部而发布了中国第一部GCP（试行），同年5月实施；1998年国务院机构改革成立了国家药品监督管理局，1999年9月1日实施的《药品临床试验管理规范》（局令13号，已废止），在整整4年之后的2003年9月1日，我国的GCP，《药物临床试验质量管理规范》（局令第3号）颁布实施并持续至今。
受制于起步阶段的能力所限，我们的GCP法规只有70条款共计12998字，而对比ICH-GCP则有383条款共计27936单词。
R1版的ICH-GCP，2003年国家药监局中国药品生物制品检定所获权组织专家翻译，才有过中文版（未曾公开发布），陆续有过多个版本的企业/组织发布版本，而以国家药品审评中心（CDE）发布的官译稿件，时间却很明确，是在2016年8月5日才得以发布（如下图）。
可以说，无论是标准的水平高低还是时代的步伐快慢，我们都曾落后了太多太多。
人生如梦，岁月如歌，春去秋来，夏行冬至。
二十载岁月匆匆而过。
2016年11月30日，ICH正式颁布了GCP的增补件R2，标志着全球药物临床试验进入到了一个崭新的时代，无独有偶，仅仅过去了2天，2016年12月2日，中国国家食品药品监督管理总局发布了《药物临床试验质量管理规范》的第二次征求意见稿，大量新内容参考了ICH-GCP R1甚至R2，意见稿直接以超30000字的信息量向全中国全世界展现它的雄心：今天的和未来的中国药物临床试验，在经历了蹒跚学步与青春期的躁动之后，正大幅度的向着国际先进水平看齐。
天行健，君子当自强不息，“中关村玖泰药物临床试验技术创新联盟/中国药物临床试验机构联盟”携手“临床研究大汇”，有志于协助我国临床研究行业在这次革新中及时跟上时代潮流，我们在R2发布后的7日内，参考借鉴CDE的R1中文版，完成了中文版的翻译与校对工作，在此时正式向全球华语用户推送，由于时间紧，我们的工作可能有不足之处，在此虚心并诚恳的接受所有批评意见。
送检中检院间充质干细胞质量标准以下是经过修改的文章：种子细胞（P2代）质量标准人脐带间充质干细胞P2代种子细胞的质量标准应包括以下检测项目：生物学属性】细胞形态：细胞贴壁生长时，应呈梭形，类似成纤维样细胞。
细胞计数：使用细胞计数仪检测，标示量的90%～120%。
细胞活率：不低于85%。
CD 90、CD 73、CD 105等细胞表面抗原分析。
CD44、CD166、CD 45、CD 34、CD79a或CD19、CD 14、HLA-DR等细胞表面抗原分析。
微生物学安全性检查】无菌：使用凝胶法和培养法检测，结果应为阴性。
需氧菌及真菌、厌氧菌及真菌、内毒素、支原体等微生物学安全性检查。
生物学活性检查】诱导分化能力检测：检测是否具有成骨成脂诱导分化潜能。
成瘤性检测：使用软琼脂克隆生长试验，结果应为无克隆形成。
成骨成脂诱导分化染色法：检测是否具有成骨成脂诱导分化潜能。
全自动血培养仪监测和系统检测。
成品细胞（P4代）的质量标准人脐带间充质干细胞P4代成品细胞的质量标准应包括以下检测项目：生物学属性】细胞形态：细胞贴壁生长时，应呈梭形，类似成纤维样细胞。
细胞计数：使用细胞计数仪检测，标示量的90%～120%。
细胞活率：不低于95%。
CD 90、CD 73、CD 105等细胞表面抗原分析。
CD44、CD166、CD 45、CD 34、CD79a或CD19、CD 14、HLA-DR等细胞表面抗原分析。
微生物学安全性检查】无菌：使用凝胶法和培养法检测，结果应为阴性。
需氧菌及真菌、厌氧菌及真菌、内毒素、支原体、逆转录病毒等微生物学安全性检查。
生物学活性检查】诱导分化能力检测：检测是否具有成骨成脂诱导分化潜能。
成瘤性检测：使用软琼脂克隆生长试验，结果应为无克隆形成。
成骨成脂诱导分化染色法：检测是否具有成骨成脂诱导分化潜能。
全自动血培养仪监测、系统检测和荧光RT-PCR核酸检测、荧光PCR核酸检测等微生物学安全性检查。
本文介绍了成骨成脂诱导分化染色法和软琼脂克隆生长试验，这些方法可以评估干细胞的潜能。
大剂量人脐带间充质干细胞制剂给予CD-1小鼠的安全性评价何洁;赵晶;王金祥;蔡学敏;朱向情;马丽花;庞荣清;潘兴华【摘要】目的观察单次大剂量输入自制的人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)制剂的急性反应,为临床研究提供安全保障.方法 60只SPF级CD-1小鼠随机分为阴性对照组、溶剂对照组和制剂组,每组雌雄各半(n=10),制剂组按1×108个细胞/kg 的剂量给CD-1小鼠单次静脉注射hUC-MSCs制剂,阴性对照组和溶剂对照组分别输注同等容量的0.9％氯化钠注射液和勃脉力A溶液.输注后连续观察小鼠的临床表现、体重和摄食量.观察15 d后,将动物安乐死,进行大体解剖,观察并行组织病理学分析.结果实验期间,制剂组1只小鼠输注细胞的尾尖静脉处出现细胞堆积,引起局部毛细血管堵塞,从而导致尾尖部组织坏死.其余动物均未见异常表现和体重、食量差异,大体解剖和组织学观察未见明显与输注细胞相关的病理改变.结论hUCMSCs制剂单次静脉注射给予CD-1小鼠无急性毒性反应.【期刊名称】《西南国防医药》【年(卷),期】2016(026)012【总页数】4页(P1362-1365)【关键词】脐带;间充质干细胞;急性毒性实验;CD-1小鼠【作者】何洁;赵晶;王金祥;蔡学敏;朱向情;马丽花;庞荣清;潘兴华【作者单位】650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室,云南省干细胞工程实验室,昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室,云南省干细胞工程实验室,昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室,云南省干细胞工程实验室,昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室,云南省干细胞工程实验室,昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室,云南省干细胞工程实验室,昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室,云南省干细胞工程实验室,昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室,云南省干细胞工程实验室,昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室,云南省干细胞工程实验室,昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R318.1人脐带间充质干细胞 (human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)来源于脐带的胶状结缔组织，具有一定的多向分化潜能及抗炎和免疫调控能力[1-3]。
动物模型治疗实验和一些临床研究证实，hUC-MSCs对肝损伤、脊髓损伤、退行性病变、移植物抗宿主排斥反应（GVHD）以及自身免疫性疾病等有治疗意义[4-5]。
为推进hUC-MSCs的临床转化应用，本课题组按临床生物制剂标准研发出1种“hUC-MSCs注射液”，为保证临床应用的安全性，本实验观察了单次静脉给予较大剂量hUC-MSCs制剂的急性毒性反应。
1.1 主要试剂 hUC-MSCs制剂来源于本院生物治疗中心干细胞库，批号为P2*******，浓度为2× 106个/ml，性状为微黄色细胞悬液，保存条件为液氮保存；含5%人血白蛋白（广东卫伦生物制药有限公司）和10%DMSO（Bioniche Pharma USA LLC）的复方电解质溶液（上海百特医疗用品公司）。
1.2 实验动物 60只SPF级的CD-1(ICR)小鼠，雌雄各半，雌性体重19.4～22.1 g，雄性17.8～22.4 g，同性别动物的体重均在平均体重的20%范围内，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。
小鼠饲养于装有垫料的聚丙烯鼠盒中，鼠盒规格为295 mm×195 mm×125 mm，雌雄分养，每盒最多饲养同性别5只动物。
动物自由摄食，自由摄水。
1.3 hUC-MSCs制剂制备阴性对照剂为市售0.9%氯化钠注射液；溶剂对照剂为用勃脉力A配制终浓度含有1%人血白蛋白、2%DMSO和1050 IU/ 10 ml(约1050 IU/4×107细胞)低分子肝素钙的溶液。
hUC-MSCs制剂的配制：首先用勃脉力A配制成含有1%人血白蛋白的制剂A溶液。
将细胞冻存袋自液氮中取出，迅速置于40℃水浴中，快速融化后，将细胞用适量制剂A稀释，使细胞充分混悬后，用台盼蓝染色，计数细胞活率≥90%。
加入约10倍体积的制剂A，离心洗涤细胞3次，用终浓度含1%人血白蛋白、2%DMSO和1050 IU/4×107个细胞的低分子肝素钙的勃脉力A溶液稀释细胞浓度为4× 106个/ml，冰盒保存和运输。
配制后4 h内完成输注。
1.4 hUC-MSCs制剂输注方法输注细胞前1 d，从66只动物中挑选检疫合格、体重相近的60只动物（雌雄各半），用区段随机分组法，按性别分为两个区段，用Excel软件给予每只动物一个随机数，并按照随机数从小到大的排序，将小鼠分为3组，每组雌雄动物各10只。
制剂组输注剂量为1×108个细胞/kg、浓度为4×106个细胞/ml，3组输注容量均为25 m l/kg。
临床拟用剂量为1×106个细胞/kg体重，制剂组用量相当于临床拟用剂量的100倍。
阴性对照组和溶剂对照组分别输注同等容量的0.9%氯化钠注射液和勃脉力A溶液（含1%人血白蛋白、2%DMSO和1050 IU/4×107个细胞的低分子肝素钙）。
用1 ml一次性无菌注射器输注，吸取细胞液前轻轻摇晃，经小鼠尾静脉注射，输注细胞速度约为3～4 min/只，单次输注。
1.5 观察指标输注后笼旁观察，1 h内每15 min观察记录1次，1～4 h内每1 h 观察1次。
输注第8 d和第15 d观察小鼠的精神状态、行为活动、皮肤、被毛、眼、耳、鼻、腹部、外生殖器、肛门、四肢、足和呼吸等情况。
输注后次日开始，每天上午和下午各1次，笼旁观察动物死亡或濒死情况、精神状态、行为活动、进食情况、粪便性状等，连续观察14 d。
分别在输注前1 d（D1）和输注后的第 8 d（D8）、第15 d（D15），测定动物体重。
每周加料1次，第8 d、第15 d称量剩余饲料，据加料量和剩余饲料计算平均每天每只动物食量。
食量以±s表示，但不进行统计学分析，根据动物体重和食量的变化趋势以及临床观察结果和病理检查，综合判断制剂的急性毒性反应情况。
1.6 病理学观察输入细胞15 d后，小鼠经CO2麻醉后，股动脉放血安乐死，进行大体解剖。
对所有组织脏器进行原位观察，记录肉眼可见异常，并对异常组织或器官进行组织病理学检查。
1.7 统计学方法应用SPSS15.00软件对不同组别动物的体重进行统计学分析，雌雄分开，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，假设检验水准为α=0.05，结果分析时同时考虑统计学意义和生物学意义。
2.1 临床表现动态观察情况制剂组1只雄性小鼠于给药后4 min，出现精神不振、俯卧和自主活动减少，于输注次日恢复；输注后22 min注射局部血管呈紫黑色线状，输注次日尾部呈紫黑色，输注后第4 d尾部基本恢复正常，仅尾尖部略呈紫黑色，之后变为黑色；输注后第10 d尾尖部黑色区域脱落，断开部位略呈红色肿胀，持续至观察期结束。
除此之外，实验期间，其他动物各时间段均未见异常临床反应。
2.2 体重变化与同期同性别阴性对照组相比，其他两组的体重均呈正常增长，差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。
2.3 食量变化与同期同性别阴性对照组相比，其他两组的食量未见明显差异（P＞0.05，表2）。
2.4 病理学变化制剂组出现异常反应的雄性小鼠大体观察可见尾尖部略肿胀，镜下主要表现为尾尖部皮肤表皮细胞肿胀，皮下水肿伴中性粒细胞浸润，局灶皮肤全层坏死结痂，但尾部注射部位血管及其周围组织未见明显异常改变。
考虑该病变可能是由于输注局部细胞堆积，引起局部毛细血管堵塞，从而导致尾尖部组织坏死（图1）。
除此之外，其他动物大体观察均未见明显异常。
基于间充质干细胞广泛的应用前景，本研究在前期开发了一种复苏后可直接应用于临床的hUC-MSCs制剂的基础上，进行了hUC-MSCs制剂的急性毒性试验。
本研究采用的是高于临床拟使用剂量的100倍静脉回输动物体内，观察其急性毒性反应。
在动物选择方面，CD-1小鼠遗传背景清楚，对药物的反应比较稳定，个体差异较小，饲养方便，体形较小，便于实验操作，是毒理学试验中常用的实验动物之一。
实验期间，仅有制剂组1只动物因为输注细胞局部堆积引起局部毛细血管堵塞，从而导致尾尖部组织坏死，其余均未出现与输注细胞相关的急性毒性反应。
本实验结果表明，单次静脉注射给予CD-1小鼠最大耐受剂量（MTD）≥1×108个细胞/kg，为临床安全使用提供可靠的动物实验依据。
【相关文献】[1] Seshareddy K，Tro yer D，Weiss ML. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord[J]．Methods Cell Biol，2008，86(1):102-118.[2] Mitchell KE,Weiss ML,Mitchell BM,et al.Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia[J].Stem Cells,2003,21: 50-60.[3] Chamberlain G,Fox J,Ashton B,et al.Concise review: mesenchymal stem cells:their phenotype,differentiation capacity, immunological features,and potential forhoming[J].Stem Cells, 2007,25(11):2739-2749.[4] Ringden O,Le Blanc K.Mesenchymal stem cells for treatment of acute and chronicgraft-versus-host disease，tissue toxicity and hemorrhages[J].Best Pract Res Clin Haematol，2011，24（1）：65-72.[5] MacDonald GI，Augello A，De Bari C.Role of mesenchymal stem cells in reestablishing immunologic tolerance in autoimmune rheumatic diseases[J].Arthritis Rheum，2011，63（9）：2547-2557.[6] Kadivar M,Khatami S,Mortazavi Y,et al.In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells[J].Biochem Biophys ResCommun,2006,340(2):639-647.[7] Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for cellular therapy position statement[J]. Cytotherapy,2006,8(4):315-317.[8] Wakitani S,Saito T,Caplan AI.Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine[J]. Muscle Nerve,1995,18(12):1417-1426.[9] Pittenger MF,Martin BJ.Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics[J].Circ Res,2004,95(1):9-20.[10] 唐欣,王岩,易海波,等.人脐带间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的特异性基因表达[J].中国组织工程研究,2013,17(27):4988-4991.。
