双水相萃取详细资料PPT课件( 44页)

两种亲水性聚合物混合
1 混合熵的增加 —自发进行—分子的数目 2 分子间作用力 —分子间各基团相互作用之
和——分子的大小 • 对大分子而言，由于相对分子质量较大，
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
只有当P和Q达到一定浓度才能形成两相
双节线
系线
（具体的证明过程省略）
系线的长度是衡量两相间差别的尺度， 系线越长两相间的差别越大，反之越 小。
当系线向下移动时，长度逐渐减小， 这说明两相的差别减小，当达到K点 时，系线的长度为0，两相间差别消 失，点s成为临界点。
（三）分配理论
和溶剂萃取法一样，蛋白质在两水相间的分 配，有分配系数
无言。缘来尽量要惜，缘尽就放。人生本来就空，对人家笑笑，对自己笑笑，笑着看天下，看日出日落，花谢花开，岂不自在，哪里来的尘埃!
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5、心情就像衣服，脏了就拿去洗洗，晒晒，阳光自然就会蔓延开来。阳光那么好，何必自寻烦恼，过好每一个当下，一万个美丽的未来抵不过一个温暖的现在。
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6、无论你正遭遇着什么，你都要从落魄中站起来重振旗鼓，要继续保持热忱，要继续保持微笑，就像从未受伤过一样。
A、双水相体系同生物转化相结合：
B、双水相萃取同膜分离技术相结合： C、双水相萃取同亲和层析相结合——亲和
萃取（亲和分配）：
亲和分
配 蛋白质在两水相系统中的分配系数一般不是很大，为了提高分
配系数和萃取效率，可将亲和层析与两水相萃取结合起来，成 为亲和萃取或亲和分配，即把一种配基与一种成相聚合物以共 价相结合，使该配基随成相聚合物分配在某一相中。配基可也 是酶的底物，抑制剂，抗体，受体或染料等，对目标蛋白质有 很强的生物亲和力，因而使后者倾向于分配在配基—聚合物的 相中。 通常选择在PEG上接上配基，当配基—PEG的浓度增加时，蛋 白质的分配系数也增加。当蛋白质的结合位点都为配基所占据 时，即达到饱和，蛋白质的分配系数达到极大值。
双水相萃取
方盼 赵梅
目录
（一）两水相的形成 （二）相图 （三）分配理论 （四）影响分配的参数 （五）应用
Question
• 常用的溶液萃取法能用来提 取生物大分子如蛋白质吗？
Reason
大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相 蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活 有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。
（四）影响物质分配平衡的因素
主要有聚合物的分子量和浓度/pH/演的种类 和浓度/温度等。适当的选择各参数即在最 适条件下，可达到较高的分配系数和选择 性
成相聚合物的相对分子质 量
当聚合物相对分子质量降低时，蛋白质易 分配于富含该聚合物的相中。
例如：PEG/DX系统中当PEG的分子量降低时，会
作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形
成均相的高聚物水溶液
• 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在 达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相 中。
• 高聚物与高聚物形成两相是由于高聚物的不相容 性
• 高聚物与无机盐溶液也能形成两相，这是由于盐 析作用。
• 生化工程中，多应用聚乙二醇—-葡聚糖和聚乙二 醇-无机盐系统。
• 双水相系统平衡时间短，含水量高，界面张力低 ，成相聚合物对蛋白质有稳定作用，为生物活性 物质提供了温和的分离环境
• 操作简便，经济省时，易于放大.由于很容易达到 平衡，用商业上的离心机能使相分离完全，分配 系数的值重演性很好，故可直接放大
• 改变体系的pH和电解质浓度可进行反萃取
工艺方 面 应用范围：
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9、与其埋怨世界，不如改变自己。管好自己的心，做好自己的事，比什么都强。人生无完美，曲折亦风景。别把失去看得过重，放弃是另一种拥有;不要经常艳羡他人，
人做到了，心悟到了，相信属于你的白，在世上，你就是你，你痛痛你自己，你累累你自己，就算有人同情你，那又怎样，最后收拾残局的还是要靠你自己。
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11、人生的某些障碍，你是逃不掉的。与其费尽周折绕过去，不如勇敢地攀登，或许这会铸就你人生的高点。
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12、有些压力总是得自己扛过去，说出来就成了充满负能量的抱怨。寻求安慰也无济于事，还徒增了别人的烦恼。
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13、认识到我们的所见所闻都是假象，认识到此生都是虚幻，我们才能真正认识到佛法的真相。钱多了会压死你，你承受得了吗?带，带不走，放，放不下。时时刻刻发
胞内酶的提取（双水相系统可用于除去细胞破碎后 的匀浆液中的碎片以及酶的进一步精制）
运用双水相法萃取需满足的条件： 1.欲提取的酶与细胞分配在不同的相中； 2.酶的分配系数足够大，使在一定的相体积比时， 经过一次萃取就能得到较高的收率； 3.两相用离心机很易分离。
通常将蛋白质分配在上相，而细胞碎片分配在下相 （盐）
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
下 相（盐相）
上相
（目标产物）
（PEG、杂蛋白、色素）
UF （PEG可循环使用）
提纯产品
多步萃取的目的是为了获得较高的纯化倍数。
小分子分离和
纯化 1990年科研人员发现在PEG/磷酸盐系统中，某些氨
基酸和青霉素的分配是不均匀的，例如：赖氨酸的分 配系数为0.23，而类黑素的分配系数为7.1，从而可将 二者分离。引起人们利用双水相分配分离纯化小分子 的兴趣，特别应用于从一些粘度大、难过率、易乳化 的发酵液中提取。 分离纯化小分子同样的也利用的是PEG/盐系统
双水相萃取技术的进展
廉价双水相体系的开发：
两种双水相体系的比较
体系
优点
缺点
高聚物/高聚物 高聚物/盐
盐浓度低，活性损 失小，可用离子交 换层析纯化
成本低，粘度小， 比较适合工业规模 的应用
成本高，粘度大，分相困难
盐浓度高，非盐水的处理比 较困难，活性损失大,界面吸 附多
双水相萃取技术同其他分离技术相结合
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7、生命的美丽，永远展现在她的进取之中;就像大树的美丽，是展现在它负势向上高耸入云的蓬勃生机中;像雄鹰的美丽，是展现在它搏风击雨如苍天之魂的翱翔中;像江
河的美丽，是展现在它波涛汹涌一泻千里的奔流中。
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8、有些事，不可避免地发生，阴晴圆缺皆有规律，我们只能坦然地接受;有些事，只要你愿意努力，矢志不渝地付出，就能慢慢改变它的轨迹。
K=C1/C2 C1代表上相浓度，C2代表下相浓度。当相
系统固定时，分配系数为一常数只取决于 被分离物质本身的性质和特定的双水相体 系，与蛋白质的浓度无关。
当物质进入双水体系后，由于表面性质/电 荷作用和各种力（如憎水键/氢键和离子键） 的存在和环境的影响，物质在上相和下相 间进行选择性分配，
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1、不是井里没有水，而是你挖的不够深。不是成功来得慢，而是你努力的不够多。
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2、孤单一人的时间使自己变得优秀，给来的人一个惊喜，也给自己一个好的交代。
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3、命运给你一个比别人低的起点是想告诉你，让你用你的一生去奋斗出一个绝地反击的故事，所以有什么理由不努力!
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4、心中没有过分的贪求，自然苦就少。口里不说多余的话，自然祸就少。腹内的食物能减少，自然病就少。思绪中没有过分欲，自然忧就少。大悲是无泪的，同样大悟
双水相系统
PEG = 聚已二醇 Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖
双水相萃取:
利用生物大分子在两种水相之间的分配比 例不同而达到分离纯化生物大分子的目的。
（二）相图
两种高聚物的水溶液，当它们以不同的比例 混合时，可形成均相或两相，这种水性两相 的形成条件和定量关系，常用相图来表示， 它是一条双节线。
盐类的影响
在双水相聚合物系统中，加入电解质，首 先阴阳离子会有不同的分配。
盐的正负离子在两相间的分配系数不同， 由于各相应保持电中性，因而在两相中形 成电位差，这对带电生物大分子的分配， 产生很大的影响。
K-＞1 分配在上相 K+≈1 分配在下相
在pH6.9时溶菌酶带正 电，卵蛋白带负电。当 加入NaCl时，其浓度低 于50mmol/L时可见上 相电位低于下相电位， 使溶菌酶分配在上相， 从而分配系数增大。 而卵蛋白的分配系数减 小，。
pH的微小变化会使蛋白质的分配系数 改变2～3个数量级。
温度
温度影响相图，特别在临界点附近，因而 也影响分配系数，
温度越高发生相分离所需的高聚物浓度越 高
工业方面 应 用
小分子分离和纯化
技术的新发展
双水相萃取系统的优点
• 直接从cell碎片匀浆中萃取prot、而无需将细胞 碎片分离
三步两水相萃取酶的流程：
细胞匀浆液
第一步双水相萃取
+PEG +盐（或是葡聚糖）
分离机
下相 ） 细胞碎片
杂蛋白 （核酸、多糖）
上 相（PEG相
（目标产物）如prot、E +盐
第二步双水相萃取 静置分层
下 相（盐相） 核酸多糖
上 相（PEG相） 目标产物
杂蛋白
（亲水性较强）
+盐
第三步双水相萃取 静置分层
so
•通常的溶剂萃取法应用于提取生物大分子是有 困难的； •但双水相萃取法含水量高，接近生理的环境中 进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性
双水相体系简介
• 1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂和 可溶性淀粉的水溶液混合时先得到一个混 不透明的溶液，随之分为两相，上相富含 明胶，下相富含琼脂（或淀粉），这种现 象被称之为聚合物的不相溶性，从而产生 了双水相体系。