labrlfree非标记定量蛋白质组学的分析方法

百泰派克生物科技
蛋白半定量，定量，绝对定量
在蛋白质分析中主要对定性分析和定量分析进行研究，定量分析就是对蛋白样品的含量进行鉴定，可以分为定量、半定量、相对定量和绝对定量。

蛋白定量很容易理解，那什么又是半定量、相对定量和绝对定量呢？今天小编就和大家聊聊这个问题。

蛋白定量就是对某蛋白样品进行精确的定量鉴定，其测定结果较接近真实值，可信度高。

通常利用标记（iTRAQ、TMT、SILAC等）或非标记（Label Free）策略进行
蛋白定量研究。

蛋白半定量不是指对一半的蛋白质进行定量研究，而是指在某些特殊情况下，如难以直接对蛋白质含量进行测定或蛋白含量易发生周期性波动时，只能对蛋白质的含量进行粗略的、大致的鉴定，所得到的结果是近似的测量值，精确度远不如定量分析。

蛋白相对定量，又称为比较定量，是将两种蛋白质在不同状态下的表达量或含量进行相对比较分析，常用于检测不同生理或病理状态下蛋白含量的变化。

蛋白绝对定量是对各类蛋白进行浓度或含量的绝对分析，可以对组织、体液或细胞蛋白质组中的每一种蛋白质进行绝对含量和浓度分析，是一种靶向定量蛋白组学技术，常用于蛋白质或其修饰状态的定量分析。

目前主要利用内标法或基于质谱的非标记方法进行蛋白绝对定量研究。

百泰派克生物科技基于高分辨率质谱仪结合丰富的生物信息学分析经验，提供高效精准的蛋白质定量服务技术包裹，能够实现蛋白质定量、半定量、相对定量、绝对定量、标记定量以及非标记定量等分析，欢迎免费咨询。

素酶, 果胶酶, 溶细胞酶)
细胞破碎方法
2）剧烈裂解方法 (固体组织, 酵母菌)
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超声裂解法 (Sonication) 弗氏压碎器（French press pressure cell） 研磨法（Grinding，mortar and pestle) 机械匀浆法（Mechanical homogenization） 玻璃珠匀浆法
基本原则： （1）全息性（keep all of protein information），尽 可能的制备所有蛋白； （2）样品制备的方法还必须与后续的分离或鉴定方法相匹 配，如采用双向电泳，需要谨慎使用SDS抽提蛋白质；如 果用液相色谱分离，不应该用太多的去污剂和两性电解 质(considering following protocols/kits ) ； （3）由于样品来源千差万别，针对不同来源的样品（如细 胞样品、动物组织样品、植物样品、体液等），需要采 取不同的蛋白质抽提方法 (Different samples, different
基于胶染色和基于液相质谱联用 同位素标记和非同位素标记 体内标记和体外标记
二 双向凝胶电泳
双向凝胶电泳的原理 双向凝胶电泳技术操作的基本过程 双向凝胶电泳的优缺点
1 常规双向电泳
• 一、双向电泳概述： 双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)的基本原理是利用蛋 白质的等电点（pI)和分子量(Mr)不同而分离蛋白质：第一向电泳——等电聚 焦（Isoelectric Focusing，IEF）根据蛋白质的等电点不同将蛋白质分离， 第二向电泳——十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS—PAGE）利用蛋白质的 分子量大小不同将蛋白质分离。 双向电泳一次可以从细胞、组织或其它生物样本中分离上千种蛋白质， 凝胶上的斑点都对应着样品中的蛋白质，且各种蛋白质的等电点，分子量和 含量的信息都能通过质谱鉴定和软件分析获得。因此其在蛋白质组分析、细 胞差异分析、药物开发、工业菌株生理比较等领域都得到了广泛的应用。 二：双向电泳分离蛋白质混合物具有以下优势： 1、经典方法、应用范围广、适用于各类材料； 2、经济实惠，可大规模多个样本筛选和分析。

泛素化label free蛋白组学的具体步骤及方法
泛素化是一种广泛存在的翻译后修饰（PTMs）。

泛素化是指泛素（一类低分子量的蛋白质）分子在一系列特殊的酶作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并对靶蛋白进行特异性修饰的过程，与蛋白质降解和功能调控密切相关的翻译后修饰形式。

泛素化在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用，同时它也参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控，与肿瘤、心血管等疾病的发病密切相关。

带有泛素化修饰的肽段比例很低，其他大量存在的肽段会影响泛素化肽段质谱信号的鉴定，因此在质谱检测前需要对泛素化肽段进行富集。

Trypsin酶切后的泛素化修饰是一个较小的Motif（K-GG），采用具有高亲和力的基序抗体，能够特异性富集复杂样本中的泛素化肽段，结合label free蛋白质定量方法，实现大规模泛素化蛋白质定性定量分析。

技术流程。

百泰派克生物科技BTP客户案例：利用Label free定量蛋白组学分析decoctosomes的蛋白质组成期刊：Science China Life Sciences；影响因子: 7.5873。

原文链接：DOI: 10.1007/s11427-018-9508-0。

研究对象：红景天和蒲公英汤剂。

研究目的：sRNAs在汤剂热处理后存活并进入细胞的机制研究。

研究手段：label free定量蛋白组学等。

研究内容及结论：草药服用一般是服用用水煮沸的药草熬制出的汤汁。

有报道发现，小RNAs（sRNAs）也是汤剂中的功能成分。

然而，sRNAs在汤剂热处理后存活并进入细胞的机制尚不清楚。

研究表明，植物来源的类外泌体纳米颗粒（ELNs），botanosomes，可以在体内传递治疗剂。

该研究报道了来自红景天和蒲公英汤剂中的热稳定decoctosomes（ELNs），其体外治疗效果优于汤剂，且有体内治疗功效。

此外，decoctosomes中的sRNAs，例如HJT-sRNA-m7和PGY-sRNA-6，分别表现出较强的抗纤维化和抗炎效果。

该研究发现，Decoctosome由脂类、小分子物质、蛋白质和sRNAs组成。

将decoctosome中鉴定出的一种脂质鞘氨醇（d22:0）与合成的sRNAs混合加热，形成最简单的bencaosome，bencaosome是decoctosome药物的类似物。

通过临界胶束浓度（cmc）分析鉴定了这种简单的bencaosome结构，发现sRNAs与鞘氨酸（d22:0）共同组装形成了囊泡的脂质层。

加热过程能够促进sRNAs和鞘氨酸（d22:0）的共同组装，直到其达到稳定状态。

在小鼠中，口服给药人工合成的bencaosomes，鞘氨酸-HJT-sRNA-m7和鞘氨酸-PGY-sRNA-6，可分别改善博莱霉素诱导的肺部纤维化和poly（I:C）诱导的肺部炎症。

因此，模拟decoctosomes的bencaosomes可能是一种新颖而有效的医学治疗方法。