非标记定量蛋白质组学具体步骤及方法

蛋白定量质谱质谱在普通的蛋白定量和蛋白质翻译后修饰研究中都已有广泛应用，已成为蛋白质组定量最主要的分析技术之一。

根据是否对目标蛋白进行定量可分为非靶定量和靶向定量。

非靶定量根据是否进行标记，又能分为非标记定量和标记定量。

一些根据科研临床需要保留下来的稳定又实用的蛋白定量质谱技术，仍然在不断完善和发展当中。

曾经宣传更广的能标记到8个样本的iTRAQ，目前已逐渐被能标记到16标的TMT超越。

而因为还要预先建库受到限制的DIA，技术已经成熟到能够放飞自我，不用预先DDA建库就可以进行鉴定，也已经能应用到磷酸化等修饰组学的分析当中。

下面就来汇总介绍一下当下蛋白非靶向定量主流技术的进展和应用。

非靶向定量蛋白质组学（Untargeted quantitative proteomics）技术是对样品中所有蛋白进行无差别的定量，方法有两类，标记和不用标记的定量。

>>标记定量在不同蛋白质样品中添加同位素标记，称为标记定量技术。

目前具有代表性的为体外化学标记的TMT（Tandem Mass Tag）技术。

①TMT原理标记定量的关键在标记试剂，用的是同位素的原理，通过将不同的同位素标签与肽段特异氨基酸位点相连实现不同来源的肽段标记。

TMT现在有6plex、10plex、11plex和16plex同位素标签，每种都有一个试剂盒，比如10plex就是包含了10种质量和化学结构相同、元素种类不同的同位素化合物（即同量异位素化合物）的标记，每个标记都由Amine Reactive group、Mass Normalizer和Mass Reporter组成。

Mass reporter用不同类型同位素形成几种分子量，Mass Normalizer进行分子量消减，保证每个标记Mass reporter相对分子质量和Mass Normalizer相对分子质量加起来是相等的。

比如3个质量报告基团相对分子质量分别是126、127、128，那质量调整区相对分子质量就是103、102、101，加起来都是229。

文章编号：１００３ ２７５４（２０２３）０７ ０６３６ ０５ ｄｏｉ：１０．１９８４５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｚｆｙｓｊｊｂｚｚ．２０２３．０１４６应用非标记定量蛋白组学研究帕金森病差异表达蛋白龙云飞１，　肖　飞２，　李淑华１，　苏　闻１，　陈海波１收稿日期：２０２３ ０５ １１；修订日期：２０２３ ０６ ２０基金项目：国家重大疾病多学科合作诊疗能力建设项目作者单位：（１．北京医院神经内科，国家老年医学中心，中国医学科学院老年医学研究院，北京１００７３０；２．北京医院国家老年医学中心，国家卫生健康委北京老年医学研究所，国家卫生健康委老年医学重点实验室，中国医学科学院老年医学研究院，北京１００７３０）通信作者：陈海波，Ｅ ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｈｂｎｅｕｒｏ＠２６３．ｎｅｔ 摘　要：　目的　寻找帕金森病（ＰＤ）患者血清中差异表达的蛋白，探索ＰＤ生物学标志物。

方法　选择在北京医院临床确诊的ＰＤ患者２４例，其中１２例为仅有ＰＤ病史（Ｐ１组），另１２例合并有高血压病、糖尿病基础疾病（Ｐ２组）；筛选２４例年龄、性别匹配的体检者（对照组Ｃ１和Ｃ２组），采集血清标本去除高丰度蛋白后，应用非标记定量蛋白组学技术检测各组血清中蛋白表达，采取双重对比将Ｐ１组与Ｃ１组、Ｐ２组与Ｃ２组比较，分别筛查出差异表达蛋白，再从中筛选出表达变化（上调或下调）一致的蛋白，确定为ＰＤ差异表达蛋白，并用生物信息学方法分析解释。

结果　各组对比后，共鉴定出４种差异表达的蛋白为ＰＲＧ４、ＣＦＨＲ ３、ＡＣＴＧ１、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＦ，其中ＰＤ患者的血清中ＰＲＧ４、ＣＦＨＲ ３表达上调，ＡＣＴＧ１、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＦ表达下调且存在一定的相互作用。

结论　应用非标记定量蛋白组学筛选出了帕金森差异表达的蛋白，可能对帕金森病的诊断具有一定的意义。

关键词：　帕金森病；　非标记定量；　蛋白组学；　差异表达蛋白中图分类号：Ｒ７４２．５ 文献标识码：ＡＡｓｔｕｄｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＰａｒｋｉｎｓｏｎｄｉｓｅａｓｅｂａｓｅｄｏｎｌａｂｅｌ ｆｒｅｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ＬＯＮＧＹｕｎｆｅｉ，ＸＩＡＯＦｅｉ，ＬＩＳｈｕｈｕａ，ｅｔａｌ．（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ；ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＧｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ；ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｒｉａｔｒｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７３０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｆｏｒＰａｒｋｉｎｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ（ＰＤ）ｂｙａｎａｌｙｚｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘ ｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅｓｅｒｕｍｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＰＤ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｔｏｔａｌｏｆ２４ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＰＤｗｈｏｗｅｒｅｄｉａｇｎｏｓｅｄｉｎＢｅｉｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌｗｅｒｅｅｎｒｏｌｌｅｄ，ａｍｏｎｇｗｈｏｍ１２ｐａｔｉｅｎｔｓｏｎｌｙｈａｄａｍｅｄｉｃａｌｈｉｓｔｏｒｙｏｆＰＤ（ｇｒｏｕｐＰ１）ａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒ１２ｈａｄｕｎｄｅｒｌｙ ｉｎｇｄｉｓｅａｓｅｓｓｕｃｈａｓｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎａｎｄｄｉａｂｅｔｅｓ（ｇｒｏｕｐＰ２）．Ａｔｏｔａｌｏｆ２４ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ，ｍａｔｃｈｅｄｆｏｒａｇｅａｎｄｓｅｘ，ｗｈｏｕｎｄｅｒ ｗｅｎｔｐｈｙｓｉｃａｌｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｗｅｒｅｅｎｒｏｌｌｅｄａｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓＣ１ａｎｄＣ２．Ｓｅｒｕｍｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄ，ａｎｄａｆｔｅｒｈｉｇｈ ａｂｕｎ ｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｒｅｍｏｖｅｄ，ｔｈｅｌａｂｅｌ ｆｒｅｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｓｅｒｕｍ．ＴｈｅｄｏｕｂｌｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｇｒｏｕｐｓＰ１ａｎｄＣ１ａｎｄｂｅｔｗｅｅｎｇｒｏｕｐｓＰ２ａｎｄＣ２ｔｏｓｃｒｅｅｎｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈａｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｃｈａｎｇｉｎｇｔｒｅｎｄ（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｒｄｏｗｎｒｅｇ ｕｌａｔｉｏｎ）ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｆｏｒＰＤ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄａｎｄｉｎｔｅｒｐｒｅｔｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ ｉｃｓｍｅｔｈｏｄｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｇｒｏｕｐｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｆｏｕｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｉ．ｅ．ＰＲＧ４，ＣＦＨＲ ３，ＡＣＴＧ１，ａｎｄＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＦ，ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈＰＲＧ４ａｎｄＣＦＨＲ ３ｓｈｏｗｅｄｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＡＣＴＧ１ａｎｄＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＦｓｈｏｗｅｄｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｓｅｒｕｍｏｆＰＤｐａｔｉｅｎｔｓ，ａｎｄａｃｅｒｔａｉｎｄｅｇｒｅｅｏｆｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｌａｂｅｌ ｆｒｅｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＰＤ，ｗｈｉｃｈｍａｙｈａｖｅａｃｅｒｔａｉｎｖａｌｕｅｉｎｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＰＤ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：　Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ；　Ｌａｂｅｌ ｆｒｅｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏ ｔｅｉｎｓ 随着人口老龄化进程，帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｄｉｓ ｅａｓｅ，ＰＤ）的发病率也逐年升高，但临床上ＰＤ的诊断往往受限于临床医生的经验，目前还没有能很好诊断帕金森病的生物学标志物出现［１］。

第一部分蛋白质组学操作规程一、蛋白质组学样品制备规程（01 ）P1. 双向电泳样品缓冲液选用的基本原则P3. 细胞样品制备（分步）操作规程P4. 细胞总蛋白提取操作规程P5. 螺旋藻组织蛋白质提取方法P6. 嗜热菌蛋白质提取方法P7. TCA- 丙酮沉淀法样品制备操作规程P9. 植物材料可溶性蛋白的双乙法制备流程P10. 动物细胞的样品制备P10. 动物组织的样品制备——胃P11. 肺癌组织样品制备P12. 食管癌样品制备P13. 羊绒/毛蛋白提取P13. 大鼠海马组织蛋白提取P14. 使用Cibacron Blue 3GA Agarose 去除小鼠血浆/血清中的白蛋白P15. E.Coli 样品制备方法P15. 微生物细胞样品制备操作规程P16. 去除血浆/血清中的白蛋白和Ig-GP17. 植物根蛋白提取方法P17. 2D-LC鼠肝样品shotgun消化实验路线P18. 小鼠肝组织蛋白质提取方法P18. 小鼠肝脏亚细胞器蛋白质提取方法（线粒体胞浆微粒体） P25. 人肝蛋白质组织提取方法P27. 人肝脏亚细胞器蛋白质提取方法（线粒体胞浆微粒体）P27. 丙酮丁醇菌蛋白质提取方法（选用嗜热菌蛋白质提取方法） P27. 嗜碱菌蛋白质提取方法（尚在摸索阶段）P27. 脑脊液蛋白质提取方法二、蛋白质定量标准操作规程（02 ）P1. 改良的Bradford 法测定蛋白质含量P3. Lowry 法（DC 试剂）测定蛋白质含量P5. Lowry 法测定蛋白质含量（自配试剂）P7. 安玛西亚定量试剂盒使用方法P8. 利用微板（96 孔板）定量测定蛋白质浓度P9. BIO-RAD PROTEIN ASSAY 使用方法P10. BCA Protein Assay Kit 使用操作规程三、蛋白质电泳及凝胶染色操作规程（03）P1. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳P3. 固相pH 梯度-SDS 双向凝胶电泳实验操作程序P5. 平衡及SDS-PAGEP7. Western blotting Protocol（辣根标记ECL 显色方法碱性磷酸酶标记显色方法\DAB 等）P8. 考马斯亮蓝染色操作规程P8. 银染操作规程P10. ELISA 操作规程P12. 非变性聚丙烯跣胺蛋白质电泳操作方法P14. 梯度SDS-PAGE 的灌制及电泳四、图象分析软件操作规程（04）1. Phoretix 2D v2003.02 胶图分析软件操作规程2. Imagemaster platinum v5.0 操作指南.pdf五、蛋白质酶解操作规程（05）P1. 有还原烷基化蛋白质消化操作流程P2. 双向电泳考染点无还原烷基化胶内消化操作流程P3. 全蛋白溶液消化操作规程六、蛋白质组培训文档资料（06）1. 双向电泳培训班讲义（bio-rad ）2. 蛋白质电泳实验技术（书---郭绕军）3. GE 双向电泳中文手册七、实验仪器操作规范（07）P1. 超声波细胞破碎仪使用规范P1. 精密电子天平使用注意事项P2. 磁力搅拌器使用注意事项P2. PH 计使用注意事项P3. Ettan Dalt n System 操作规程（Amersham）P4. ETTAN DALT SIX 操作规程（Amersham）P6. 扫描仪使用规范P6. SE600 电泳系统操作规程（Amersham）P7. MINIVE 电泳系统操作规程（Amersham）P7. MP3 电泳系统操作规程（bio-rad）P8. Mp3 PROTEAN DODECA （7 厘米12道系统操作规程,bio-rad）P8. PROTEAN II XI 系统操作规程（bio-rad）P9. PROTEAN PLUS DODECA CELL 系统操作规程（bio-rad）P10. 国产制冰机使用方法P10. 国产恒温干燥箱使用方法P11. 国产脱色摇床使用方法P11. 干胶仪使用方法P11. 国产三孔水浴锅使用规范P11. 进口恒温水浴操作规程P12. HETO 冻干机操作规程P13. 小型低温离心机使用及保养程序八、肽质指纹图数据搜索操作规程（08）九、常用试剂配方表（09）1. 常用试剂配方表.xls2. 几种溶液的配制方法.doc十、质谱学实验方法（10）（1）Agilent LC-MSD 操作流程（01）（2）Autoflex tof 操作流程（02）（肽质指纹图数据搜索操作规程）（3）Ettan TOF 操作流程（03）（4）Finnigan LCQ 操作流程（04）（5）Ultraflex tof/tof 操作流程（05）（6）毛细管反相色谱柱制作流程（06）（7）柱效测试（07）Page 3 of 3。

蛋白质组阵列蛋白质组学目的是解析基因组全部的蛋白质组，并通过蛋白定量和定性上变化反映细胞、器官和有机体的生理变化；转录后调控和翻译后修饰使得组成蛋白的数量远远大于组成基因的数量。

随着生物质谱技术迅速发展，质谱技术已经逐渐成为了蛋白质组学分析的主流技术。

蛋白质的鉴定可以通过其特有肽段的序列来识别，质谱（MS）其扫描速度、灵敏度和分析复杂混合物的能力是一种非常适合分析蛋白质的技术。

其基本原理是通过蛋白质被胰蛋白酶解，然后用液相色谱（LC）的方法对酶解的肽段进行分离，基质辅助激光电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)是常用的对分离肽段离子的检测的方式，然后肽段离子在液相色谱的电离和洗脱，在质谱仪中确定其分子量，质谱仪会进一步分析其碎片的组成。

整个液相和质谱的工作流程就是我们常说的串联质谱（MS/MS），串联质谱识别它特定的氨基酸序列，再通过蛋白数据库及软件的进行分析后，就可以得到蛋白的定性和定量的结果。

Scoring proteomes with proteotypic peptideprobes蛋白质组的研究取决于实验技术策略、质谱的高分辨率和高灵敏度以及定量算法和软件更新；这些方法和技术上为定量蛋白质组学提供了研究手段和技术保障。

传统的蛋白质鉴定的方法：如免疫印迹法、化学测序法、凝胶电泳法通常来说比较费时费力且通量较低，不适合高通量蛋白质组学的研究。

质谱技术的出现使得传统技术应用更加广泛，比如二维凝胶电泳的技术与质谱的技术对蛋白进行鉴定（2DE 结合MALDI-TOF/MS）。

随着质谱技术的发展，也衍生出一些非二维凝胶电泳的分离技术，例如基于多维液相色谱分离的蛋白鉴定技术（MudPIT）、Top-Down的质谱、以及亚蛋白质组（Sub-proteomics）等等。

我们通常对是否样品进行稳定的同位素标记分为有标定量和无标定量两种方法，本次我们主要通过质谱结合同位素标记和无同位素标记的质谱方式进行总结。

定量蛋白质组学五种常用蛋白质组学定量分析方法对比。

百泰派克生物科技汇总介绍了五种常见定量蛋白质组学分析方法的优势和特点。

SWATH-MS数据可重复性研究。

SWATH在不同实验室间可重复性的研究。

这个研究统计了全世界11个不同的实验室中使用SWATH鉴定的数据重复度情况。

iTRAQ/TMT标签结构以及相对定量原理详解。

通过标记多组不同样品，iTRAQ和TMT能够同时比对正常组织样品和肿瘤组织样品的蛋白水平差异，以及精准检测肿瘤在发展的不同阶段的蛋白水平变化。

蛋白质定量技术及其在临床研究中的应用。

百泰派克采用高通量质谱平台提供蛋白质定量服务，包括定量蛋白质组学，蛋白质定量技术及其他蛋白质组学相关的服务。

百泰派克生物科技独立仪器分析平台，拥有多年蛋白质定量经验，竭诚为您服务。

蛋白组分析中dda和prm。

DDA和PRM是质谱不同的数据采集模式。

DDA主要用于非靶向蛋白质组学的研究，PRM则用于靶向蛋白质组学的研究。

百泰派克生物科技提供基于质谱的DDA、MRM/PRM和DIA蛋白质组学分析服务。

iTRAQ定量蛋白质组学。

iTRAQ蛋白质组学即iTRAQ定量蛋白质组学，是一种标记定量蛋白质组学，指利用iTRAQ标记技术和质谱技术对蛋白质组进行定量。

百泰派克生物科技提供基于质谱的iTRAQ定量蛋白质组学分析服务。

蛋白互作定量检测。

蛋白互作定量检测指对相互作用的蛋白质进行定量。

百泰派克生物科技提供基于质谱的SILAC与免疫共沉淀质谱联用的蛋白互作定量分析服务，可同时实现互作蛋白质组的定性和定量。

DIA蛋白质组学样品处理步骤。

DIA蛋白质组学指利用DIA技术（如SWATH）对样品中的蛋白质组进行检测分析。

百泰派克生物科技提供基于质谱的DIA蛋白质组学分析服务和蛋白质样品制备服务。

功能蛋白质组学。

功能蛋白质组学是蛋白质组学的一部分，其主要目的是研究蛋白质的功能和生命活动的分子机制。

百泰派克生物科技提供基于质谱的功能蛋白质组学分析服务。

非靶向蛋白组学定量技术: SILAC, iTRAQ, TMT定量蛋白组学的研究意义人类基因组完整图谱于2003年正式公布，这标志着生命科学的里程碑性事件——人类基因组计划的顺利完成，生命科学研究也进入了后基因组时代。

这一计划的初始目的是在基因层面研究人类疾病机制，设计基因药物，进行精准医疗。

但是时隔十多年年过去了，效果远没预期的理想。

其中主要原因可能是，我们现有的研究工作和背景知识不足以将庞杂的基因组数据直接同人类疾病联系起来。

而蛋白组学能更直观的将基因与疾病联系起来，逐渐成为研究热点之一。

定量蛋白组学是将某一基因组或者某一复杂体系表达的全部蛋白质进行鉴定和精准定量的学科，是蛋白组学研究的重要分支。

基于质谱的蛋白质定量20实际80年代中期出现了MALDI（基质辅助激光解吸附电离）和ESI（电喷雾电离）两种软电离方法，可以将蛋白质或者多肽离子化，从而引入质谱仪种进行定性和定量分析，从此生物质谱技术成为蛋白组学最重要的分析工具之一。

图1. 生物质谱仪器。

利用生物质谱技术，主要有两种蛋白组学研究策略：Top-down strategy：Top-down（自上而下法）通常的做法是，先利用二维凝胶电泳分离蛋白，再将完整蛋白直接离子化后引入质谱分析，借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对，从而实现对蛋白的鉴定。

Bottom-up strategy：Bottom-up（自下而上法）通常的做法是，先将样品用酶进行处理，多维色谱分离后引入质谱分析，再借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对，最后实现对蛋白的鉴定。

蛋白定量分为相对定量和绝对定量，由于电泳技术具有重复性差等缺点，而多维色谱能将样品酶解物稳定分离，因此蛋白的绝对定量多采用自下而上的方法。

虽然绝对定量似乎更为理想，但是绝对定量更为复杂和昂贵，而相对定量在很多时候就能满足科研需求，因此，相对定量更为常用。

利于质谱技术，可根据特定质谱峰的信号强度来确定蛋白质含量，主要的方法又分为非靶向定量蛋白组学（标记定量和非标记定量）和靶向定量蛋白组学。

定量蛋白质组学的方法有哪些？1 背景和意义从生命活动的直接执行者——蛋白质的角度研究生命现象和规律（特别是疾病防治和病理研究）已成为研究生命科学的主要手段。

而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中含有蛋白质种类和表达量的研究。

对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究，识别功能模块和路径，监控疾病的生物标志物，这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量。

生物质谱技术的出现和不断成熟为蛋白质差异表达分析提供了更可靠、动态范围更广的研究手段。

基于质谱技术，科学家们不断开发出新的定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。

2 方法学介绍目前较主流的定量蛋白质组学方法有5种，分别是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM(MRM HR)、和SW ATH。

简述如下：2.1 Label-freeLabel-free定量，即非标记的定量蛋白质组学，不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。

Label-free操作简单，可以做任意样本的总蛋白质差异定量，但对实验操作的稳定性、重复性要求较高，准确性也较标记定量差。

因此，Label-free技术适合于大样本量的定量比较，以及对无法用标记定量实现的实验设计。

2.2 iTRAQiTRAQ定量是目前定量蛋白质组学应用很广泛的技术，该技术的核心原理是多肽标记和定量，将多肽的含量转化为114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8标记)，从而简化了定量的复杂性，最终通过多肽定量值回归到蛋白的定量值，从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。

iTRAQ定量不依赖样本，可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等，且定量准确，可同时对8个样本进行分析，并可同时得出鉴定和定量的结果，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。

研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分,蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。

把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来,算就是实验技巧分类目录的首篇。

(另补充2:检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较)一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统就是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。

其原理就是当靶蛋白与诱饵蛋白特异结合后,诱饵蛋白结合于报道基因的启动子,启动报道基因在酵母细胞内的表达,如果检测到报道基因的表达产物,则说明两者之间有相互作用,反之则两者之间没有相互作用。

将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。

在实际工作中,人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统与反向杂交系统等。

Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。

可以研究膜蛋白的功能,丰富了酵母双杂交系统的功能。

此外,酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。

二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列,当噬菌体生长时,表面就表达出相应的单抗,再将噬菌体过柱,柱上若含目的蛋白,就会与相应抗体特异性结合,这被称为噬菌体展示技术。

此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用,不仅有高通量及简便的特点,还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。

目前,用优化的噬菌体展示技术,已经展示了人与鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库,并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。

三、等离子共振技术表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。

它的原理就是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”,当待测蛋白与诱饵蛋白结合后,薄膜的共振性质会发生改变,通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。

解码生物药物的隐秘密码：4D非标记定量蛋白质组学的前沿技术与应用生物药物的研发和应用一直是现代医药领域的重要课题，而蛋白质作为生物药物的关键组成部分，其特性和定量分析对于药物研究和开发具有重要意义。

近年来，4D 非标记定量蛋白质组学技术的发展为我们解码生物药物的隐秘密码提供了新的工具和方法。

一、什么是4D非标记定量蛋白质组学技术？。

1.1 蛋白质组学的概念和基本原理。

蛋白质组学是研究生物体内所有蛋白质在一定条件下的表达水平、相互作用以及功能的综合科学。

它基于质谱技术，通过对蛋白质样本进行消化、质谱分析和数据处理，实现对蛋白质组的全面分析和定量。

1.2 4D非标记定量蛋白质组学技术的定义和特点。

4D非标记定量蛋白质组学技术是一种基于质谱的蛋白质组学方法，通过对样品中不同时间点、不同条件下的蛋白质进行定量分析，实现对蛋白质组动态变化的观察和解析。

其特点包括高灵敏度、高通量、高精确度和高时空分辨率等。

图1。

二、4D非标记定量蛋白质组学技术的关键步骤。

2.1 样品制备与前处理。

样品制备是4D非标记定量蛋白质组学技术的关键步骤之一，包括蛋白质提取、样品净化和富集等。

这些步骤的选择和优化对于后续的质谱分析和定量结果具有重要影响。

2.2 蛋白质消化和肽段分离。

蛋白质样品经过酶切消化后产生的肽段是进行质谱分析和定量的主要对象。

常用的消化酶包括胰蛋白酶和内切酶等。

肽段的分离可以通过液相色谱技术实现，以便进行后续的质谱分析。

2.3 质谱分析和数据采集。

质谱分析是4D非标记定量蛋白质组学技术的核心步骤，常用的质谱技术包括液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）和高分辨质谱等。

在质谱分析过程中，需要对样品进行分离、离子化和碎裂，然后通过质谱仪器进行检测和记录。

2.4 数据处理与定量分析。

数据处理是4D非标记定量蛋白质组学技术中不可或缺的步骤，包括峰提取、峰匹配、定量标准建立和结果统计等。

通过对质谱数据的处理和分析，可以获得蛋白质的定量信息和差异表达分析结果。

蛋白质的定量分析方法1．蛋白质的常规检测方法1.1凯氏定氮法一种最经典的蛋白质检测方法。

原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用变成硫酸铵。

然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。

优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好。

缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大。

1.2双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。

原理：双缩脲是三分子的脲经180℃左右加热，放出一份子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽链中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅和蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。

优点：较快速、干扰物质少、不同蛋白质产生的颜色深浅相近。

缺点：灵敏度差、三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。

1.3Folin酚试剂法原理：与双缩法大体相同，利用蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应。

同时也由于Folin酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。

在一定条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。

优点：灵敏度高、对水溶性的蛋白质含量的测定很有效。

缺点：费时，要精确控制操作时间；Folin酚试剂的配制比较繁琐，且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和尿素均会干扰反应。

1.4紫外吸收法原理：蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比。

此外，蛋白质溶液在280nm处的吸光值与肽键含量成正比。

利用一定波长下蛋白质溶液的吸光值与蛋白质含量的正比关系可以测定蛋白质含量。

优点：简便、灵敏、快速、不消耗样品，测定后能回收。

缺点：测定蛋白质含量的精确度差、专一性差；干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物质会出现较大的干扰。

定量蛋白质组学定量蛋白质组学hplc2-液色迷人蛋白质组学研究的核心内容是蛋白质的动态变化和动态行为，即蛋白质的动态表达、动态定位、动态修饰和动态相互作用等，最终的研究目的是以大规模的尺度研究细胞内蛋白质的功能，这种研究要走向成熟必然要脱离对蛋白质的简单鉴定，实现对蛋白质的表达水平及其存在形式变化的检测。

因此，定量技术应该说是整个蛋白质组学的精华部分。

而这种定量通常不必是检测蛋白质在细胞内的绝对含量，而只需对其相对含量进行定量即可。

目前，蛋白质组研究中应用的比较成熟和可信的定量策略和方法主要有两种。

一种是基于传统双向凝胶电泳及染色基础上的定量，另外一种是基于质谱检测技术的定量。

1、基于双向凝胶电泳及其染色的蛋白质组学定量技术建立在传统的双向凝胶电泳和染色基础上的定量方法，通过比较不同胶上蛋白质点的染色强度来进行相对定量。

现有的染色方法包括银染、考马斯亮蓝染色，还有最新的荧光燃料。

染色在显示蛋白质的存在的同时，还提供了其表达水平的信息。

传统的双向凝胶电泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）技术由O’Farrell和Klose等人于1975年建立。

第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing，IEF），使蛋白质根据等电点不同进行分离，第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），即将等电聚焦后的胶条放在SDS-PAGE上再根据蛋白质分子量不同进行电泳分离。

由于具有高分辨率的特点，双向凝胶电泳在蛋白质组学的研究当中始终占据着重要的地位。

现在的双向凝胶电泳技术第一向利用固相pH梯度（Immobilized pH Gradient，IPG）等电聚焦技术，具有上样量大、分辨率高、重复性好等优点，并且可以提供蛋白质的等电点（pI）和分子量（MW）数值信息，有助于蛋白质的鉴定，而且双向凝胶电泳胶上常见的isoform多是蛋白质翻译后修饰的结果，对于这些蛋白质点的分析有助于了解对蛋白质功能影响重大的翻译后修饰。

一、概要在静态基因组碱基测序完成之后，系统生物学已经进入了后基因组学时代，蛋白质组学等功能基因学和代谢组学的研究目前已成为系统生物学研究的重点。

蛋白质组学研究是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，同时也是功能基因组时代生命科学研究的核心内容之一，而代谢组学的研究越来越多，在发现生物标志物方面发挥了重要作用。

二、蛋白质组学介绍蛋白质组学(Proteomics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用，是功能基因组学时代一门新的学科。

目前蛋白质组学的研究主要有两条路线：一是基于双向电泳的蛋白质组学；二是基于质谱的蛋白质组学。

目前基于质谱的蛋白质组学研究也越来越广泛。

定量蛋白质组根据是否对目标蛋白进行定量，基于质谱的蛋白质组学定量技术可分为非靶向定量蛋白质组学（Untargeted quantitative proteomics）和靶向定量蛋白质组学（Targeted quantitative proteomics），其中靶向定量技术包括多重反应监测技术（Multiple reaction monitoring，MRM）和平行反应监测（Parallel reaction monitoring，PRM），非靶向定量技术包括非标记定量和稳定同位素标记定量，稳定同位素标记又可分为多种模式，最值得关注的是等重同位素标记相对和绝对定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）和串联质量标签（Tandem mass tags，TMT）技术。

目前质谱定量技术主要采取数据依赖采集模式（Data dependent analysis，DDA），新发展的数据非依赖采集模式（Data independent analysis，DIA）。

DIA具有更好的分析准确度和动态范围，也值得重点关注。

不同定量方式对比应用优势PRM目标蛋白定量及验证靶向性检测灵敏度高DDA 非标记单样本上机价格低应用范围广DIA/SWATH 非标记大规模定量灵敏度高；通量大SILAC 体内标记多样本上机传代细胞检测定量准确重复性好标记不受裂解液成分影响iTRAQ/TMT 体外标记多样本上机定量准确重复性好蛋白质组学常见分析内容分析项目分析内容质控肽段长度分布、定量分布、肽段质量误差分布注释蛋白功能描述、GO注释、KEGG代谢通路功能分类GO二级功能分类功能富集GO功能富集、代谢通路富集蛋白网络分析蛋白网络互作分析通路分析代谢通路图进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制。

定量蛋白质组（quantitative proteomics）是把一个基因组所表达的全部蛋白或者是一个复杂体系所有的全部蛋白进行鉴定和定量的方法。

蛋白质组丰度的动态变化对各种生命过程都有重要影响。

例如在许多疾病的发生和发展进程中，常常伴随着某些蛋白质的表达异常。

发展至今，传统的基于双向电泳的2D和2D-DIGE技术正在逐渐被基于NanoLC-MS/MS的液质联用技术取代；后者需要的样品量更少（25ug蛋白），灵敏度更高（ng级），通量也更高（一次分析可以鉴定和定量超过5000种蛋白）。

定量蛋白质组学常见技术如iTRAQ/TMT、Label Free、三类定量方法，百泰派克均可为您提供服务。

在这里我们给大家简要介绍一下这三种定量蛋白质组学方法：iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技术分别由美国AB Sciex公司和Thermo Fisher公司研发的多肽体外标记定量技术。

该技术采用多个（2-10）稳定同位素标签，特异性标记多肽的氨基基团进行串联质谱分析，能够同时比较多达10种不同样本中蛋白质的相对含量，可用于研究不同病理条件下或者不同发育阶段的组织样品中蛋白质表达水平的差异。

分析原理iTRAQ/TMT标签包括三部分，如下图：1. 报告基团（reporter group）：指示蛋白样品丰度水平。

2. 平衡基团（balance group）：平衡报告基团的质量差，使等重标签重量一致，保证标记的同一肽段m/z相同。

3. 肽反应基团（amine-specific reactive group)：能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接，从而标记上肽段。

来自不同样品的同一肽段经试剂标记后具有相同的质量数，并在一级质谱检测（MS1）中表现为同一个质谱峰。

当此质谱峰被选定进行碎裂后，在二级质谱检测（MS2）中，不同的报告基团被释放，它们各自的质谱峰的信号强弱，代表着来源于不同样品的该肽段及其所对应的蛋白的表达量的高低。

Western Blot即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。

其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品中的特定蛋白进行显影。

通过分析显影的位置和显影深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

实验流程主要包括以下几个步骤：样品制备；SDS-PAGE凝胶电泳；转膜；封闭；免疫杂交；显影。

实验器材操作步骤样品制备准备进行western blot的样品可分为细胞、组织、免疫沉淀或亲和纯化后的蛋白等。

样品为蛋白溶液时不需要进行提取，而样品为细胞、组织或包埋组织等则需要根据样品的特性对其进行提取。

根据需求不同还可针对于细胞亚结构进行提取。

（1）以体外培养的贴壁细胞样本为例，对其进行总蛋白提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。

平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3、按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。

（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。

）4、每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行。

）6、于4℃下12000rpm离心5min。

（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。

（2）以哺乳动物组织样本为例，对其进行总蛋白提取：1. 将100 mg 组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS 洗涤两次后，4℃，700×g（3000 rpm) 离心3 min，弃上清。

3种不同的HPV型别宫颈癌细胞株分泌蛋白非标记定量技术分析郝轶;袁建林;肖悦;李卉;郭霞【摘要】目的:分析3种不同HPV型别的宫颈癌细胞株Siha、Caski和C33的分泌蛋白表达及种类,寻找其共性分泌蛋白标志物,为临床早期发现及针对性干预提供依据.方法:采用非标记(label-free)定量技术分析3种不同宫颈癌SiHa、Caski和C33细胞株的分泌蛋白,运用LC-MS/MS和Maxquant的非标记技术,筛选出宫颈癌分泌蛋白的种类及分类.结果:共鉴定肽段数21 609个,蛋白数2 895个.其中3种宫颈癌细胞株共性蛋白共729种,占29.2％;特异性蛋白Siha细胞株含128种,Caski细胞株含143种,C33细胞株含859种.对于结果中729种共性蛋白进行分析,有以下4类较为集中的类型:热休克蛋白类(HSPs)共14种;异质性核糖核蛋白类(HNRP)共8种;层黏连蛋白类(LN)共4种;阿尔多酮还原酶1类(AKR1)共2种.其中,溶酶体信号通路所占比例最大(39种).结论:SiHa、Caski和C33细胞株的分泌蛋白中共有729种共性蛋白,其中4类集中的蛋白类型均先后在研究中证实对宫颈癌的进程和发展有影响,并且可能与溶酶体信号通路有关.可为筛选高危型HPV感染的宫颈癌患者的血清标志物提供依据.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2018(030)005【总页数】6页(P354-358,364)【关键词】宫颈癌;宫颈癌细胞株;分泌蛋白;非标记定量技术分析【作者】郝轶;袁建林;肖悦;李卉;郭霞【作者单位】南方医科大学深圳医院,广东深圳518100;新疆医科大学地方病分子生物学实验室,新疆乌鲁木齐830011;新疆医科大学附属肿瘤医院,新疆乌鲁木齐830011;南方医科大学深圳医院,广东深圳518100;新疆医科大学地方病分子生物学实验室,新疆乌鲁木齐830011;南方医科大学深圳医院,广东深圳518100;新疆医科大学地方病分子生物学实验室,新疆乌鲁木齐830011【正文语种】中文【中图分类】R730.3宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，在世界范围内，每年约有52万新发病例[1]。