142例恶性胸水细胞蜡块的免疫组化检测及分子病理检测

・２９２・　临床与实验病理学杂志Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｐａｔｈｏｌ　２０１７　Ｍａｒ；３３（３）　网络出版时间：２０１７—３一ｌ６　１４：２３　网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０７３．Ｒ．２０１７０３１６．１４２３．０１３．ｈｔｍｌ　

１４２例恶性胸水细胞蜡块的免疫组化检测及分子病理　检测　隋燕霞，柳雨，蒋娜，蒋伊娜，张冠军　摘要：目的探讨细胞蜡块结合免疫组化在恶性胸水的诊断及鉴别诊断中的作用，并分析胸水细胞蜡块在肺腺癌分子病理检　测中的作用。方法回顾性分析１４２例恶性胸水的液基细胞学、细胞蜡块ＨＥ染色以及免疫组化ＥｎＶｉｓｉｏｎ两步法染色，并结　合细胞形态抗体的表达情况对恶性胸水进行肿瘤分类。采用ＡＲＭＳ—ＰＣＲ法对其中４０例经免疫组化ＥｎＶｉｓｉｏｎ染色确诊为肺　腺癌的胸水细胞蜡块，进行表皮生长因子受体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）基因突变检测。结果１４２例胸水细胞　蜡块经免疫组化染色证实肺腺癌９９例，肺小细胞癌４例，肺鳞状细胞癌３例，乳腺癌１３例，卵巢癌９例，胃癌２例，甲状腺癌１　例，子宫内膜癌１例，间皮瘤５例，淋巴瘤３例，恶性黑色素瘤ｌ例，滑膜肉瘤１例。４０例肺腺癌中ＥＧＦＲ基因突变２Ｏ例，其中　１９ｄｅｌ突变９例，Ｌ８５８Ｒ突变１１例。结论恶性胸水细胞蜡块行免疫组化检测不仅有助于肿瘤的明确诊断，更有助于对肿瘤　进行分类并判断肿瘤原发部位及帮助判断预后。利用胸水细胞蜡块可以对肺腺癌进行ＥＧＦＲ基因突变的检测，为肺腺癌的基　因检测提供新型的标本来源。　关键词：胸水；细胞蜡块；免疫组织化学；基因突变　中图分类号：Ｒ　７３４．２　文献标志码：Ａ　文章编号：１００１—７３９９（２０１７）０３—０２９２—０５　ｄｏｉ：１０．１３３１５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｃｅｐ．２０１７．０３．０１３　

胸水是许多疾病的常见临床表现，其性质的判　断对临床诊断及治疗具有重要意义。胸水细胞学检　查具有损伤小、方法简易等特点，目前传统的细胞学　检查既无法对胸水样本长期保存，也未能对临床提　供更多的有效信息…。本文现采用细胞蜡块技术，　探讨细胞蜡块结合免疫组化ＥｎＶｉｓｉｏｎ两步法染色　在胸水诊断中的应用。同时对经免疫组化ＥｎＶｉｓｉｏｎ　两步法确诊为肺腺癌的部分病例进行表皮生长因子　受体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）基因　突变检测，从而为临床靶向药物的筛选提供新型的　标本来源。　１材料与方法　１．１材料收集西安交通大学第一附属医院病理　科２０１５年１月～２０１６年６月确诊为恶性胸水１４２　例，其中男性５８例，女性８４例，男女比为１：１．４５，　年龄２７—９９岁，平均（６０．９８±１２．１２）岁。　１．２方法　１．２．１　液基细胞学　使用广州安必平液基细胞沉　接受日期：２０１７一Ｏ１—１４　基金项目：陕西省社会发展科技攻关（２０１６ＳＦ一１７４）　作者单位：西安交通大学第一附属医院病理科，西安７１００６１　作者简介：隋燕霞，女，硕士，主治医师。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｉｙａｎｘｉ０２９＠１６３　降式制片染色机，按试剂盒操作步骤进行制片，巴氏　染色，阅片。　１．２．２细胞蜡块的制作　取液基制片后剩余胸水　放入５０　ｍＬ离心管中，离心机２　０００　ｒ／ｒａｉｎ，离心５　ｒａｉｎ，弃上清，如果沉淀物不够可反复离心收集（血　性标本先加入３％醋酸乙醇１０　ｍＬ，振荡均匀，２　０００　ｒ／ｍｉｎ，离心５　ｍｉｎ，去除血细胞干扰）；向沉淀物中加　入１０％中性福尔马林５　ｍＬ，振荡，２　０００　ｒ／ｍｉｎ，离心　５　ｍｉｎ，弃上清；向沉淀物中加入９５％乙醇１０　ｍＬ，振　荡，２　０００　ｒ／ｍｉｎ，离心１０　ｍｉｎ，弃上清液；底部沉淀镊　取至擦镜纸上，包好，与常规组织一起行脱水处理，　制成细胞蜡块。　１．２．３免疫组化用细胞蜡块制作３　Ｉｘｍ厚切片，　免疫组化采用ＥｎＶｉｓｉｏｎ两步法，具体步骤按试剂盒　说明书进行染色。一抗选用ＣＫ、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＣＥＡ、　ＣＫ７、Ｎａｐｓｉｎ　Ａ、ｑＴＦ一１、０４０、ＣＫ５／６、ｐ６３、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ、　ＷＴ－１、ＭＣ、Ｄ２－４０、ＣＤ５６、ＣｇＡ、Ｓｙｎ、ＣＡ１２５、Ｐａｘ一８、　ｐ１６　ＣＫ２０、Ｖｉｌｌｉｎ　ＣＤＸ２　ＧＣＤＦＰ一１５、Ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ　ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ－２、ＣＤ４５、ＣＤ２０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ３、ＣＤ４３、　ＨＭＢ－４５　Ｍｅｌａｎ—Ａ　Ｓ－１００　ＣＫ１９　Ｇａｌｅｃｔｉｎ一３　ＴＧ　ＥＭＡ、ｄｅｓｍｉｎ、ｐ５３、Ｋｉ－６７等进行检测；抗体及工作液　均购自福州迈新公司。　１．２．４　ＡＲＭＳ—ＰＣＲ法细胞蜡块标本切片１０　Ｉｘｍ　厚，数量≥１０张，将切片用镊子转移至洁净的１．５　ｍＬ离心管中。应用厦门艾德公司的石蜡包埋组织　临床与实验病理学杂志Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｐａｔｈｏｌ　２０１７　Ｍａｒ；３３（３）　・２９３・　样品ＤＮＡ提取试剂盒，按试剂盒说明书进行ＤＮＡ　提取，ＤＮＡ样本经Ｎａｎｏ　Ｄｒｏｐ　２０００分光光度计（美　国Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）定量，并调节终浓度为２　ｎｇ／　Ｌ。应用ＡＲＭＳ法对提取的ＤＮＡ进行ＥＧＦＲ　基因突变检测，具体步骤按试剂盒说明书进行。　２　结果　２．１　恶性胸水的肿瘤细胞来源及肺腺癌的基因突　变１４２例胸水细胞蜡块经免疫组化ＥｎＶｉｓｉｏｎ两步　法染色证实肺腺癌９９例，肺小细胞癌４例，肺鳞状　细胞癌３例，乳腺癌１３例，卵巢癌９例，胃癌２例，　甲状腺癌１例，子宫内膜癌１例，间皮瘤５例，淋巴　瘤３例，恶性黑色素瘤１例，滑膜肉瘤１例（表１）。　４０例肺腺癌中ＥＧＦＲ基因突变２０例，其中１９ｄｅｌ突　变９例，Ｌ８５８Ｒ突变１１例。　表１胸水细胞蜡块免疫组化的分型诊断结果（ｎ＝１４２）　２．２液基制片观察液基细胞巴氏染色结果以腺　癌多见，其中最常见的是肺腺癌，癌细胞常聚集成　团，分化差时可散在分布，核质比增大，核异形，核仁　明显，胞质内可见黏液空泡（图１Ａ）；另外较常见的　腺癌有乳腺癌和卵巢癌，乳腺癌细胞黏附性强，常形　成大小不同的圆形、卵圆形三维细胞团，团内细胞可　相互重叠，大小较一致（图１Ｂ）；卵巢癌常形成大量　的细胞团，三维立体感强，可有黏液空泡。少见肿瘤　有肺小细胞癌、肺鳞状细胞癌、胃癌、甲状腺癌、子宫　内膜癌、间皮瘤、淋巴瘤以及其他软组织肿瘤。小细　胞癌细胞体积小，可成堆或成团排列，镶嵌特征明　显，并常见单个细胞呈列兵式排列，胞质稀少或缺　如，核形不规则深染，核分裂象易见；鳞状细胞癌细　胞异形性明显，散在分布，胞质丰富，核异形明显，可　见巨核细胞，核染色质粗糙、深染；胃癌、甲状腺癌、　子宫内膜癌液基细胞学均为不同分化程度的腺癌特　点，即常聚集成团，核质比增大，核异形，核仁明显，　胞质内可见黏液空泡；间皮瘤细胞由一系列的间皮　细胞构成，细胞可呈团排列，细胞团边缘呈桑葚状或　结节状，细胞较腺癌异形性小，核居中，胞质核周浓　染，边缘较淡；淋巴瘤细胞小而一致，呈圆形或卵圆　形，胞质稀少，核染色质颗粒状；恶性黑色素瘤细胞　呈圆形、卵圆形及不规则形，细胞异形性明显，核不　规则，可见八字形细胞核，核仁明显，细胞质内可见　黑色素颗粒；滑膜肉瘤细胞大小形态多样，可见梭形　细胞，异形明显，核染色质粗糙，核分裂象多见。　２．３细胞蜡块切片观察细胞蜡块切片ＨＥ染色　镜下观察，切片背景干净，染色对比清晰，细胞数明　显增多。腺癌的细胞蜡块切片不仅具有癌细胞的形　态学特点，还可以观察类似组织学的排列方式及结　构，如腺状、乳头状、梁索状、巢团状结构等（图２）。　肺小细胞癌、鳞状细胞癌、间皮瘤、淋巴瘤及其他软　组织肿瘤形态上与相应的组织学相似。　２．４细胞蜡块结合免疫组化进行分型诊断　１４２　例胸水细胞蜡块经免疫组化染色证实肺腺癌９９例，　免疫组化通常ＣＫ７、Ｎａｐｓｉｎ　Ａ（图３Ａ）和，ｒｒＦ一１均呈　阳性；乳腺癌１３例，免疫组化标记ＣＫ７、ＧＣＤＦＰ－１５、　Ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ均呈阳性，不同程度表达ＥＲ（图３Ｂ）、　ＰＲ、ＨＥＲ－２；卵巢癌９例，免疫组化标记ＣＫ７、　ＣＡ１２５、Ｐａｘ一８、ｗＴ．１均呈阳性，不同程度表达ＥＲ、　ＰＲ、ｐ１６；肺小细胞癌４例，免疫组化标记ｒＩＴＩ’Ｆ一１、　ＣＤ５６、Ｓｙｎ、ＣｇＡ均呈阳性；肺鳞状细胞癌３例，免疫　组化标记ＣＫ、０４０、ＣＩ（５／６、ｐ６３均呈阳性；胃癌２例，　免疫组化标记ＣＫ２０、Ｖｉｌｌｉｎ、ＣＤＸ２均呈阳性；甲状腺　癌１例，免疫组化标记ＣＫ１９、Ｇａｌｅｃｔｉｎ一３、ＴＧ、ＴｒＦ一１　均呈阳性；子宫内膜癌１例，免疫组化标记ＣＫ７、ＥＲ、　ＰＲ均呈阳性；间皮瘤５例，免疫组化标记ＣＫ５／６、　ＷＴ一１、Ｄ２－４０、ＣＲ、ＭＣ、ＥＭＡ、ｐ５３均呈阳性；Ｂ细胞　淋巴瘤３例，免疫组化标记ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＣＤ４５、ＣＤ２０、　ＣＤ７９ａ均呈阳性；恶性黑色素瘤１例，免疫组化标记　ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＨＭＢ－４５、Ｍｅｌａｎ—Ａ、Ｓ一１００均呈阳性；滑膜肉　瘤１例，免疫组化标记ＣＫ、ＥＭＡ、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ　不同程度阳性表达。　２．５应用细胞蜡块进行肺腺癌ＥＧＦＲ基因突变检　测４０例肺腺癌胸水细胞蜡块中ＥＧＦＲ基因突变　２０例（图４），其中１９ｄｅｌ突变９例，Ｌ８５８Ｒ突变１１　例，其余２Ｏ例未见ＥＧＦＲ基因突变。　

３讨论　胸水是许多疾病，尤其是恶性肿瘤的常见临床　・２９４・　临床与实验病理学杂志．，Ｃｌｉｎ　Ｆｘｐ　Ｐａｔｈｏｌ　２０１７　Ｍａｒ；３３（３）　图ｌ　Ａ．肺腺癌细胞聚集成闭或散　分布，核质比增大，核算形，核ｆ：明显，胞质内呵见黏液窀泡，巴氏染色；Ｂ．乳腺癌癌细胞形成大小不等的　圆形、卯圆形　维细胞　，细胞大小较一敛，巴氏染色　图２　Ａ．肺隙痛细胞蜡块切片可　腺样歧乳头状结构：Ｂ．乳腺墒细胞蜡块切片癌细　胞　艇川状结卡句，其　町Ｅ４，ｆｒ，Ｊ￣ｉ腔形成　图３　Ａ，肺腺煽Ｎａｐｓｉｎ　Ａ癌细胞胞质阳性，　Ｖｉｓｉｏｎ两步法；Ｂ．乳腺癌ＥＲ癌细胞胞核阳性，Ｅｎ—　Ｖｉｓｉｏｎ　Ｉｊ；ｌｉ步法　

Ａ　３　５００　

３　０００　２　５００　０　２　０００　１　５００　ｌ　０００　５００　０　

Ｂ　６　０００　５　０００　０　４　０００　３　０００　２　０００　ｌ　０００　（）　

循环　图４内控《Ａ）、外控（Ｂ）信号均升起，　表明检测体系正常；可见ＥＧＦＲ基因突变信号　

表现、、虽然胸水细胞学检查具有快速、简单、标本易　于采集等优点，但传统的细胞学涂片及胸水液基细　胞学涂片检查标本难以长期保存．对恶性胸水无法　行进・步检测等缺点，使传统胸水细胞学诊断具有