分析化学 色谱分析法

VR V0 KVs 分配系数大的组分保留时间长（保留体积 大），晚流出色谱柱。 K在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝 胶色谱中，分别为狭义分配系数K、吸附系数 Ka、选择性系数KA/B和渗透系数Kp， Vs分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、 吸附剂表面积、离子交换剂总交换容量和凝 胶孔内总容积。
5
GSC
气相色谱法 （GC）
柱色谱法
GLC 纸色谱法 平面色谱法 薄层色谱法 （TLC） LLC LLC LLC
色 谱 法
LSC
液相色谱法 （LC）
柱色谱法
LSC SEC IEC BPC
毛细管电泳法 （CE） 超临界流体色谱法 （SFC）
6
毛细管电色谱法 （CEC）
二、色谱法的发展
（一）色谱法的历史 （二）色谱法的现状和发展趋势
21
分配系数与色谱分离

保留因子(capacity factor；k)：在一定温度和压力
下，达到分配平衡时，组分在固定相和流 动相中的质量(m)之比。 又称为质量分配系数或分配比。 还与固定相和流动相的体积有关。 保留因子与分配系数的关系
m k m
s
m
CV Vs K CV Vm
s s m m
34
表 17-1 一些溶剂在硅胶上的o值
溶剂 正戊烷 溶剂强度 （o） 0.00 溶剂 溶剂强度 （o） 0.48
甲基特丁基醚
正己烷
氯仿 二氯甲烷
0.00
0.26 0.40
醋酸乙酯
乙腈 异丙醇
0.48
0.52 0.60
乙醚
0.43
35
甲醇
0.70
吸附色谱法

洗脱顺序 ka=KaSa/Vm



43
空间排阻色谱法

保留体积与渗透系数的关系
Vs VR Vm (1 K P ) Vm
Vm≈V0
VR V0 K pVs
分子线团尺寸（分子量）大的组分， 其渗透系数小，保留体积也小， 因而先被洗脱出柱。
44
小结

色谱过程方程式：
Vs t R t 0 (1 K ) Vm
色谱分析法概论
chromatography
中国药科大学理学院 分析化学教研室 徐光富
1
色谱法的发展和分类 色谱过程和基本原理 基本类型色谱方法及其分离机制
色谱法基本理论
2
色谱法的特点:
高分离效能、高灵敏度、高选择性
分析速度快
应用范围广
3
色谱学的重要作用



诺贝 尔化学 奖： 1948 年，瑞 典 Tiselins ，电 泳 和 吸 附 分 析 ； 1952 年 ， 英 国 马 丁 (Martin)和辛格(Synge)，分配色谱。 应用的科学领域：生命科学、材料科学、环 境科学等。（科学的科学） 药学（药物分析）：各国药典收载了许多色 谱分析方法。中国药典二部， 700 多，纯 度检查、定性鉴别或含量测定。 USP，2000+
22
分配系数与色谱分离
（二）分配系数和保留因子与保留时间的关系
v R u
'
v=L/tR u=L/t0
t0 R tR
'
tm Nm CmVm R t m t s N m N S C mVm CsVs
'
1 ' R 1 k
tR=t0(1+ k)
t0 ' R tR

交换 再生 交换 再生

+ RSO 3 Na+ + H

Cl RNR+ 3
+ OH
R
B+ A
38
R
A + B
四、空间排阻色谱法

分离原理 根据被分离组分分子的线团尺寸 进行分离。
也称为分子排阻色谱法。
39
40
空间排阻色谱法
根据空间排阻（steric exclusion）理论，孔内 外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态：
27
分配色谱法

固定相 又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层 液体；化学键合相（通过化学反应将各种有机 基团键合到载体上形成的固定相）。 流动相 气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。 液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。

正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性。
反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性。
28
分配色谱法

洗脱顺序 由组分在固定相或流动相中溶解
度的相对大小而决定。
正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。
（库仑力和氢键力）
反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。
29
二、吸附色谱法

分离原理 利用被分离组分对固定相 表面吸附中心吸附能力的差别而实现 分离。

吸附过程是试样中组分的分子(X)与流
V tR=t0(1+K ) V
s m
t t t k t t
R 0 0
'
R 0
23
分配系数与色谱分离
（三）色谱分离的前提

KA≠KB 或kA≠kB 是色谱分离的前提。
推导过程：
V tR = t0(1+KA V )
s
A
m
t R B= t0(1+KB
Vs ) Vm
Vs tR= t0 (KA－KB) Vm
tR≠0
24
KA≠KB
kA≠kB
第三节 基本类型色谱方法及其分离 机制

分配色谱法
吸附色谱法


离子交换色谱法
空间排阻色谱法

25
一、分配色谱法
26
分配色谱法

分离原理 利用被分离组分在固定相或 流动相中的溶解度差别而实现分离。
Cs X s Vs K＝ Cm X m Vm
•溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相 中溶解度越小，则K越大。在LLC中K主要与流 动相的性质 (种类与极性) 有关；在GLC中K与 固定相极性和柱温有关。
动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心
的过程，即为竞争吸附过程 。
30
31
X m + nY a
Ka = [X a ][Ym ] n [X m ][Ya ] n
X a + nY m
[X a ] X a / S a Ka [X m ] X m / Vm
吸附系数与吸附剂的 活性、组分的性质和 流动相的性质有关。
峰高(peak height；h)：组分在柱后出现浓度
极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的

距离。

峰面积(peak area；A)：色谱曲线与基线间
包围的面积。
返回
17


柱效参数
标准差(standard deviation；σ)：正态色谱流出 曲线上两拐点间距离之半，即0.607倍峰高处的 峰宽之半。 σ的大小表示组分被带出色谱柱的 分散程度。σ越大，组分越分散；反之越集中。
1．新型固定相和检测器的研制 2．色谱新方法的研究 3．色谱联用技术 4．色谱专家系统
7
第二节 色谱过程和基本原理
一、色谱过程
实现色谱操作的基本条件是必须具备相对
运动的两相，固定相(stationary phase)和流
动相(mobile phase)。 色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间 多次“分配”的过程。
8
9
色谱过程

组分的结构和性质微小差异 定相作用差 等
与固
随流动相移动的速度不 色谱分离。
差速迁移
10
二、色谱流出曲线和有关概念



色谱流出曲线 是由检测器输出的电信 号强度对时间作图所绘制的曲线，又称 为色谱图。 基线 是在操作条件下，没有组分流出 时的流出曲线。基线反映仪器 (主要是 检测器) 的噪音随时间的变化。 色谱峰 是流出曲线上的突起部分。 正常色谱峰、拖尾峰和前延峰

Xm

Xs
（0＜Kp＜1 ）
渗透系数： Kp =Xs/Xm
由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小 所决定。在一定分子线团尺寸范围内，Kp与 分子量相关，即组分按分子量的大小分离。
41
空间排阻色谱法

固定相 多孔凝胶：软质、半软质和硬质
主要性能参数 平均孔径 排斥极限（Kp=0）：不能渗透进入凝胶的任 何孔隙最低分子量 分子量范围：排斥极限（Kp=0）与全渗透点 （Kp=1）之间的分子量范围围。选择凝胶 时应使试样的分子量落入此范围。
42

空间排阻色谱法

流动相
要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低 水溶性试样选择水溶液为流动相(称为凝胶过滤色 谱gel filtration chromatography； GFC)； 非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲 基甲酰胺等有机溶剂为流动相 (凝胶渗透色谱gel permeation chromatography；GPC)。
(一) 分配系数和保留因子

分配系数 (distribution coefficient；K) 是在一 定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在 固定相 (s) 与流动相 (m) 中的浓度 (C) 之比。
Cs K = Cm
分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质 及温度（和压力）有关。是组分的特征常数。
③不饱和化合物的吸附力强，双键数越多，吸
附力越强。 ④分子中取代基的空间排列
37
三、离子交换色谱法


分离原理 利用被分离组分离子交换能力的 差别而实现分离。 分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。 阳离子交换： 阴离子交换： 离子交换通式：
RSO3 H+ + Na+
+OH- + Cl RNR3
11
•对称因子fs •(symmetry factor) ： •衡量色谱峰的对称性
fs W 0.05h / 2 A ( A B) / 2 A
12
到19页 到20页
13
定性参数1

保留时间(retention time;tR)：从进样到某组分 在柱后出现浓度极大时的时间间隔。 死时间 (t0)：分配系数为零的组分，即不被固 定相吸附或溶解的组分的保留时间。 ' 调整保留时间 ( t R )：某组分由于溶解（或被吸附） 于固定相，比不溶解（或不被吸附） 的组分 ' tR 在柱中多停留的时间。
15


定性参数3
调整保留体积(adjusted retention volume; V )：由保留体积扣除死体积 后的体积
' R
' VR' VR V0 t R Fc
•相对保留值(r) ：两组分的调整保留值之比
r2,1
' tR 2
t
' R1

VR' 2 VR' 1
16

定量参数


t ＝t R t0
' R
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定性参数2
保留体积(VR)：从进样开始到某个组分在柱后出 现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。
VR t R Fc
死体积(V0)：由进样器至检测器的流路中未被 固定相占有的空间。
固定相颗粒间间隙、导管的容积、检测器内腔 容积的总和。
V0＝t 0 Fc
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吸附色谱法


固定相 多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。 硅胶表面硅醇基为吸附中心。 经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶 高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅 胶和堆积硅珠。 气相色谱：高分子多孔微球等
Leabharlann Baidu33
吸附色谱法


流动相 有机溶剂（硅胶为吸附剂） 洗脱能力：主要由其极性决定。 强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗 脱能力强，使k值小，保留时间短。 Snyder溶剂强度o：吸附自由能，表示洗脱 能力。o值越大，固定相对溶剂的吸附能力 越强，即洗脱能力越强。
4
第一节 色谱法的分类和发展
一、色谱法的分类
按流动相的分子聚集状态分类: GC、LC、SFC 等 按固定相的分子聚集状态分类: GSC、GLC、LSC、LLC等 按操作形式分类: 柱色谱法、平面色谱法、毛细管电泳法等 按色谱过程的分离机制分类: 分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、 空间排阻色谱法、毛细管电泳法等
在色谱柱（Sa与Vm一定）时，Ka大的组分保

留强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保
留弱，先被洗脱。

Ka与组分的性质（极性、取代基的类型和数
目、构型有关）。
36
以硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强。
①饱和碳氢化合物为非极性化合物，不被吸附。
②基本母核相同，引入的取代基极性越强，则 分子的极性越强，吸附能力越强；极性基团越 多，分子极性越强 (但要考虑其他因素的影 响) 。
Rs＝
t R 2 t R1 (W1 W2 ) / 2
＝
2(t R 2 tR1 ) W1 W2
19
分离度

设正常峰，W1≈W2= 4σ ， 则R=1.5时，99.7%面积(tR ±3σ)被分开， ∆ tR =6 σ ，称 6 σ分离 ，即基线分离。
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三、分配系数与色谱分离
半峰宽 (W1/2)：峰高一半处的峰宽。


峰宽 (peak width；W)：色谱峰两侧拐点作切线 在基线上所截得的距离。
W1/2=2.355σ
W=4σ
或W=1.699W1/2
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18


总分离效能指标
分离度(resolution；Rs )：又称分辨率。是相邻两色 谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。