工程菌的知识
基因工程大肠杆菌发酵的研究
摘要：基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。研究结果表明，每１０Ｌ发酵液可得１～２ｋｇ湿菌体，发酵时间从一般的２４～３０ｈ缩短到６～８ｈ，５Ｌ、１５Ｌ、１５０Ｌ发酵罐都可得重复性的结果。这项发酵工艺研究不仅适用于E.coli各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工程产业化起重要作用。
关键词基因工程菌,高密度发酵,人干扰素α22b ,鲑鱼降钙素,鱼生长激素, K88K99 基因工程疫苗
作者：巫爱珍. 孙玉昆.
刊名：生物工程学报
讨论:含PL 启动子的E. coli 工程菌的表达及温度敏感株活菌疫苗的生产。要求细菌在较低的温度(30 ℃) 发酵增殖,在一定时间内提高菌体密度,然后迅速提高温度诱导目的产物的表达。这类菌表达产物的表达量取决于二个因素:一是在30 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度,二是快速升温诱导,要同时解决这二个问题是较困难的,目前不少基因工程研究室或生产厂对于这类菌的发酵均遇到上述同类的问题,即菌体密度不高和表达量低,他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵体积,显然不是良策,因为含PL 启动子的工程菌在发酵过程中发酵体积越大(500～1000L) ,其表达效率愈低,并大大增加了抽提分离表达产物的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。而本文报道的高密度发酵技术能同时解决以上的问题,发酵时间短(约8h) ,菌体密度及表达效率高,生产车间小型化,能节省大量后处理的设备投资、人力、能源、废物废水处理量少,符合发展现代化生产的要求。
对于不需温度诱导表达,在30 ℃发酵的工程菌或野生菌应用我们的工艺技术发酵,当发酵持续6 小时,菌体仍在直线增殖的情况下,如果延长发酵时间,菌体将继续增加。
E. coli 的不同工程菌或野生菌具有不同的特性,在发酵过程中我们随之对发酵条件作了相应的改变,均取得高密度的发酵结果。
目的蛋白的诱导表达
1. 诱导目的蛋白表达
（1） 从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞，加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中，37℃，250rmp摇床培养过夜。
（2） 将过夜培养的重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞分别按1%的比例转种于30 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中。
（3） 37℃摇床培养至OD600到0.4-1。
（4） 从重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞中各取10ml培养物作为未诱导对照；在剩下的样品中加入1M IPTG储液至终浓度1mM，继续培养2-3小时。
（5） 将摇瓶置于冰上5分钟，5000g 4℃离心15分钟收集菌体，菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析等。
2. 表达条件的优化：
1） IPTG的诱导浓度的确定：
（1） 重组工程菌的诱导：从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞，加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中，37℃，250rmp摇床培养过夜。
（2） 将过夜培养的重组工程菌按1%的比例转种于30 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中。
（3） 在37℃，250rmp摇床培养至OD600约为0.8。
（4） 按6ml/份上述培养物分装，分别加入IPTG至终浓度 0, 0.5, 1, 1.5, 2.0mM。
（5） 37℃，250rmp摇床培养8h，在无菌条件下取样并测定OD600值。
（6） 所取样品1ml/份分装，5000g 4℃离心15分钟收集菌体。
（7） 菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量测定。
2） IPTG诱导温度条件的优化：
（1） 重组工程菌的诱导：从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞，加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中，37℃，250rmp摇床培养过夜。
工程菌传代稳定性方案
一、引言
随着生物工程技术的不断发展，工程菌的传代稳定性成为一个重要的研究方向。传代稳定性是指工程菌在持续传代过程中，其基因组和代谢特性不发生显著变化的能力。传代稳定性的不稳定性会影响到工程菌在发酵、生产过程中的稳定性和可靠性，因此对于工程菌的传代稳定性进行深入研究具有重要的意义。本文将对工程菌传代稳定性的影响因素及解决方案进行系统的论述。
二、工程菌传代稳定性影响因素
1. 外源DNA插入点
外源DNA在工程菌中的插入点会直接影响到工程菌的稳定性。如果外源DNA插入到工程菌的基因组中的激活区域，可能会导致基因的过度表达或失活。这种情况会对细胞的代谢特性产生明显影响，从而影响到工程菌的传代稳定性。
2. 外源DNA拷贝数
外源DNA在工程菌中的拷贝数也是影响传代稳定性的一个重要因素。外源DNA拷贝数过高可能会导致工程菌的基因组不稳定，进而影响到其传代稳定性。而且外源DNA拷贝数过高还容易导致外源基因与细胞内自身基因发生重组，从而引起基因突变和适应性降低。
3. 环境条件
环境条件对于工程菌的传代稳定性也有一定的影响。例如，温度、pH值、营养条件等环境因素都可能影响到工程菌的代谢特性和遗传稳定性。另外，在野外环境中，外源菌可能会受到生物环境因素的影响，加速了基因突变的发生。
三、工程菌传代稳定性解决方案
1. 合理设计外源DNA插入点
在进行工程菌的遗传改造时，应该注意选择适当的外源DNA插入点。合理的外源DNA插入点可以降低外源DNA对细胞代谢特性的影响，减少基因的过度表达或失活等现象，从而提高工程菌的传代稳定性。
2. 精细调控外源DNA拷贝数
在进行工程菌的遗传改造时，应该对外源DNA的拷贝数进行精细调控。避免外源DNA拷贝数过高，减少基因突变和适应性降低的发生概率，从而提高工程菌的传代稳定性。
3. 优化环境条件 在工程菌的发酵、生产过程中，应该优化环境条件，保持细胞的代谢稳定性。保持适宜的温度、pH值和营养条件，可以减少外源菌受生物环境因素的影响，降低基因突变的发生概率。
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项（以大肠杆菌为例）
利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。许多价值高产量低的功
能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都
在工程菌中获得了高效率表达。由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量，在工业生产
上可以提高效率降低成本。所以，高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。本文就工
程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。
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工程菌种
稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障，直接关系到生产效率和成本高低。不同于传统诱
变育种模式，在对待工程菌菌种问题上，有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克
隆筛选，既节约时间成本又大大减少了工作量，这其实是一个认识误区。这样做出来的菌种很
难连续稳定传代50次以上，给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。业内一般以能否
稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。
发酵所需的接种量不是越大越好，要适当。接种量过小导致适应期过长，菌种易提前老化，也
增加了杂菌污染的风险。接种量过大会过早引起溶氧不足，导致发酵失控。且营养物质消耗过
快也会影响后期正常生长。一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则，并将最后一级的放大倍
数控制在10倍左右。
种子培养一定要在最佳条件下进行，培养时间不宜过长，当种子生长至最佳状态时果断移种。
如果种子做的不好，其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。工程菌种培养会加入抗生素，
不仅是为了抑制杂菌生长，更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力，及时淘汰质粒丢
失的菌株或者衰老的菌体，保证质粒携带菌群的正常生长与表达。
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高密度发酵培养基
除了必须的碳源以外，有机复合氮源在蛋白表达阶段不可或缺。有机复合氮源可提供丰富的氨
基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，能减轻细胞代谢负担，促
进外源蛋白表达。如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加时，存在一种非常有趣的代谢机
