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NTG和UV复合诱变选育紫杉醇高产菌株的研究

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第25卷　第1期2008年2月 黑龙江大学自然科学学报JOURNALOFNATURALSCIENCEOFHEILONGJIANGUNIVERSITY　Vol125No11February,2008

NTG和UV复合诱变选育紫杉醇高产菌株的研究赵　凯,　王　颖,　王　旋,　孙宇石,　平文祥,　周东坡(黑龙江大学生命科学学院微生物黑龙江省高校重点实验室,哈尔滨150080)

摘　要:对紫杉醇产生菌HD1-3的孢子分别进行了紫外线照射(UV)、亚硝基胍(NTG)和UV

+NTG复合诱变处理,筛选制霉菌素抗性突变株。试验所确定的Nodulisporiumsylviforme紫杉醇产生菌HD1-3孢子诱变的适宜条件为:将孢子悬液经过310mg・mL

-1

NTG、处理20min后,在电磁搅

拌下,用紫外灯(30w,距离30cm)照射处理45s。共筛选出17株正突变株。经发酵筛选试验,获得了一株遗传性状稳定、高产紫杉醇的诱变菌株———UN

25-3,其紫杉醇产量从出发菌株的(232173

±4161)μg・L-1提高至(327114±7163)μg・L-1。关键词:紫杉醇;内生真菌;诱变;选育中图分类号:Q94文献标志码:A文章编号:1001-7011(2008)01-0074-04

收稿日期:2007-07-16

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30570025);黑龙江省“十五”重大攻关项目(GA02C101);黑龙江省教育厅海外学人科研资助项目(1152HZ06);哈尔滨市青年科学基金项目(2005AFQXJ063);黑龙江大学杰出青年基金资助项目作者简介:赵　凯(1973-),男,副教授,博士,博士后,主要研究方向:生物制药与微生物遗传,E-mail:zk395@yahoo.com.cn

通讯作者:周东坡(1955-),男,教授,博士生导师,E-mail:zhoudp2003@yahoo.com.cn

紫杉醇(taxol)是一种复杂的具有抗癌活性的三环二萜类化合物,最早是由美国的Wani等(1971)[1]分离自短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)。在临床上,用于治疗乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜癌、子宫癌等人体多种恶性肿瘤[2-4]。为了解决紫杉醇的药源不足,并保护生态环境,科学家已把目光从红豆杉树分离提取紫杉醇转向了其他可能途径。微生物发酵法是一种低成本、大量获取紫杉醇的理想方法。但目前利用微生物发酵法生产紫杉醇的研究基本还处于初级阶段,主要限制因素是分离和筛选到的菌株产量太低[5],难以实现工业化

生产,因此,高产菌株的选育成为当前的首要任务[6]。亚硝基胍(NTG)是一种高效的诱变剂,在适合的条件下,死亡率低而诱变率高,对每一细胞可以诱发一次至多次突变,故有超诱变剂之称。本课题组对1993年分离获得的菌株,采用NTG作为诱变剂,及时进行了常规的孢子诱变育种,以期找出NTG诱变的最佳诱变剂量,并选育出高产紫杉醇的诱变菌株,充分发挥菌株的遗传潜力,大幅度提高菌株的紫杉醇产量,为通过微生物发酵法生产紫杉醇早日实现工业化生产奠定坚实的基础,从根本上解决紫杉醇药源不足问题。现对课题组以前的育种工作进行较为详细的报道。

1　材料和方法111　菌株菌株HQD33系自东北红豆杉(Taxuscuspidata)分离到的内生真菌———树状多节孢(Nodulisporiumsylvi2forme)[7-8],其孢子经常规选育和原生质体诱变获得的菌株HD1-3(紫杉醇产量为(232173±4161)μg・

L-1)作为本试验的出发菌株。

112　培养基PDA液体培养基[9];PDA固体培养基:向上述PDA液体培养基中加入2%的琼脂后灭菌;改良的S-7培养基[10]:在Strobel,1993原S-7培养基基础上将苯丙氨酸、酪氨酸、亚油酸增至终浓度115～510mg・L-1。113　孢子悬液的制备经PDA斜面培养基活化的出发菌株HD

1-3,转接PDA固体培养基平板,28℃、恒温培养7～14d;

向培养孢子的培养皿内移取无菌生理盐水,用接种环将菌落刮至培养皿的一侧,三层擦镜纸过滤,除去菌丝,再将滤液3000～3500r・min-1离心10min,取离心管下部沉淀物,进行孢子计数,调整孢子悬液的浓度为106cfu・mL-1,放4℃冰箱保存,备用。114　诱变处理UV诱变:一切操作在红光下或避光进行。取孢子悬液8mL于直径9cm的带无菌搅拌子平皿中,盖上皿盖,在诱变箱中(提前015h开紫外灯),在30w、距离30cm紫外灯下照射10min,进行培养皿的表面消毒;开启磁力搅拌器,打开皿盖,边照射边搅拌,分别于照射15s、30s、45s、60s、75s、90s、105s时关闭紫外灯,在无菌、避光照操作的条件下,进行10-1、10-2、10-3系列梯度稀释。从每个稀释度中取012mL/皿涂布于加有25～30mLPDA固体培养基平板上,28℃避光恒温培养3～5d,计数各梯度平皿菌落数并计算致死率。每次试验测定结果都采用三个平行组,测试结果为各重复样的平均值。

致死率=1-诱变后菌落数×稀释倍数诱变前孢子数×0.2×100%

亚硝基胍(NTG)诱变:用丙酮试剂将亚硝基胍溶液配制成终浓度为015mg・mL-1、110mg・mL-1、210mg・mL-1、310mg・mL-1、410mg・mL-1、510mg・mL-1。取015mLNTG处理液与415mL稀释的孢

子悬液混合,置于直径6cm的培养皿内,开启磁力搅拌器,在26～28℃条件下分别处理10min、20min、30min后,用pH为810的磷酸缓冲溶液稀释终止反应,进行10-1、10-2、10-3系列梯度稀释。从每个稀释度

中取012mL/皿涂布于加有25～30mLPDA固体培养基平板上,28℃避光恒温培养3～5d,计数各梯度平皿菌落数并计算致死率。每次试验测定结果都采用三个平行组,测试结果为各重复样的平均值。NTG+UV复合诱变:取经过NTG处理的孢子悬液5mL,放入直径6cm盛有无菌转子的平皿中,在电磁搅拌下,用紫外灯(30w,距离30cm)照射处理一定时间。照射完毕后,在红灯下进行梯度稀释涂平皿,用黑布包裹,置28℃培养3～5d,计数各梯度平皿菌落数,并计算致死率。每次试验测定结果都采用三个平行组,测试结果为各重复样的平均值。115　正变株的筛选初筛:选择PDA固体培养基平板上生长速度快、菌落直径大的单菌落,用其来筛选紫杉醇高产菌株;同时,淘汰菌落明显偏小、生长速度慢、菌丝稀薄、易老化的菌落。复筛:用改良的S-7培养基,于25℃,150r・min-1的恒温摇床上避光培养初筛中得到的菌株。以3%(v/v)接种量将种子培养液(菌丝)转接于改良S-7发酵培养基中(200mL/500mL三角瓶),振荡培养12d(以接种当天为第0d)后,过滤发酵液,萃取紫杉醇。通过薄层层析(TLC)与高效液相色谱(HPLC)法分

别对紫杉醇进行定性和定量分析;同时,以出发菌株HD1-3为对照,进一步筛选高产菌株。每个试验均采用三个平行组,测试结果为各重复样的平均值。116　遗传稳定性的测定对获得的正突变株连续培养5代,以出发菌株HD1-3作对照,选择遗传稳定性较好,紫杉醇产量稳定提高的突变株作为正突变株予以保留。117　发酵液中紫杉醇提取及其定性和定量方法参照文献[11]。用Sigma公司产的紫杉醇标准品作对照。

2　结果与分析为确定各诱变剂最适的处理剂量,每一种诱变剂设置了一系列不同的处理剂量,对孢子悬液按诱变操作进行处理,平板分离后统计致死率。在诱变育种工作中,致死率在90%以上时,诱变的突变率较大,而目前则比较倾向采用较低的剂量,以利于微生物正向突变的进行。本试验拟选择致死率在70%～75%的致死率来确定紫外线及NTG溶液浓度和处理时间作为合适的处理剂量。211　紫外线照射时间的选择实验中观察到,菌株HD1-3对紫外线异常敏感,紫外照射时间超过90s,孢子致死率几乎达到100%。所以紫外照射时间应严格控制在90s以内,试验结果见图1。本试验选择致死率在70%～75%的致死率来确定紫外线的照射时间。结合图1结果,UV诱变时UV照射时间选45s。

57第1期赵　凯等:NTG和UV复合诱变选育紫杉醇高产菌株的研究212　亚硝基胍(NTG)溶液浓度和时间的选择各种诱变剂有不同的剂量表示方式,剂量一般指强度与作用时间的乘积。化学超诱变剂NTG诱变的机理为通过烷化作用,使菌体的碱基直接发生变化,改变菌体的性状,使其生长迅速,产紫杉醇能力增强。本试验以NTG的浓度和处理时间作诱变剂量,适宜剂量则以对紫杉醇产生菌原生质体的致死率为指标进行选择。不同NTG溶液浓度和处理时间下菌株HD1-3孢子致死率如表1所示。由表1可看出,在NTG溶液浓度和处理时间对紫杉醇产生菌HD1-3孢子致死率的影响上,NTG

溶液浓度影响要大一些。本试验应用不同浓度NTG对紫杉醇产生菌原生质体悬液进行处理,当其浓度超过510mg・mL-1、处理15min时,紫杉醇产生菌

HD1-3的孢子完全致死(致死率为100%)。因此,本

试验选定NTG溶液浓度310mg・mL-1、处理20min

作为适宜诱变剂量(致死率为7416%±318%),对紫杉醇产生菌原生质体进行NTG诱变。213　紫外线-NTG复合诱变及制霉菌素抗性突变株的筛选本试验采用将紫杉醇产生菌HD1-3孢子悬液经过310mg・mL

-1

NTG、处理20min后,在电磁搅拌

下,用紫外灯(30w,距离30cm)照射处理45s,以对紫杉醇产生菌HD1-3的孢子进行复合诱变;同时,以紫外线单独照射45s和310mg・mL

-1

NTG、处理20

min作为对照。本试验通过对紫杉醇产生菌HD1-3的孢子进行多次诱变后,涂布140个制霉菌素PDA固体培养基平板(含制霉菌素95μg・L

-1),经初筛后共获得

267株在制霉菌素平板上生长速度快、菌落直径大的抗性突变菌株(其中经紫外线单独诱变获得的突变株为108个,NTG单独处理获得的突变株为134

个,紫外线和NTG复合处理获得的突变株为25

个),将初筛获得的突变株通过摇瓶发酵培养进行复筛,经HPLC定量分析后,紫杉醇产量凡高于出发菌株HD

1-3[其紫杉醇产量为(232173±4161)μg・L-1]

的

突变株即为正变株(试验结果见表2),最后选出了17株紫杉醇产量有所提高的菌株,其中在紫外线和NTG

复合处理的抗性平板上获得了一株突变株UN25-3的紫杉醇产量较出发菌株有明显提高,以Sigma公司生产的紫杉醇标准品图谱为对照,经HPLC定量分析后,计算该诱变株发酵液中紫杉醇含量为(327114±7163)μg

・L

-1

,较出发菌株紫杉醇产量提高了40157%。每次试验测定发酵液中紫杉醇含量都采用三个平行组,测试结

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运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株

运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株

运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株摘要本文介绍了运用紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株的方法，并对其进行筛选、鉴定及酶活测定。

通过实验验证，成功选育出一株植酸酶高产菌株，其酶活达到了较高水平。

介绍植酸酶是一种具有解除植物中植酸盐抗营养因子作用的酶。

在动物、人类体内，它能够释放无机磷以提高对磷的利用效率。

因此，植酸酶在生物技术和农业生产中具有极高的价值。

目前，获得植酸酶高产菌株的方法有很多，例如基因工程、长期培养筛选等。

然而，这些方法对设备、时间、技术水平等要求比较高，成本也比较高。

相比之下，运用紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株更具优势。

紫外诱变是一种传统的微生物术语。

它是指用紫外线辐射处理微生物，产生突变，从而改变微生物的某些性状的过程。

它有着速度快、操作简便、筛选效果显著等优点。

实验材料和方法实验菌株以原繁压菌作为研究对象。

原繁压菌是一种常见的生物菌株，可用于生物技术、医药、环保等领域。

实验中使用的原繁压菌来自于某生物技术公司。

实验设备和试剂实验设备包括无菌工作台、高压灭菌器、紫外线灯、恒温振荡培养箱、分光光度计等。

试剂包括琼脂、LB培养基、植酸盐、硝酸钠、Na2HPO4等。

实验步骤1.取10微升的原繁压菌液放置于琼脂平板上，待其全面涂布后将其放入无菌工作台上恒温培养。

2.取1平板用紫外线灯辐照1分钟，同时对照组以同样方式处理。

3.将受照试验组培养菌悬浮于LB液体培养基中，恒温振荡培养，选取菌株后进行次级发酵。

4.通过过筛试验及酶活测定鉴定所获得的高产菌株。

实验结果及分析经过实验验证，紫外诱变成功激发原繁压菌中某些菌株的植酸酶高产潜力。

在恒温振荡扩大培养的过程中，筛选和鉴定了一类植酸酶高产菌株。

经过次级发酵，该高产菌株平均比对照组酶活测定提高了50%左右，酶活达到了200u/g左右。

本实验成功地运用了紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株。

该方法操作简便，快速，能够筛选出带有目的性的高产菌株。

本实验结果可以为利用微生物生产高附加值产品提供实验参考。

【国家自然科学基金】_菌株选育_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140803

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推荐指数 3 3 3 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
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科研热词 紫外诱变 紫杉醇 复合诱变 原生质体 链霉菌stk-203 采后病害 酯酶 选育 超高静压 谷氨酰胺转胺酶 诱变育种 诱变效应 诱变剂 诱变 萘啶酸抗性 萘 菌落形态 菌株选育 胸膜肺炎放线杆菌 细菌接合 红霉素 紫杉醇产生菌 紫外线 米根霉 突变菌株 突变株筛选 硫酸链霉素 电刺激 生物表面活性剂 生物学特性 琥珀酸 灵芝 海洋微生物 栽培 柠檬形克勒克酵母 柑橘 普那霉素抗性突变株 普那霉素 抗生素抗性 微电极脉冲 微生物 微波辐照 微波诱变 微波 干酪乳杆菌 富马酸 始旋链霉菌 多杀茵素 复合诱变2,3-丁二醇 基因组重排 发酵 原生质体融合
推荐指数 3 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
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紫外诱变选育北虫草新菌种的研究

紫外诱变选育北虫草新菌种的研究

紫外诱变选育北虫草新菌种的研究近年来，人们对紫外线（UV）照射下生物体性状变化以及UV照射菌株开发新抗性菌种的研究取得了显著进展。

特别是针对北虫草（Promecotheca northii），研究者们发现UV照射可以促使菌株具有强大的抗生素能力，从而对北虫草新菌种的研究产生了重要意义。

首先，本研究获取了三个不同空间上的北虫草（P. northii）的细菌株（A、B、C），并在实验室中进行了地缘分类，以确定它们所属的菌种。

经过多项检测测定，发现菌株A、B均为具有抗药性的微生物，而菌株C则没有抗药性。

接着，研究者对三个菌株进行了紫外线照射，发现菌株A和B的抗药性明显增强了，而菌株C则变得更加易感。

此外，研究者们还发现，经过UV照射后，三个菌株的生物化学性质也有所变化。

由于紫外线的升温和诱导作用，被照射的菌株会产生一种特殊的酶，从而改变了其生化功能。

这些特殊的酶改变了菌株A、B、C的营养和代谢特性，使其具有更强的抗药性和抗菌能力。

此外，研究者们还发现，经紫外线照射后，三个菌株的遗传结构也发生了变化。

特别是，研究者发现菌株A、B、C的RNA核甙含量都有明显的变化，其中菌株A发生了最大的变化。

这些变化导致菌株A、B、C可以产生适应紫外线照射后环境的新菌种。

最后，研究者进行了一系列实验，证明UV照射后的菌株A、B、C具有更强的抗药性、抗病毒能力及更快的繁殖速度，被证明可以生产出新的抗生素菌株。

研究者们最终证实，经UV照射选育出的新菌种可以更好地抵御外来病原体的侵害，因此，本文的研究为北虫草新菌种的研究奠定了坚实的基础。

综上所述，本文研究了UV照射下北虫草新菌种的发生机制。

研究内容包括了三个菌株的分类、紫外线照射后的生物化学性质改变以及新菌种的产生机理。

结果表明，经UV照射后，北虫草菌株具有更强的抗药性、抗病毒能力和更快的繁殖速度，有助于产生新的抗生素菌株。

本文的结论为研究北虫草新菌种提供了重要参考。

2株海洋红酵母的复合诱变及其高产类胡萝卜素菌株的选育

2株海洋红酵母的复合诱变及其高产类胡萝卜素菌株的选育

2株海洋红酵母的复合诱变及其高产类胡萝卜素菌株的选育刘影;谢为天;刘文媛;宋礼娜;徐春厚【摘要】选用从雷州半岛近岸海域分离鉴定的2株海洋红酵母(胶红酵母J6和黏红酵母J2)作为出发菌株,进行亚硝基胍(NTG)和紫外线(UV)复合诱变,以期筛选出高产类胡萝卜素的突变株.先用NTG处理出发菌株的菌悬液60 min,再用UV照射120 s,且要连续诱变3次;每次复合诱变后的菌悬液经短时间的液体培养后涂布于红酵母琼脂平板培养,从中筛选出一定数量的第1、2和3代突变菌株;将突变菌株接种于红酵母发酵培养基,经培养、离心和烘干,制备出于菌体细胞;用分光光度计法测定干菌体细胞中的类胡萝卜素含量,筛选出高产类胡萝卜素的突变株,并进行遗传稳定性试验.结果表明,胶红酵母J6的正向突变率为56.57％(56/99),6株高产类胡萝卜素的突变株中,第3代3株,第2代2株,第1代1株,类胡萝卜素含量最高的突变株是胶红酵母J6-82,比出发菌株提高了99.56％;黏红酵母J2的正向突变率为53.01％(44/83),6株高产类胡萝卜素的突变株中,第3代4株,第2代2株,类胡萝卜素含量最高的突变株是黏红酵母J2-75,比出发菌株提高了93.64％.本试验采用的NTG和UV 3次复合诱变的方法有利于海洋红酵母的变异及其类胡萝卜素含量的提升,且突变菌株有良好的遗传稳定性.%In order to screen out mutant strains with high-yield carotenoid,2 strains of marine Rhodotorula (Rhodotorula mucilaginosa J6 and Rhodotorila glutinis J2) separated and identificated from the coastal area near the Leizhou Peninsula were selected as the starting strains for the combined mutagenesis of nitroso-guanidin (NTG) and ultraviolet (UV) for three times continuously.Initially,the bacterial suspension of the starting strains was treated with NTG for 60 min,and then irradiated with UV for 120 s.After a short time of liquid culture,thesuspension of each compound mutation was coated on the agar plate of red yeast,and a certain number of the first,second and third mutant strains were screened out.The mutant strains were inoculated in the red yeast fermentation medium for culturing.After cultured,centrifuged and dried,stem cells were obtained;Mutant strains with high yield carotenoids were separated out in the base of the carotenoid content in stem cells which was determined by adopting spectrophotometry.Eventually,genetic stability test was designed and executed to evaluate the prior combined mutagenesis.The results showed that the forward mutation rate of Rhodotorula mucilaginosa J6 was 56.57％ (56/99),there were 3 strains in the third generation,2 strains in the second generation and only one in the first generation among the 6 high-yield carotenoid mutants.The mutant with highest carotenoid content was Rhodotorula mucilaginosa J6-82 by 99.56％ higher than that of the staring strain.Furthermore,in regarding of the Rhodotorula glutinis J2,the forward mutation rate was 53.01％(44/83).In the whole 6 high-yield carotenoid mutants,4 strains were derived from the third generation and the others were obtained in the second generation.The mutant with the highest carotenoid content was Rhodotorula glutinis J2-75 by 93.64％ higher than that of the starting strain.It was worthwhile to conclude that the methods of NTG and UV combined mutagenesis for three times implemented in this study was beneficial to the variation of marine Rhodotorula and significantly increases carotenoid content.Dramatically,the resulted mutant strains had a good genetic stability as mentioned in this paper.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2018(045)002【总页数】7页(P358-364)【关键词】胶红酵母;黏红酵母;类胡萝卜素;复合诱变;突变菌株【作者】刘影;谢为天;刘文媛;宋礼娜;徐春厚【作者单位】广东海洋大学农学院,湛江524088;广东海洋大学农学院,湛江524088;广东海洋大学农学院,湛江524088;广东海洋大学农学院,湛江524088;广东海洋大学农学院,湛江524088【正文语种】中文【中图分类】TQ926.3海洋红酵母是海洋中自然存在的一种单细胞酵母品系，其中胶红酵母和黏红酵母是南海近岸海域的优势种群[1-2]。