毛霉高产蛋白酶菌株产酶条件的优化

大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。

通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。

蛋白酶生产菌的产酶条件研究摘要：本文研究了蛋白酶生产菌的产酶条件，包括培养基、温度、pH值、氮源、碳源、微量元素等因素对蛋白酶产量的影响。

结果表明，较佳的产酶条件为：培养基为牛肉膏蛋白培养基，温度为30℃，pH值为7.0，氮源为酵母粉，碳源为葡萄糖，微量元素为FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O和MnSO4·4H2O。

关键词：蛋白酶生产菌；产酶条件；培养基；温度；pH值；氮源；碳源；微量元素一、引言蛋白酶是一类水解蛋白质的酶，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。

目前，蛋白酶的生产主要依靠微生物发酵。

因此，研究蛋白酶生产菌的产酶条件对于提高蛋白酶产量具有重要意义。

二、实验材料和方法2.1 实验材料实验菌株为产酶能力较强的芽孢杆菌；培养基为牛肉膏蛋白培养基；氮源包括酵母粉、尿素、胰蛋白胨和硝酸铵；碳源包括葡萄糖、麦芽糖、玉米粉和淀粉；微量元素包括FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O 和MnSO4·4H2O。

2.2 实验方法2.2.1 培养条件所有菌株均在37℃下保存，实验前取出，接种到液体牛肉膏蛋白培养基中，培养24小时后进行实验。

2.2.2 测定酶活力取培养液进行离心，取上清液作为酶液，用凝胶电泳法测定酶活力。

2.3 实验设计本实验采用单因素试验设计，探讨培养基、温度、pH值、氮源、碳源、微量元素等因素对蛋白酶产量的影响。

三、结果与分析3.1 培养基对蛋白酶产量的影响本实验选用了牛肉膏蛋白培养基、脱脂牛奶、酵母提取物、玉米粉和淀粉等5种培养基进行对比。

结果表明，牛肉膏蛋白培养基的蛋白酶产量最高，为1.63 U/mL，而脱脂牛奶、酵母提取物、玉米粉和淀粉的蛋白酶产量分别为0.84 U/mL、1.22 U/mL、1.09 U/mL和1.05 U/mL。

因此，牛肉膏蛋白培养基是较优的培养基。

3.2 温度对蛋白酶产量的影响本实验选用了25℃、30℃、35℃、40℃和45℃等5种温度进行对比。

毛霉ZG-2菌株产蛋白酶条件优化巩晓芳;张宗舟;薛林贵;张红光;李琳;赵燕【摘要】对毛霉ZG-2菌株的产蛋白酶条件进行优化,以便于生抽大曲的大规模生产.结果表明,在大豆粉40％、麸皮60％、加水100％(V/m)、温度40℃条件下,制成的大曲蛋白酶活性最高,其中酸性蛋白酶酶活2 314 U/g、中性蛋白酶酶活4 602 U/g、碱性蛋白酶酶活1 352 U/g;加120 g/L食盐水溶液进行稀醪发酵60 d,原料蛋白质转化率最高,达79.3％.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2013(042)004【总页数】4页(P164-167)【关键词】蛋白酶;毛霉ZG-2;稀醪发酵【作者】巩晓芳;张宗舟;薛林贵;张红光;李琳;赵燕【作者单位】兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;天水师范学院生命科学与化学学院,甘肃天水741001;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070【正文语种】中文【中图分类】TS201.25酱类是开门七件事之一，在中国人日常生活中具有重要的作用。

随着生活水平的不断提高，人们对酱类的质量要求也越来越高。

随着科学的发展，酱类的发酵技术也在不断提高，先后经历了大曲高盐稀醪发酵、无盐固态发酵、低盐固态发酵、低盐固态混菌共酵。

几十年来，研究人员一直追求蛋白酶活性的提高、原料转化率的提高、多菌共酵［1］、多酶互作［2］、产品色香味体具佳［3］。

太空育种是当前开发和培育新的优良菌种的有效研究方法之一［4－5］，从神舟6号飞船搭载的大曲中，筛选出8个优良的毛霉属菌株，其蛋白酶活性远高于出发菌株，将蛋白酶活性较高的毛霉ZG－2菌株，与曲霉属的米曲霉相配套，进行了生抽生产的中试，取得了良好的结果［6－7］，其产品的色、香、味、体经过模糊综合评价均达到较满意的水平，各项质量指标均高于国家标准，原料转化率也有所提高。

角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究角蛋白酶是一种重要的酶类蛋白，在食品、医药、皮革等领域具有广泛的应用价值。

为了提高角蛋白酶的产量和活性，角蛋白酶工程菌株的酶条件需要进行优化研究。

本文将从菌株选择、培养基组成、培养条件等方面探讨角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究。

首先，选择适合的菌株是进行角蛋白酶产酶条件优化的基础。

目前常用的工程菌株有大肠杆菌（Escherichia coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等。

这些菌株具有较高的生长速度和较好的表达能力，但也存在着一些问题，如蛋白质形成包涵体、酶活性低等。

因此，选择适合目标酶表达和活性的菌株是十分重要的。

其次，培养基组成对角蛋白酶产酶条件的优化也起到了至关重要的作用。

培养基的主要组成包括碳源、氮源、微量元素等。

在选择碳源方面，常用的有葡萄糖、麦芽糖等，但不同碳源对菌株的生长和酶的产量有不同的影响，因此需要进行筛选和优化。

氮源的选择包括无机氮源和有机氮源，如氨基酸和蛋白质等。

微量元素的添加也对角蛋白酶的产量和活性有影响，如金属离子（如镁离子、锰离子）和维生素等。

因此，合理选择培养基组成是进行角蛋白酶产酶条件优化的关键。

最后，培养条件的优化也对角蛋白酶的产量和活性具有重要影响。

培养条件包括温度、pH值、发酵时间等方面。

温度的选择主要取决于菌株的最适生长温度，一般在菌株的最适生长温度附近进行发酵。

pH值的选择也对角蛋白酶的产量和活性有影响，一般在菌株最适生长pH值附近进行发酵。

此外，发酵时间的选择也需要根据菌株的生长速度和目标酶的表达和积累情况来进行调整。

综上所述，角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究包括菌株选择、培养基组成和培养条件的优化。

通过合理选择菌株、优化培养基组成和调整培养条件，可以提高角蛋白酶的产量和活性，为其在食品、医药、皮革等领域的应用提供技术支持。

当然，由于研究深度有限，仍然需要进一步探索和优化。

产酶条件优化实验
产酶条件优化实验是一种常用的方法，用于确定最佳的培养条件以提高酶的产量。

以下是一些常见的优化实验方法：
1. 培养基成分优化：通过调整培养基中的碳源、氮源、无机盐等成分的浓度和比例，来寻找最适合酶产量的组合。

2. 培养条件调控：包括温度、pH值、培养时间、初始菌液浓度等的调节，以找到适合酶活性和细胞生长的最佳条件。

3. 添加辅助物质：有些辅助物质如酶诱导剂、共诱导剂等可以促进酶的合成和分泌，通过添加适当的浓度来增加酶的产量。

4. 营养补充：通过添加适量的酵母提取物、维生素、微量元素等来增加细胞代谢活性，从而提高酶的产量。

5. 发酵工艺优化：对发酵参数如搅拌速度、通气量、发酵方式等进行调整，以提高产酶效果。

需要根据具体的产酶菌株和酶的类型进行实验设计和优化，建议在科学研究机构或者相关实验室进行操作以确保安全和可靠性。

角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究角蛋白酶是一种重要的酶类，广泛应用于食品、制药、皮肤护理等领域。

角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化是提高酶产量和活性的关键。

本文将从培养基成分、培养条件、酶诱导物、温度和pH值等方面，探讨角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究。

首先，培养基成分对角蛋白酶产酶起着重要的影响。

常见的培养基成分包括碳源、氮源、无机盐和添加剂等。

碳源的选择是影响菌株产酶的关键因素之一。

大部分角蛋白酶工程菌株对简单碳源如葡萄糖、果糖和麦芽糖具有较高的利用率。

氮源对菌株生长和酶产量也有显著影响。

常用的氮源包括氨基酸、尿素和酵母粉等。

无机盐和添加剂的加入可以满足菌株生长的微量营养需求，例如磷酸盐、镁盐和微量元素等。

其次，培养条件对角蛋白酶产酶也有重要影响。

温度是一个关键因素，常见的菌株产酶温度适宜范围为35-40摄氏度。

在菌株产酶初期，培养温度较低有利于菌株生长，而在后期，提高温度可以增强角蛋白酶的产量。

pH值是另一个重要因素，菌株产酶的适宜pH范围通常在7-8之间。

过高或过低的pH值都会影响菌株的生长和酶活性。

酶诱导物也是优化角蛋白酶产酶条件的关键因素之一。

常用的酶诱导物包括激素、金属离子和特定的诱导剂等。

激素能够通过激活转录因子的作用而促进酶的产生。

金属离子如钙离子和锌离子可以作为酶的辅因子参与酶的活化和稳定作用。

特定的诱导剂能够诱导菌株产生更高产量的角蛋白酶。

选择适当的酶诱导物能够提高酶产量和活性。

最后，温度和pH值是影响角蛋白酶产酶的重要条件。

温度的选择要考虑到菌株生长的最适温度，过高或过低的温度都会影响菌株的生长和酶活性。

在角蛋白酶产酶的过程中，温度的变化可以影响到酶的合成速率和空间结构。

而pH值的变化也会影响到酶的酸碱性质和稳定性。

因此，在角蛋白酶产酶过程中要选择适宜的温度和pH值条件。

综上所述，角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究包括培养基成分的优化、培养条件的优化、酶诱导物的选择和温度、pH值的调节。

土壤中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【摘要】从海南土壤中筛选得到一株高产蛋白酶的菌株,并对其进行菌种鉴定、产蛋白酶发酵条件优化及蛋白酶分子质量测定.经筛选,得到一株高产蛋白酶的菌株,编号为CAUH83,蛋白酶活力达到126 U/mL.通过形态观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析,鉴定菌株CAUH83为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens).通过单因素试验优化,确定该菌株产蛋白酶的最优发酵条件:大豆粉3.0％、蔗糖3.0％、初始pH 6.0、培养温度30 ℃、培养时间48 h.在此优化发酵条件下,该菌株产蛋白酶酶活力达到1 932.3 U/mL,较优化前提高15.3倍.通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和酶谱分析表明该蛋白酶分子质量约51 kDa.%A strain with high yield protease was isolated from soil sample of Hainan. The identification, fermentation conditions optimization and molecular mass of the strain were determined. After screening, a strain CAUH83 with high yield protease was obtained and the enzyme activity was 126 U/ml. Through morphological observation, physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis, strain CAUH83 was identified asSerratia marcescens. The optimal fermentation conditions were optimized by single factor experiments as follows: soybean flour 3.0％, sucrose 3.0％, initial pH 6.0, culture temperature 30 ℃ and time 48 h. Under the optimal conditions, the highest protease activity of the strain was 1 932.3 U/ml, which increased 15.3 times higher than that of before optimization. The molecular mass of the protease was about 51 kDa by SDS-PAGE and protease zymogram analysis.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)004【总页数】6页(P66-71)【关键词】粘质沙雷氏菌;筛选鉴定;蛋白酶;发酵条件优化【作者】耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【作者单位】中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学工学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083【正文语种】中文【中图分类】TS201.3蛋白酶(protelytic enzymes,EC 3.4)是催化肽键水解的一类酶,在食品、饲料、医药、化工等行业有着广泛的应用［1］。

一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件-信息化建设中心-广东轻工一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。

采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。

通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)。

通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。

在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。

关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIEGui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate ofprotein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimalcondition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition *基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2021B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ202107），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ202103）。

产蛋白酶菌的分离鉴定及产酶条件优化王鼎;余淼;付洋洋;郭春华;彭忠利;高彦华【摘要】This research isolated protease-producing strain from cattle rumen,16 strains were selected by the casein hydrolysis bined HE value and protease activity,a strain(named A18)with the mighest activity of proteinase(415.82 U/mL)as the test strain.And it was identified as Aspergillusoryzae by morphological observation and 18S rDNA sequence analysis.We got the inoculation amount 4%,the optimum temperature 30 ℃,time 60 h through the single factor test.By th e response surface analysis(RSA)methods and repeated experiments,the optimal fermentation conditions were determined as follows:inoculation quantity 4%,temperature 29 ℃, time 55 h.The highest enzyme activity reached 527.57 U/mL,which increased by 22.6% than before optimization.%本试验菌源取自肉牛瘤胃液,首先用酪蛋白水解圈法初选出16株产蛋白酶菌株,综合HE值和蛋白酶活性,选出一株蛋白酶活性最高A18作为后续试验菌株,该菌株蛋白酶活为415.82 U/mL,通过形态和分子鉴定确定此菌株为米曲霉菌.单因素试验确定接种量为4%、培养温度为30℃、培养时间为60 h,通过响应面分析法及多次重复试验,得出接种量4%、温度29℃、时间55 h为其最佳产酶条件,最高酶活达527.57U/mL,比优化之前提高了22.6%.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2018(000)007【总页数】6页(P14-19)【关键词】蛋白酶;米曲霉;优化;响应面法【作者】王鼎;余淼;付洋洋;郭春华;彭忠利;高彦华【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;成都大帝汉克生物科技有限公司,四川成都611130;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】S816.3蛋白酶存在于动物、植物、微生物中，属于水解酶类，约占世界酶制剂销量的60%（马俊阳等，2014）。

毛霉产蛋白酶的特性研究
林亲录;赵谋明;邓靖;肖怀秋
【期刊名称】《食品科学》
【年(卷),期】2005(026)005
【摘要】研究了不同的培养时间、翻曲及NaCl对本课题组分离得到的毛霉的蛋白酶活力的影响,探讨了不同的毛霉蛋白酶提取方法,并对比了福林酚法测定蛋白酶活力时的最佳吸收波长.结果表明:该株毛霉麸曲固态培养72h时蛋白酶活力最高;培养24h后翻曲一次能显著提高酶活力;用盐水麸曲制曲培养时,用蒸馏水提取可获得较高活力的复合蛋白酶;测定蛋白酶活力时,最佳吸收波长为690nm.
【总页数】4页(P44-47)
【作者】林亲录;赵谋明;邓靖;肖怀秋
【作者单位】华南理工大学食品与生物工程学院,广东,广州,510641;湖南农业大学食品科技学院,湖南,长沙,410128;华南理工大学食品与生物工程学院,广东,广
州,510641;湖南农业大学食品科技学院,湖南,长沙,410128;湖南农业大学食品科技学院,湖南,长沙,410128
【正文语种】中文
【中图分类】TS261.12
【相关文献】
1.毛霉M263-3产蛋白酶的特性研究 [J], 林曙;李碧波
2.毛霉产蛋白酶的特性及其应用研究 [J], 李理;罗泽民;卢向阳
3.毛霉产蛋白酶特性及条件研究 [J], 邓靖;林亲录;周俊清;赵谋明
4.毛霉3039产蛋白酶特性研究 [J], 邵伟;邹雪;陈菽;李玲
5.产蛋白酶毛霉的分离筛选及发酵豆粕产大豆肽的初步研究 [J], 庞宗文;李敏;李树波;梁静娟
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枯草芽孢杆菌产角蛋白酶条件优化大家好，今天我要和大家聊聊一个“毛茸茸”的话题——枯草芽孢杆菌产角蛋白酶条件优化。

说起角蛋白酶，大家可能会有些陌生，但它可是个厉害角色哦！这货可是可以帮助我们消化食物的酶，谁家的胃里没有它可是憋屈了。

而枯草芽孢杆菌是一个很热门的生物工程“小明星”，它可以通过发酵的方式产生角蛋白酶，天然无公害，绿色环保，真是走在了科技的前沿呢！1.1 问题背景不过，虽然这两货看起来强大无比，但是它们产生角蛋白酶的条件可不是那么简单，有点“苛刻”呢！所以我们急需对这个酶的产生条件进行优化，让这两个家伙开开心心地产酶，不要再委屈它们了！1.2 研究意义为了进一步促进生物工程领域的发展，优化枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的条件就显得尤为重要。

如果我们能够找到最适合它们产酶的条件，不但可以提高产酶效率，还能节约资源，更环保，科技救地球啊！二、材料与方法2.1 实验材料首先我们需要准备好实验材料，包括枯草芽孢杆菌菌种、培养基、试剂等等。

得有吃的、有喝的，别到时候缺了东西，搞巧克力不给糖的尴尬局面。

2.2 实验方法然后我们要好好琢磨一下实验方法了，这个可是关键啊！我们需要通过改变生长温度、培养基成分、搅拌速度等因素，来优化角蛋白酶的产生条件。

得用点脑子，动个手脚，让它们产酶的效率更高！三、结果与讨论3.1 实验结果终于到了揭晓实验结果的时刻了！经过我们的努力，我们找到了最佳的产酶条件，让枯草芽孢杆菌和它的“好基友”角蛋白酶达到了最佳状态，产酶效率提升了不少，看起来又充满了生机！3.2 结果讨论通过对实验结果的分析和讨论，我们发现，生长温度对角蛋白酶的产生影响最大，而培养基成分和搅拌速度也起到了一定的作用。

所以在以后的研究中，我们可以更加关注这些因素，进一步提高产酶效率，让这两个“伙伴”更默契地合作！四、结论和展望通过本次研究，我们成功地优化了枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的条件，取得了一定的成果。

尽管有许多地方还有待改进，但我们相信在未来的研究中，会有更多的收获和突破。

角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究张秀江;孙小玉;谷立峰;胡虹;王秋菊;刘莹莹;杨灵杰【摘要】通过对菌株Bacillus subtilis YKM05发酵产酶条件的优化研究,使其产角蛋白酶活力显著提升.最适产酶诱导物为羽毛粉,最适碳源为玉米粉,最适氮源为豆粕粉,Ca2+、Fe3+对产酶有促进效果,Mn2+、Zn2+、Cu2+对产酶有抑制效果.最佳的培养基组成为:羽毛粉2.0％、玉米粉2.0％、豆粕粉2.0％、磷酸二氢钠0.3％、磷酸氢二钠0.5％、氯化钙0.6％.菌株优化产酶条件为:发酵温度36℃、培养基初始pH值为9、种子接种量为3％、1000 mL三角瓶最佳装液量为300 mL、发酵时间72 h.【期刊名称】《河南科学》【年(卷),期】2018(036)012【总页数】6页(P1935-1940)【关键词】角蛋白酶;菌株;发酵;产酶;酶活力【作者】张秀江;孙小玉;谷立峰;胡虹;王秋菊;刘莹莹;杨灵杰【作者单位】河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州 450008;郑州市现代农业科技服务中心,郑州 450000;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州 450008;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州 450008;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省瑞特利生物技术有限公司,郑州 450008【正文语种】中文【中图分类】Q939.9;TQ925+.2角蛋白（Keratin）是一种普遍存在于自然界中且有很强抗性的硬性蛋白，如动物毛发、蹄、角和羽毛等.随着我国畜牧业迅速发展，养殖业不断趋于规模化，羽毛作为家禽饲养和屠宰工业的副产物，产量越来越大，而羽毛中蛋白质和氨基酸含量丰富，是潜在的优良蛋白质资源.角蛋白由于胱氨酸残基所提供的分子间二硫键的高度交联、氢键作用以及分子间的相互疏水作用而使角蛋白化学结构稳定，难以被胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等水解［1］.角蛋白酶（Keratinase）是一种可特异催化降解角蛋白的酶，由微生物产生，在饲料、皮革、纺织、医药等领域具有十分重要的应用价值.以前对角蛋白酶的研究基本上是关于产角蛋白酶菌的分离、筛选以及角蛋白酶的分离纯化和理化性质的研究.近些年随着分子生物学的不断进步，国内外一些学者已经克隆出多个不同来源的角蛋白酶基因，并且进行角蛋白酶的基因工程方面研究，实现了这些基因的异源表达［2］.本研究对构建的产角蛋白酶枯草芽孢杆菌工程菌株摇瓶发酵培养的发酵技术参数和产酶条件进行优化，为角蛋白酶产品开发和推广应用提供依据.1 材料和方法1.1 试验材料1.1.1 菌株地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心.经物理和化学诱变获得产角蛋白酶的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformisYD01），采用定点突变技术从地衣芽孢杆菌中提取其产角蛋白酶的基因并克隆到枯草芽孢杆菌表达载体进行产角蛋白酶的高效表达，依次通过平板筛选、摇瓶发酵和检测酶活，确认得到一株产角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis YKM05）工程菌株.1.1.2 培养基斜面（平板）培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨15 g，牛肉膏0.5 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.5，用于菌株保存与活化. 发酵种子培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨15 g，牛肉膏0.5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.5，用于发酵种子的制备.基础发酵培养基：诱导物2.0%，碳源2.0%，氮源2.0%，磷酸二氢钠0.3%，磷酸氢二钠0.5%，氯化钙0.6%，pH 7.0～7.5.上述培养基均需在121℃、1×105Pa条件下高压蒸汽灭菌30 min.1.2 试验方法1.2.1 菌株YKM05的活化与发酵种子的培养用接种环刮取菌株YKM05斜面或平板培养的菌落转接至装有200 mL发酵种子培养基的500 mL三角瓶中，36℃、100 r/min摇床上培养48 h，备用.1.2.2 菌株YKM05产酶培养基的优化单因素筛选基础发酵培养基产酶诱导物、碳源、氮源、无机盐的种类，配制不同的发酵培养基，确定适合于菌株产角蛋白酶的诱导物、碳源、氮源、无机盐的种类.将配制好的发酵培养基装入1000 mL的三角瓶中，每瓶装量300 mL，121℃、1×105Pa条件下高压蒸汽灭菌30 min.按3%的接种量接入菌株YKM05液体发酵培养的种子，在36℃、100 r/min摇床上培养72 h，取发酵液2500 r/min离心20 min，测定上清液中角蛋白酶的酶活力.1.2.3 菌株YKM05产酶培养条件的优化以优化后的培养基进行菌株YKM05发酵培养试验，以单因素改变发酵过程中的发酵温度、pH值、接种量、装液量、发酵时间等因子，根据发酵过程中产角蛋白酶的活力确定菌株最适宜的发酵培养参数.1.2.4 角蛋白酶酶活力的测定以羽毛粉为发酵底物，发酵液经离心除菌，取其上清液1 mL，加2 mL TrisHClBuffer和10.0 mg羽毛粉（80目），置于40℃水浴保温振荡反应6 h，然后加入2 mL 10%TCA终止反应.30 min后，8000 r/min，4℃离心15 min，上清液于280 nm处测定OD值.以试验组与对照组在280 nm处测定的吸光度OD值表示，吸光度值每增加1所需要的酶量即为1个酶活单位［3］.2 结果与分析2.1 菌株YKM05发酵培养基的优化2.1.1 诱导物对菌株YKM05产酶的影响基础发酵培养基分别加入2%羽毛粉、2%羽毛、2%羊毛、2%角质层作为菌株产酶诱导物，以不加为空白对照，每组设4个重复，分别进行72 h液体发酵培养后，测定发酵液中角蛋白酶的活力.结果表明，发酵培养基中添加2%羽毛粉、2%羽毛、2%羊毛、2%角质层对菌株产酶都有一定的影响，发酵液酶活力不同表明诱导物对菌株产角蛋白酶的影响程度不同（图1）.不添加诱导物菌株产酶活力很低，说明菌株所产的角蛋白酶是一种诱导酶，羽毛粉是最佳诱导物.2.1.2 碳源种类对菌株YKM05产酶的影响基础发酵培养基分别加入2%葡萄糖、2%麦芽糖、2%蔗糖、2%低聚木糖、2%玉米淀粉、2%玉米粉等碳源，每组设4个重复，分别进行72 h液体发酵培养后，测定发酵液角蛋白酶酶活力，结果如图2所示.可以看出，不同种类的碳源对菌株产角蛋白酶有一定的影响.以葡萄糖为对照，麦芽糖、蔗糖、低聚木糖对菌株产酶有一定抑制作用，低聚木糖的菌株产酶只有葡萄糖的50%左右，低聚木糖虽是良好的益生元，但其碳源无法被菌株发酵过程中直接利用.玉米淀粉和玉米粉对菌株产酶有一定的促进作用，玉米粉的促进作用更明显，可能与玉米粉除提供碳源外，还可以提供菌株生长和代谢所需要的其他营养有关.2.1.3 氮源种类对菌株YKM05产酶的影响基础发酵培养基分别加入2%硫酸铵、2%硝酸铵、2%蛋白胨、2%牛肉膏、2%酵母浸粉、2%豆粕粉等氮源，每组设4个重复，72 h液体发酵培养后，测定发酵液角蛋白酶活力.由图3可以看出，与硫酸铵相比，硝酸铵、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、豆粕粉都对菌株产酶有促进作用，以蛋白胨、牛肉膏、豆粕粉作用更为明显，可能与蛋白胨、牛肉膏除提供氮源外，还能为菌株提供未知生长因子.豆粕粉除提供氮源外，还能为菌株生长提供脂肪、碳水化合物、维生素等营养物质有关.图1 不同诱导物对菌株产酶的影响Fig.1 The effect of different inducers on keratinase production图2 不同碳源对菌株产酶的影响Fig.2 The effect of different carbon sourceon keratinase production图3 不同氮源对菌株产酶的影响Fig.3 The effect of different nitrogen source on keratinase production2.1.4 金属离子对菌株YKM05产酶的影响基础发酵培养基分别添加1%的Ca2＋、Fe3＋、Mn2＋、Zn2＋、Cu2＋等不同种类的金属离子，以不加为空白对照，每种金属离子设3个重复，72 h液体发酵培养后，测定发酵液角蛋白酶活力，结果如图4所示. 可以看出，Ca2＋、Fe3＋、Mn2＋、Zn2＋、Cu2＋等不同种类的金属离子对菌株产酶有明显的影响，Ca2＋、Fe3＋对菌株产酶有显著的促进效果，Mn2＋、Zn2＋、Cu2＋对菌株产酶则有明显的抑制作用.2.2 菌株YKM05发酵产酶培养条件的优化2.2.1 温度对菌株YKM05产酶的影响以优化后的发酵培养基分别在20、24、28、32、36、40、44℃发酵培养，每个温度设3个重复，72 h后测定发酵液角蛋白酶活力，结果如图5所示.菌株在36℃发酵时产酶活力最高达到650 U/mL，随着温度的升高或降低，菌株产酶活力都随之降低，说明菌株发酵过程最适温度为36℃.2.2.2 pH值对菌株YKM05产酶的影响以优化后的发酵培养基分别设定初始pH值为6、7、8、9、10、11，每个pH值设3个重复，发酵培养72 h后测定发酵液角蛋白酶活力，结果如图6所示.可以看出，当初始pH值为9时，菌株产酶活力最高达到646.6 U/mL，pH值高于或低于9，菌株产酶活力都下降，说明菌株发酵产酶最适的pH值为9.图4 金属离子对菌株产酶的影响Fig.4 The effect of different metal ions on keratinase production图5 温度对菌株产酶的影响Fig.5 The effect of temperature on keratinase production图6 pH值对菌株产酶的影响Fig.6 The effect of pH of medium on keratinase production2.2.3 接种量对菌株YKM05产酶的影响以优化后的发酵培养基分别按1%、2%、3%、4%、5%、6%接入液体发酵种子，每个接种量设3个重复，发酵培养72 h后测定发酵液角蛋白酶活力，结果如图7所示.菌株发酵种子接种量为3%时，菌株发酵产酶最高，接种量较小时，菌株数量较小，不能快速大量繁殖，导致角蛋白酶分泌较少；当接种量超过一定范围后，必然造成培养基对菌株营养供应不足，影响菌株代谢，同样导致菌株角蛋白酶分泌减少，3%是菌株的最佳接种量.2.2.4 装液量对菌株YKM05产酶的影响 1000 mL三角瓶分别装量300、400、500、600、700、800 mL优化后的发酵培养基，每个装液量设3个重复，发酵培养72 h后测定发酵液角蛋白酶活力，结果如图8所示.可以看出，装液量自300 mL起，随着装液量的增加，菌株的产酶活力逐渐下降，说明菌株为好氧菌，发酵过程中需要有充足的氧气供应.装液量低于300 mL未设试验处理，考虑到1000 mL三角瓶装液量过少可能会引起培养基水分过度蒸发而改变培养基各组分的浓度，导致试验结果误差，再者装液量过少发酵液体积过小造成发酵规模过小，实际生产应用意义不大.1000 mL三角瓶最佳装液量为300 mL.图7 接种量对菌株产酶的影响Fig.7 The effect of number of vaccinations on keratinase production表8 装液量对菌株产酶的影响Fig.8 The effect of liquid volume on keratinase production2.2.5 发酵时间对菌株YKM05产酶的影响以优化后的发酵培养基进行液体发酵培养96 h，设置3个平行的重复，自12 h开始，每12 h分别测定发酵液角蛋白酶活力，结果如图9所示.发酵12 h时，角蛋白酶活力较低，随着发酵过程的进行，角蛋白酶活力稳步提高，72 h达到最大值670 U/mL，之后随着时间的延长，角蛋白酶活力呈逐渐下降的趋势.图9 发酵时间对菌株产酶的影响Fig.9 The effect of fermentation time on keratinase production3 讨论动物羽毛的利用，传统的办法有物理和化学的方法降解羽毛角蛋白，但存在着降解过程反应参数不易控制、高耗能、高污染、一些动物氨基酸损失或遭到破坏，以及生产的羽毛蛋白饲料动物消化吸收率低等问题［4-5］.采用角蛋白酶处理羽毛蛋白质，不仅能够克服上述弊端，还可将羽毛角蛋白降解为氨基酸、多肽、小肽等，便于动物消化吸收.降解羽毛角蛋白酶的微生物工程菌株目前研究最系统、最深入的当属地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis PWD-1），PWD-1能在以羽毛为唯一的有机底物的培养条件下生长，以羽毛作为碳源、氮源和能量的来源，能降解通过高温蒸煮的羽毛［6］.该菌所产角蛋白酶基因kerA也已得到克隆并在多种宿主中成功表达［7-8］.Shih将多拷贝的kerA基因整合到地衣芽孢杆菌B.licheniformis染色体上，得到了稳定表达角蛋白酶的转化子，并使角蛋白酶的产量提高了4～6倍［9］.梁斌等把编码地衣芽孢杆菌L-25的角蛋白酶基因kerB克隆到载体pUB18-P43质粒上，转入到B.subtilis菌株DB104中，得到成功表达的FD-8菌株，该菌株分泌角蛋白酶，可以在羽毛培养基上生长并完全水解羽毛［10］.陈坚等采用定点突变技术将地衣芽孢杆菌B.licheniformis BBE11-1的角蛋白酶基因（ker）进行定点突变并克隆连接到枯草芽孢杆菌表达载体，得到一株可以产较好热稳定性角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis，该菌株表达的角蛋白酶比野生型菌株提高了近9倍［11］.杨连等利用解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens K11）从中克隆并获得羽毛降解基因kerK，成功在枯草芽孢杆菌SCK6中进行了表达，再将构建的组成型表达载体转化到原始K11菌株中，获得了重组K1127菌株，该菌株对羽毛的降解效率进一步提高［12］.角蛋白酶的发酵工艺、产酶条件优化方面，研究者主要集中在培养基组成和培养条件对酶活性的影响方面［13］.Ramnani等使用PB实验设计筛选了8个影响地衣芽孢杆菌RG1产角蛋白酶的因素，并通过中心组合实验得到了产酶的最佳培养基组成、培养时间和培养温度，结果该菌产酶活性提高了3.5倍［14］.Anbu对Scopulariopsis brevicaulis产角蛋白酶培养基及条件进行了优化，得到了适合产角蛋白酶的培养基组成、温度和pH等参数［15］.Wang等对地衣芽孢杆菌PWD-1和重组枯草芽孢杆菌FDB-29的最佳发酵过程进行了探讨，两者角蛋白酶均可由蛋白物质诱导，产酶最适温度均为37℃，最佳溶氧水平分别为10%和20%.在50℃培养PWD-1菌株8 h后，转移到37℃发酵培养可使酶产量提高10倍.在发酵条件分别优化后，PWD-1比FDB-29菌株的最终产酶水平高40%［16］.姚淑敏等筛选得到一株对羽毛有较强降解能力的菌株芽孢杆菌，最适的发酵条件为：温度42℃，pH为7.5，转速125 r/min，最高酶活力达25.20 U/mL，外加其他碳源或氮源对角蛋白酶的产生有一定的影响［17］.张玲等以羽毛粉为底物，采用链霉菌（Streptomyces sp.）B221液体发酵生产角蛋白酶，结果表明，该菌产角蛋白酶，在40℃、pH值为9.0、接种量为5%时酶活力最强［18］.董荣斌等研究以羽毛粉为底物，链霉菌（Streptomyces sp.）B221固体发酵条件，结果表明，该菌在培养基含水量为35 mL BM/10 g羽毛、40℃、pH值9.0、接种量为20%时发酵效果最好，最佳发酵周期为6 d［19］.李小会等对角蛋白高效降解菌地衣芽孢杆菌菌株1411-1固体发酵条件进行了优化，结果表明，最适固体发酵条件为：培养基含水量75%，pH值10.0，温度40℃，菌液接种量0.15 mL/g，发酵周期88 h，氮源对固体发酵有显著的抑制作用，碳源的影响不显著［20］.菌株Bacillus subtilis YKM05是本项目研究获得的产角蛋白酶的工程菌株，产角蛋白酶活力较高且酶活特性良好，通过对产酶条件的优化研究，旨在促使菌株发酵水平进一步提高，降低角蛋白酶生产和使用成本，为角蛋白类物质的开发利用提供新的科学方法.4 结论通过对菌株Bacillus subtilis YKM05发酵产酶条件的优化研究，使其产角蛋白酶活力显著提升.最适产酶诱导物为羽毛粉，最适碳源为玉米粉，最适氮源为豆粕粉，Ca2＋、Fe3＋对菌株产酶有促进效果，Mn2＋、Zn2＋、Cu2＋对菌株产酶有抑制作用.最佳的培养基组成为：羽毛粉2.0%、玉米粉2.0%、豆粕粉2.0%、磷酸二氢钠0.3%、磷酸氢二钠0.5%、氯化钙0.6%.菌株优化产酶条件为：发酵温度36℃、培养基初始pH值为9、种子接种量为3%、1000 mL三角瓶最佳装液量为300 mL、发酵时间72 h.【相关文献】［1］WILLIAMS C M，RICHTER C S，MZCKENZIE J M，et al.Identification and characterization of a 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