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![可高产蛋白酶的芽孢杆菌及其诱变选育方法和用途[发明专利]](https://uimg.taocdn.com/d3f93914f90f76c660371a16.webp)
专利名称：可高产蛋白酶的芽孢杆菌及其诱变选育方法和用途专利类型：发明专利
发明人：张日俊,于长青
申请号：CN200410086557.8
申请日：20041026
公开号：CN1766088A
公开日：
20060503
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及的可高产蛋白酶的芽孢杆菌，其分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp，于2004年6月28日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCC No.1180。
其为以保藏号CGMCC No1.769的枯草芽孢杆菌CAU208作为出发菌株，将其单细胞悬浮液依次并循环进行“变紫外线诱变→亚硝基胍诱变→紫外线与亚硝基胍复合诱变”，最后得到一株可高产蛋白酶的芽孢杆菌；可用于液体发酵制备大豆生物活性肽饲料添加剂、酶制剂、富酶益生素等。
所制备的肽类饲料添加剂具有多种用途：提高禽蛋品质；满足消化系统尚未成熟动物的营养需要；补充患过敏性疾病动物的蛋白需要或用来作为乳猪、仔猪等幼龄动物的优质蛋白源，防止豆粕(饼)等蛋白饲料对其产生的肠道粘膜过敏和水肿等疾病。
申请人：中国农业大学
地址：100094 北京市海淀区圆明园西路2号
国籍：CN
代理机构：北京泛华伟业知识产权代理有限公司
代理人：王凤华
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一株高产胞外蛋白酶菌株的选育摘要：本实验采用的菌株来源于XXX大学动科院养牛场中的土壤，通过设置不同的培养基来筛选具有产胞外蛋白酶能力的菌株。
以酪素培养基平板产生的透明圈的直径/菌落直径的大小作为选择标记，经初筛选择出比值大的菌株为出发菌株。
经紫外线诱变处理，培养获得两种未知高产胞外蛋白酶菌株。
对其进行形态观察和生理生化鉴定，结果表明突变菌株w1的形态、生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。
关键字：细菌；胞外蛋白酶；筛选；鉴定蛋白酶（Protease）是催化蛋白质水解的一类酶，微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌生产。
蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。
该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适应性宽，被广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。
目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。
蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。
由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。
常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌（如黑曲霉、根霉）；碱性蛋白酶生产菌（如地衣芽孢杆菌）；中性蛋白酶生产菌（如枯草芽孢杆菌）。
本实验以养牛场土壤中筛选得到的蛋白酶生产菌株为出发菌株，采用紫外线照射诱变方法育种，以筛选得到高产胞外蛋白酶菌株。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 土样：河北农业大学西校区养牛场中的土壤 1.1.2 培养基：（表中数据均为1000mL培养基中所含物质量）筛选培养基：酪素培养基干酪素 1g 酵母膏 0.25g 甘油 1.25g dH2O 250mL K2HPO4 0.125g 琼脂 4g pH 8.0 营养培养基：肉汤培养基蛋白胨 10g 牛肉膏 3g NaCl 5g H2O 1000mL pH 7.4 鉴别性培养基淀粉培养基蛋白胨 10g 明胶培养基蛋白胨 5g牛肉膏 13g 明胶120g dH2O 1000mL pH 7.2―7.4 NaCl 5g 牛肉膏 5g 可溶性淀粉2g dH2O 1000mL 琼脂 16g 葡萄糖发酵培养基蛋白胨 10g 蛋白胨 5g NaCl 5g 葡萄糖5g K2HPO4 0.2g K2PO4 2g dH2O 1000mL 1.6%溴甲酚紫1―2mL dH2O 1000mL pH7.2―7.4 pH 7.2―7.4 葡萄糖蛋白胨培养基乳糖发酵培养基（已配好）柠檬酸盐培养基（已配好）半固体培养基（已配好）三糖铁培养基（已配好）1.2 方法1.2.1 菌种的筛选1.2.1.1 培养基的配置及灭菌按上述方法分别配置肉汤培养基和酵素培养基，配置完成后放入高压灭菌锅于120℃下灭菌20min。
耐高温蛋白酶高产菌株的选育耐高温蛋白酶是一种在高温条件下仍能保持其催化活性的酶，能够在高温下催化生化反应，在制药、食品加工、生物制造等领域具有广泛的应用。
而菌株的选育是提高高温蛋白酶生产的重要手段之一。
一般来说，选育耐高温蛋白酶高产菌株需要分为以下几个步骤：（1）菌株筛选首先需要对天然微生物进行样品筛选，按照对温度、PH等生理参数适应性的要求进行选择，优先选择能在较高温度下生长并产生耐高温酶的菌株，如热门的枯草芽杆菌、厌氧嗜热菌、波形菌等。
筛选后的菌株需要进行基本鉴定和生长繁殖测试，并确定合适生长条件进行培养。
（2）单菌株培养选育高温蛋白酶高产菌株需要从单菌株入手，通过单菌株培养建立菌株库。
具体操作是从混合菌液中挑选单菌株进行分离纯化，然后在适宜菌落计数的培养基中进行扩增，得到比较纯的单一菌株。
（3）启动基因筛选启动基因是指在酶活性调控过程中起到重要作用的基因，比如转录因子、信号转导分子等。
通过筛选不同菌株的启动基因，能够分析菌株酶活性、酶产量等生理参数的变化，从而优选高酶活、高产量的菌株。
（4）基因工程改造通过基因工程技术，将高活性、高产酶的基因导入到新的细胞中进行表达，进而提高酶产量和酶活力。
目前，基因工程改造主要采用选择性筛选、拷贝数增加、等位基因增加等手段进行。
（5）酶活性评估选育出可行的耐高温蛋白酶高产菌株后，需要进行酶活性评估，以确定其酶活力和产酶能力，评价其在工业应用中的适用性。
酶活性评估一般采用激光荧光法、反应热法、电泳法等多种方法进行。
总之，选育出高产、高活力、耐高温的蛋白酶生产菌株需要长期不断的探索和尝试。
将基因工程技术应用于耐高温蛋白酶高产菌株的改造和选育中，能够进一步提高产酶效率和酶活力，推进相关产业的快速发展。
产中性蛋白酶芽孢杆菌的选育摘要：紫外诱变方便易操作，所以本实验选用紫外诱变的方式对分离纯化到的菌株进行诱变，以获得具有较高酶活性或产酶较多的产中性蛋白酶菌株。
本实验对纯化得到的菌株进行LB培养基活化，得到代谢旺盛，酶系活跃的活化菌株，功率15W紫外灯30cm处照射照射分别照射1min、3min，将得到的诱变菌液进行10倍梯度稀释，取10-3~10-6梯度菌液涂布于固体牛奶培养基上，37。
C培养24h，另设一组未经紫外诱变的对照，同样条件下培养。
结果发现，未经诱变的培养基中，-3培养基中出现较多菌株，而-4、-6均无菌株，-5中仅出现一株菌株。
经紫外诱变照射1min的关键词：紫外诱变活化培养蛋白酶引言：从自然环境中分离，经简单筛选而获得的产酶菌株，虽然具备了一定的产酶能力，但是要达到某种特定代谢产物的大量积累，实现高产、优质和低耗的高效转化则需要对菌株进行改良，解除或突破微生物的代谢调控【1】。
随着基因工程技术和代谢控制理论的发展，定向育种发挥着越来越大的作用，但传统的诱变技术仍然是大多数工业微生物育种的重要技术【2】。
传统诱变技术包括应用各种物理化学方法，例如紫外诱变，X射线，NTG诱变，由于其低廉的成本及简单的使用方法，仍然是目前大多数菌体选育首选且使用最多的方法，现有用来进行诱变育种的出发菌株应对诱变剂敏感，变异幅度大，经诱变处理过的高产菌株，并一定是继续提高产量潜力大的菌株。
这是因为，诱变获得的高产菌株再诱变时易出现负突变，继续提高产量较为困难【3】。
本实验利用紫外线进行诱变，得到D1/D2=6：1的诱变菌株，相较于未诱变前D1/D2=8：3酶活力显著提高为原来的2.25倍，可用于进一步的发酵复筛。
1、材料与方法1.1材料1.1.1原料初筛并保藏的菌种1.1.2 培养基1）LB发酵液体培养基：蛋白胨：10.0g；酵母膏：5.0 g；氯化钠：10.0g；蒸馏水：1000mlpH到7.0。
2）初步筛选固体培养基：脱脂奶粉：5.0g；酵母膏：2.0 g；琼脂：20.0g；蒸馏水：1000mlpH: 7.0。
实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离一、教学目标及基本要求1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。
由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。
2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。
利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。
根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。
3. 枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。
有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。
菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。
4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。
本科毕业论文蛋白酶高产菌株的选育以及菌种鉴定专业名称：生物科学 1302学生姓名：**学号： **************师：**蛋白酶高产菌株的选育以及菌种鉴定摘要分离和纯化培养法在实验中常常是分离杂菌筛选所需菌落的有效方法，紫外线诱变可以试验出菌落突变率最高的诱变时间或诱变强度，从而选择最适剂量对纯化菌株进行诱变，产生性能更加优秀的可育后代，这就是菌株的选育过程。
本实验采用以上方法对土壤中的杂菌进行分离纯化，得到纯化的能分解蛋白质的菌株，通过紫外线诱变而获得分解能力强的菌株，即高产蛋白酶的菌株。
菌种鉴定则是对微生物快速深入了解的捷径。
关键字灭菌、培养基、无菌操作、分离纯化、紫外线诱变、菌种鉴定Abstract英文省略。
正文1.蛋白酶菌种的采样由于采样的菌种需要有分解蛋白质的能力，所以采样地点可以是餐饮聚集地或者种植大豆等富含高蛋白植物的土地。
2.蛋白酶菌种的分离纯化2.1.实验用品的灭菌灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物,灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类.本实验主要介绍物理方法的一种,即加热灭菌.加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种.通过加热使菌体内蛋白质凝固变性,从而达到杀菌目的.蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关,含水量越高,其凝固所需要的温度越低.在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,因为在湿热情况下,菌体吸收水分,使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强,可增加灭菌效力.本实验采用高压蒸汽灭菌法。
2.1.1.灭菌前的准备玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞,以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染.常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸,用棉绳以活结扎紧,以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心,轻轻捅入管口,松紧必须适中,管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去,灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌,也可用纸条斜着从吸管尖端包起,逐步向上卷,头端的纸卷捏扁并拧几下,再将包好的吸管集中灭菌.2.1.2.高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌用途广,效率高,是微生物学实验中最常用的灭菌方法.这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的.当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时,水蒸气的温度升高到121℃,经15～30min,可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢.一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。
采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。
通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。
在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。
关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition*基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203）。
![高产耐高温蛋白酶的苏云金芽孢杆菌筛选及培养方法[发明专利]](https://uimg.taocdn.com/2f3bb749dd3383c4ba4cd244.webp)
专利名称：高产耐高温蛋白酶的苏云金芽孢杆菌筛选及培养方法
专利类型：发明专利
发明人：关雄,郑毅,黄志鹏,黄必旺,黄天培,沙莉,李今煜,张群林,吴昌标,余洁,张灵玲
申请号：CN200610069339.2
申请日：20061012
公开号：CN101161811A
公开日：
20080416
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种高产耐高温蛋白酶的苏云金芽孢杆菌筛选及培养方法，采用酪蛋白底物琼脂鉴定平板初筛与发酵酶活测定复筛的方法获得高产耐高温蛋白酶苏云金芽孢杆菌Bt140；采用Plackett－Burman设计与响应面分析法快速获得了Bt140最佳的发酵产酶配方与发酵条件，最终摇瓶发酵水平可达918.56U/mL。
Bt140生产耐高温蛋白酶时，不影响发酵结束收集芽孢生产杀虫剂，使该菌兼具有蛋白酶与杀虫剂两种产品的生产能力。
以1吨发酵为例，除了获得相应的Bt杀虫剂外，还获得60～90Kg1万单位的酶粉。
申请人：福建农林大学
地址：350002 福建省福州市金山福建农林大学产业处
国籍：CN
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课堂报告名称：高产蛋白酶菌株的选育方法武汉轻工大学食品学院王宏勋一、课堂报告依据的知识背景1、遗传变异的物质基础遗传变异有无物质基础以及何种物质可承担遗传变异功能的问题，是生物学中的一个重大理论问题。
利用微生物这一实验对象进行了三个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是 DNA 才是遗传变异的真正物质基础。
三个经典实验是: 一是1928年进行的转化实验。
二是美国人1952年开展的噬菌体感染实验。
三是1956年创立的植物病毒的重建实验。
朊病毒的发现和思考。
无论是 DNA 还是 RNA 作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。
但朊病毒的发现对“蛋白质不是遗传物质的定论也带来一些疑云。
PrP 是具有传染性的蛋白质致病因子，迄今未发现蛋白内有核酸，但已知的传染性疾病的传播必须有核酸组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。
那么这是生命界的又一特例呢？还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢？还有待于生命科学家去认识和探索。
2、遗传物质在细胞内的存在形式除部分病毒的遗传物质是 RNA 外，其余病毒及全部具有典型细胞结构的生物体的遗传物质都是 DNA 。
按其在细胞中存在形式可分成染色体 DNA 和染色体外 DNA 。
原核细胞和真核细胞中的 DNA 存在形式不完全相同。
1）DNA 在原核细胞中的存在方式原核细胞最大的细胞学特点就是无核膜与核仁的分化，只有一个核区称拟核。
其染色体 DNA 处于拟核区，无组蛋白，近年来发现与非组蛋白结合。
结构上为双链环状 DNA 。
几种微生物染色体的物理特性见表。
原核细胞的染色体外DNA 主要指质粒（如 F 因子、 R 因子、 Col 因子）。
2）DNA 在真核细胞中的存在方式真核细胞 DNA分为核 DNA和核外 DNA。
核 DNA即染色体 DNA ，它与组蛋白结合构成具有复杂结构的染色体。
核外DNA是指线粒体和叶绿体等DNA ，其结构与原核细胞的 DNA相似，亦能编码结构蛋白。
耐高温蛋白酶高产菌株的选育耐高温蛋白酶是一种能够在高温环境下保持活性的酶，具有重要的工业应用前景。
选育出高产耐高温蛋白酶的菌株具有重要的研究价值和应用潜力。
下面将介绍一种耐高温蛋白酶高产菌株的选育方法。
选择适合高温环境生长的菌株作为研究对象。
常见的高温耐受菌株包括极限热喜好菌和热喜好菌。
极限热喜好菌一般能在50℃以上的极端高温环境中生存，而热喜好菌则能在40℃-50℃的高温环境中生存。
这些菌株通常具有较高的适应能力和耐受性，是筛选耐高温蛋白酶高产菌株的理想选择。
接下来，通过试验室条件下的筛选，评价和筛选出高产耐高温蛋白酶的菌株。
利用高温环境培养菌株，观察其生长情况和生物产物的表达。
通过测定培养基中蛋白酶活性的变化，评估不同菌株蛋白酶产量的差异。
还可通过PCR和酶活性测定等方法检测菌株中蛋白酶基因的表达水平和活性。
根据各指标的结果，选取表现优异、蛋白酶产量高的菌株作为候选菌株。
然后，通过进一步筛选和改进培养条件，提高菌株的产酶能力。
菌株的产酶能力受到多种因素的影响，包括培养温度、培养时间、碳源和氮源等。
通过对这些因素的调节和优化，可以提高菌株的产酶能力。
可以尝试利用沸腾或高温处理等方法，选择菌株中耐高温蛋白酶基因表达量高的亚种，以获得更高产的菌株。
也可以尝试添加适量的辅酶、酵素诱导剂或抑制剂等物质，以调控菌株的产酶能力。
通过遗传工程方法进一步提高菌株的产酶能力和稳定性。
可以采用基因克隆和基因组编辑等技术，将高活性的耐高温蛋白酶基因导入到高产菌株中，以提高其产酶能力。
还可以通过遗传操作改变菌株的遗传背景和代谢途径，进一步优化产酶能力和产酶稳定性。
通过选择适合高温环境生长的菌株作为研究对象，通过试验室条件下的筛选、评价和改进培养条件，以及利用遗传工程方法提高产酶能力和稳定性，可以选育出高产耐高温蛋白酶的菌株。
这将为耐高温蛋白酶的产业化生产提供有力支持。
耐高温蛋白酶高产菌株的选育【摘要】本文主要研究耐高温蛋白酶高产菌株的选育，通过筛选、培养条件优化、鉴定和应用、改良和进化以及机理研究等方面的探讨，揭示了耐高温蛋白酶高产菌株的特性和潜在应用。
研究发现，通过合理的筛选和培养条件优化，可以获得高产量的耐高温蛋白酶菌株，并通过进一步的改良和进化，提高其产酶效率和稳定性。
对耐高温蛋白酶高产菌株的选育具有重要的研究意义，可以为工业生产和生物技术领域提供可靠的资源。
展望未来，还可以进一步探究其机理，为提高蛋白酶产量和应用提供指导，推动该领域的发展。
【关键词】耐高温蛋白酶、高产菌株、选育、筛选、培养条件优化、鉴定、应用、改良、进化、机理研究、启示、未来研究方向1. 引言1.1 研究背景目前，对耐高温蛋白酶高产菌株的研究已经取得了一定的进展，但仍存在一些问题需要解决。
如何快速筛选出高产菌株、如何优化培养条件以提高产量等等。
对耐高温蛋白酶高产菌株的选育研究具有重要意义。
通过对该领域的深入探索和研究，可以为提高蛋白酶生产效率、拓展蛋白酶在不同领域的应用提供技术支持，推动生物技术的发展和产业的进步。
1.2 研究意义耐高温蛋白酶在生物工业和生物技术领域具有广泛的应用前景，然而目前市场上的耐高温蛋白酶产品大多来源于野生菌株，其产酶效率较低且酶活性不稳定。
通过选育耐高温蛋白酶高产菌株，可以提高酶活性和稳定性，降低生产成本，推动耐高温蛋白酶在工业生产中的应用。
选育耐高温蛋白酶高产菌株，不仅可以满足市场对高效酶制剂的需求，还可以推动我国生物技术产业的发展。
通过优化菌株的培养条件和鉴定鉴定方法，可以提高耐高温蛋白酶的产酶效率和酶活性，拓展其应用领域。
通过对耐高温蛋白酶高产菌株的改良和进化，可以进一步提升酶的特性，以满足不同领域的需求。
研究耐高温蛋白酶高产菌株的机理，有助于深入了解耐高温蛋白酶的生物合成过程和调控机制，为进一步优化菌株提供理论依据。
选育耐高温蛋白酶高产菌株具有重要的科学意义和应用价值，对于促进我国生物技术产业的发展和提高我国在国际上的竞争力具有重要意义。
高产蛋白酶纳豆芽孢杆菌的分离筛选与鉴定孙妍;王加启;奚晓琦;卜登攀;魏宏阳;周凌云【摘要】以北京、大连和日本3个产地的纳豆产品为试验材料,从中筛选可用于畜禽生产的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)蛋向酶高产菌株.先通过酪蛋白平板初筛得到9株芽孢杆菌,再以N1型纳豆芽孢杆菌为模式菌株,对初筛得到的菌株进行菌落和菌体形态观察、生理生化鉴定,确定有5个菌株为纳豆芽孢杆菌.测定5个菌株48 h发酵液中蛋白酶活性,结果表明:菌株NB1为蛋白酶高产菌株,发酵液中蛋白酶活性为19.41 U·mL-1,产蛋白酶特性在6代内可保持稳定.【期刊名称】《沈阳农业大学学报》【年(卷),期】2010(041)002【总页数】6页(P175-180)【关键词】纳豆;纳豆芽孢杆菌;蛋白酶;筛选;鉴定【作者】孙妍;王加启;奚晓琦;卜登攀;魏宏阳;周凌云【作者单位】中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室,北京,100193;中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室,北京,100193;中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室,北京,100193;中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室,北京,100193;中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室,北京,100193;中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室,北京,100193【正文语种】中文【中图分类】Q939.11.8纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）是1906年SAWAMURA从日本传统大豆发酵食品——纳豆中分离得到一种产蛋白酶益生菌[1]。
除了具有抗菌、调节肠道微生物平衡、提高免疫力等益生功能，纳豆芽孢杆菌在增殖过程中还可以产生大量蛋白酶，能够提高畜禽体内消化酶活性[2]，促进消化道生长发育[3]，提高饲料的消化利用率[4]。
耐高温蛋白酶高产菌株的选育耐高温蛋白酶是一种能够在高温条件下长时间保持活性的蛋白酶，具有很大的应用潜力。
在工业生产中，耐高温蛋白酶可以被广泛应用于食品加工、纺织染色等领域。
选育出高产耐高温蛋白酶的菌株对于工业生产来说具有重要意义。
本文将从菌株选育的角度，探讨耐高温蛋白酶高产菌株的选育过程及方法。
三、耐高温蛋白酶高产菌株的选育方法1. 采用遗传工程方法通过遗传工程方法，可以对细菌进行改良，使其具有更好的产酶性能。
可以通过改变细菌的遗传信息，使其产生更多的耐高温蛋白酶。
这种方法可以在分子水平上对细菌进行改造，因此可以更精准地提高菌株的产酶能力。
2. 通过自然筛选利用自然环境中的筛选压力，也可以选育出高产耐高温蛋白酶的菌株。
在高温环境下进行筛选培养，可以促使菌株适应高温环境，从而产生更多的耐高温蛋白酶。
这种方法成本较低，但产出的菌株也相对不稳定。
3. 通过化学诱变化学诱变是一种通过化学物质诱导细菌产生突变的方法，可以获得具有更好产酶性能的菌株。
然后通过对突变菌株的筛选和鉴定，选育出高产耐高温蛋白酶的菌株。
这种方法相对比较简单，但同时也存在突变不稳定性的问题。
四、耐高温蛋白酶高产菌株的选育过程1. 菌株的筛选首先需要进行大量的菌株筛选工作，选取优良的母菌株作为研究对象。
通过对菌株的鉴定和比较，选定具有较好产酶性能的菌株作为进一步研究的对象。
2. 对菌株进行改良接下来可以通过不同的方法对菌株进行改良，如遗传工程、自然筛选或化学诱变等，以获得更好的产酶性能。
在改良的过程中，需要对菌株进行不断的筛选和鉴定，以选育出更具有高产性能的菌株。
3. 稳定性测试最后需要对选育出的高产菌株进行稳定性测试，验证其在不同条件下的产酶性能。
通过稳定性测试可以评估菌株的产酶性能，为后续工业生产提供可靠的菌株资源。
五、结语耐高温蛋白酶高产菌株的选育是一个复杂的过程，需要综合运用遗传工程、自然筛选和化学诱变等方法，以获得更好的产酶性能。
土壤中产蛋白酶芽孢杆菌的筛选一、实验目的要求1、了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术2、掌握从土壤中筛选产蛋白酶菌株的原理及方法3、学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法4、培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力二、实验基本原理土壤微生物类群在全球自然生态系统中具有不可替代的作用，它推动着生态系统的能量流动和物质循环，是生态系统的重要组成部分。
芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，多数为碱性菌，主要分布于土壤、动植物体及水体中。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
从而得到所需的菌株。
并且自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
水解圈与菌落直径的比值，被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
三、实验材料和试剂器具和其他用具：盛有9ml无菌水试管4支、培养皿10个、锥形瓶250ml、500ml各一个、无菌移液管4根、吸管、玻璃涂棒、电子天平、水浴锅、恒温培养箱、烧杯、报纸、土壤样品、高压灭菌锅、记号笔、显微镜、载玻片、盖玻片、酒精灯、接种环、尺子。
试剂：蛋白胨、牛肉膏、Nacl、琼脂、脱脂奶粉、酵母膏、葡萄糖、(NH4)2SO4、MgSO4.7H2O、K2HPO4、香柏油、二甲苯。
（注：牛奶平板、牛肉膏蛋白胨培养基、淡薄培养基）革兰氏染色：革兰氏染色、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红复染液芽孢染色：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液1、取样在家畜饲养的地方，从地表下10~15cm的土壤中用无菌小铲取土样，并记录取样的地理位置。
2 、采集取一小方土样均匀在纸上，然后再纸的四角和中心各取2g土壤样品，混匀形成10g土样。
3 、灭菌将10g土样放入100ml无菌水中并置于250ml的三角瓶中，然后放入水浴锅中加热（80℃）处理10min。
高产蛋白酶的芽孢杆菌菌株选育学校河北农业大学专业生命科学学院姓名xxx学号x指导老师x同组人员x二〇一三年十二月二十五日（河北农业大学生命科学学院，河北保定，071000）摘要：目的：通过筛选诱变选育高产蛋白酶，为食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业提供材料基础。
方法: 通过在富含蛋白质的场所的针对性采集土样，菌落平板筛选结合紫外线诱变育种，选育高产蛋白酶的芽孢杆菌，通过一系列鉴别性培养基鉴定其生理生化特性，查找其种属。
结果：通过筛选得到一诱变菌种，通过伯杰氏手册鉴定其为枯草芽孢杆菌属。
诱变90s后，其蛋白酶活性提高最大。
关键词：高产蛋白酶芽孢杆菌诱变鉴定引言：蛋白酶（Protease）是催化蛋白质水解的一类酶，微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌生产。
蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。
该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适应性宽，被广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。
目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。
蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。
由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。
常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌（如黑曲霉、根霉）；碱性蛋白酶生产菌（如地衣芽孢杆菌）；中性蛋白酶生产菌（如枯草芽孢杆菌）。
本实验以树林土壤中筛选得到的蛋白酶生产菌株为出发菌株，采用紫外线照射诱变方法育种，筛选得到高产蛋白酶菌株。
High protease of Bacillus Strain BreedingAbstract:Objective: by screening the mutation breeding of high yield protease, food, pharmaceutical, cosmetics, detergent, spinning, fur softening provides basic material industry. Methods: the protein rich places for collecting soil samples, colony plate screening combined with ultraviolet mutagenesis breeding, breeding of high yield protease of Bacillus, cultivate their physiological and biochemical characteristics based identification through a series of differential, find the species. Results: by screening a mutagenic strain, through Berger's manual was identified as Bacillus subtilis. Mutation in 90s, the protease activity increased.Keywords: high yield protease from Bacillus mutagenesis and identification目录1材料和方法 (3)1.1 试验材料 (3)1.1.1 供试材料及菌株 (3)1.1.2 供试试剂 (4)1.1.3 供试培养基、营养液的配备 (4)1.1.4 主要仪器和设备 (4)1.2方法 (4)1.2.1菌株的分离筛选 (4)1.2.2 菌株的纯化 (4)1.2.3 紫外诱变 (5)1.2.5 生理生化鉴定 (5)2结果分析 (7)2.1菌落分离筛选结果 (7)2.2诱变后菌落观察结果 (7)2.3生理生化鉴定结果 (8)3讨论 (9)1材料和方法1.1 试验材料1.1.1 供试材料及菌株地表下10~15cm的土壤（取自河北农大西校区E座旁的小树林）及筛选获得的蛋白酶产生菌株1.1.2 供试试剂吲哚试剂，40%氢氧化钾，α—萘酚，香柏油，碘液，结晶紫染液，蒸馏水等1.1.3 供试培养基、营养液的配备改良牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂粉20g，加水定容至1L,调pH至7.4 用前加入适量牛奶，硝酸盐还原试验培养基：硝酸钾0.2g ，蛋白胨5g，加入1000ml蒸馏水中溶解，调pH至7.4，硝酸盐还原试验A液：对氨基苯硫酸0.5g，冰醋酸（10%左右）150ml，硝酸盐还原试验B液：α-萘胺0.1g，蒸馏水20ml，冰醋酸（10%左右）150ml，石蕊牛奶培养基：2.5%石蕊4ml，脱脂牛奶100ml（10g奶粉溶于1000ml水中），VP试验培养基：磷酸氢二钾5g，多价胨7g，葡萄糖5g，溶于1000ml蒸馏水中，调pH至7.8葡萄糖发酵培养基：磷酸氢二铵1g，酵母膏0.2g，氯化钾0.2g，葡萄糖10g，七水和硫酸镁0.2g，溴甲酚紫0.04%20ml，溶于1000ml水中，加入琼脂5-6g，加热煮沸，淀粉培养基：1g淀粉，10ml冷水和100ml营养琼脂，加热煮沸混合，柠檬酸盐培养基：氯化钠5g，七水和硫酸镁0.2g，磷酸氢二铵1g，磷酸氢二钾1g，柠檬酸5g，溴麝香草酚蓝溶液4ml，酚红试剂适量，校正pH6.8，加入琼脂2g熔化（试管斜面），吲哚试验培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。
调pH至7.6。
以上各种培养基在121℃高压蒸汽灭菌15分钟。
1.1.4 主要仪器和设备恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌箱，超净工作台，水浴锅，磁力搅拌器，显微镜，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环（针），酒精灯，载玻片，吸水纸、显微镜等。
1.2方法1.2.1菌株的分离筛选制备平板:融化牛肉膏蛋白胨培养基，每瓶加入20ml无菌牛奶，混合后倒平板6个，贴上标签，制菌悬液:称5g土壤溶于45ml无菌水中，震荡，80℃水浴10分钟，静置后取上清1ml 加入9ml无菌水于灭菌试管中混匀，，分别配成10-1、10-2、10-3、10-4的梯度稀释液，并编号。
涂布:取10-2、10-3、10-4的稀释液1ml，均匀涂布于牛奶平板上，每种浓度倒两个板。
培养:37℃倒置培养。
1.2.2 菌株的纯化挑取具有蛋白水解圈的菌落于另一个平板上划线纯化，经斜面培养后于4℃冰箱中保存，用接种环挑取初筛得到的菌接种至5mL 液体发酵培养基中，37℃ 230r/min 条件下振荡培养，4000rpm/min 离心10分钟，弃去培养基取上清液备用。
1.2.3 紫外诱变将上述上清液6000rpm/min 离心10分钟，弃上清后用无菌生理盐水重悬，取1ml 菌液，做10倍梯度的稀释，分别为10-4、10-5、10-6的菌液0.1ml 涂布平板，剩余的菌悬液倒入一个无菌空平皿，放一根无菌大头针，置于磁力搅拌器上。
紫外预热20分钟，将平皿打开盖，分别取照射30秒、1分钟、1分30秒、和2分钟的菌悬液做10倍梯度稀释（如图1），最后取0.1ml 涂布平板，平皿置于黑暗处培养。
（紫外线诱变需注意黑暗条件下操作，避免光复活现象。
）1.2.4 高产蛋白酶菌株选育取出培养皿，观察菌落形态，记录菌落个数，记录透明圈直径（H ）、菌落直径(C)及其比值、对比诱变前，是否有明显变化，即诱变是否成功。
并绘制存活曲线。
1.2.5 生理生化鉴定1.2.5.1硝酸盐还原试验有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氨气等。
亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。
试验方法：用接种环挑取菌落接种于配好的硝酸盐培养基中，培养一周然后进行试验。
临试前将试剂的A 液和B 液各0.2ml 等量混合、取混合试剂约0.1ml ，加于试管内硝酸盐培养基中，立即或较快时间内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。
记录结果。
1.2.5.2石蕊牛奶试验组别 类别照射时间/s浓度梯度/ml一组 30 10-4 10-5 10-6 二组 60 10-3 10-4 10-5 三组 90 10-210-310-4四组 120 10-1 10-2 10-3 五组（对照）10-510-610-7表一：照射时间及梯度如下表所示牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。
石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，还原时则自上而下地褪色变白。
细菌对牛奶的作用有一下几种：（1）产酸――细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红。
（2）产碱――细菌分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。
（3）胨化――细菌产生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶变得比较澄清。
（4）酸凝固――细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变化，当酸度很高时，可使牛奶凝固。
（5）凝乳酶凝固――有些细菌能产生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此时石蕊常呈蓝色或不变色。
（6）还原――细菌生长旺盛，使培养基氧化还原电位降低，因此石蕊还原褪色。
接种与观察结果：在试管培养基中接种待测菌株，37℃培养箱中培养一周，按上述特征观察和记录牛奶产酸、产碱、凝固或胨化等反应。
1.2.5.3 VP试验有些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸,再进一步将丙酮酸脱羟变为乙酰甲基甲醇,在碱性环境中被空气中的氧氧化为二乙酰,二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基发生反应生成红色的化合物。
接种与观察结果：在试管培养基中接种待测菌株，37℃培养箱中培养一周，按上述特征观察和记录颜色变化。
1.2.5.4柠檬酸盐试验有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解柠檬酸盐钠生成碳酸钠，是培养基呈碱性。
能利用柠檬酸盐作唯一碳源的细菌也能利用铵盐作为唯一氮源，铵盐被分解为氨而产生碱性。
柠檬酸盐培养基本身呈深绿色，若该菌能利用柠檬酸盐生长，则培养基变蓝色，否则仍为绿色。
接种与观察结果：在试管培养基中接种待测菌株，37℃培养箱中培养一周，按上述特征观察和记录颜色变化。
1.2.5.5淀粉试验有些细菌能产生淀粉酶（胞外酶）使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖。
淀粉水解后遇碘不再变蓝色。
接种与观察结果：在平皿培养基中接种待测菌株，37℃培养箱中培养一周，在培养基上滴上碘液，按上述特征观察和记录颜色变化。
1.2.5.6葡萄糖发酵试验有的细菌分解某种糖会产生某种有机酸和气体，当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色变为黄色，气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
实验中，葡萄糖培养基试管中，接种大肠杆菌和变形杆菌的试管内出现气泡且培养基变为黄色，对照组无气泡，培养基仍为紫色，说明大肠杆菌能分解葡萄糖产酸产气。
