PCR引物设计的11条黄金法则

PCR实用大 全，PCR引物设计的11条黄金法则一、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索 不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。二、引物长度一般在 15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致 ...

PCR引物设计的11条黄金法则 一、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基相同的序列就是该基的保守区。

二、引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大38，为过长会导致其延伸温度大74℃，不适Taq DNA 聚合酶进行反应。

三、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过或过低都不利引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

四、引物3′端避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不终止密码子的第3位，密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

五、引物3′端不能选择A，最好选择T. 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情下，也能有引发链的合，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介A、T之间，所以3′端最好选择T.

六、碱基随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较，尤其是3’端相似性较的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

七、引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚（Dimer与Cross dimer）的形。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不过（应小4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

八、引物5′ 端和中间△G值应该相对较，而3′ 端△G值较低。 △G值是指DNA 双链形所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过，容易在错配位点形双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）

九、引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；记生物素、荧光、地辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形任何二级结构可能。

十、扩增产物的单链不能形二级结构。 某些引物无效的原是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小58.6l kJ/mol时，扩增往往不能。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的是有帮助的。

十一、引物应具有特异性。 引物设计完以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏或偏低，导致找不到各种指都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情只能退而求其次，尽量去满足条件。

几种常用特殊PCR技 几种常用特殊pcr技 一、逆转录PCR（Reverse transcription－PCR,RT-PCR） RNA经逆转录后可作为PCR的模板。逆转录PCR（RT－PCR）常用基表达研（定量pcr）和逆病毒检测。

设计RT－PCR引物时，应使引物分别位不同的外显子中，以便区别cDNA和gDNA扩增产物。

二、多重PCR（Multiple PCR） 在同一PCR反应系中用多对引物（覆盖不同长度的靶序列）同时扩增。 例如用多重PCR进行DNA缺失筛选 三、套式PCR（nested PCR） 用第一次PCR扩增区域内部的第二对（套式）引物对第一次PCR产物再次扩增，可以增加特异性和灵敏度。

四、非对称PCR（asymmetric PCR） 在PCR反应系中，限引物之一的浓度（50－100:1）进行扩增，可得到单链PCR产物，可用备单链测序模板或单链DNA杂交探针。

PCR产物电泳结果分析 一、PCR产物电泳产物检测时间 一般为48h以内，有些最好当日电泳检测，大48h后带型不规则甚致消失。 二、假阴性，不出扩增条带 PCR反应的环有①模板核酸的备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原亦应针对上述环进行分析研。 1、模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色中的组蛋白，④在提取备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出扩增带，极有可能是本的消化处 理，模板核酸提取过出了毛病，而配有效而稳定的消化处理液，其序亦应 固定不宜随意更改。

2、酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

3、引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原。有些批号的引物合质量有问，两条引物一条浓度 ，一条浓度低，造低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合单 位。②引物的浓度不仅看OD值，更注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定有 引物条带出，而且两引物带的亮度应大一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合单位协商解决。如一条引物亮度，一条 亮度低，在稀释引物时衡其浓度。③引物应浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形二聚等。

4、Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

5、反应积的改变：通常进行PCR扩增采用的积为20ul、30ul、50ul.或100ul，应用多 大积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小积如20ul 后，再做大积时，一定模索条件，否则容易失败。

6、物理原：变性对PCR扩增来说相当重，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必用准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原之一。

7、靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会的。

三、假阳性 出的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更。 1、引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出假阳 性。需重新设计引物。 2、靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原：一是整个基组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐温的物质外，所有试剂或 器材均应压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必时，在加本 前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

四、出非特异性扩增带 PCR扩增后出的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出，其原：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形二聚。二是Mg2+离子浓度过、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出非特异条带而另一来源的酶 则不出，酶量过多有时也会出非特异性扩增。其对策有：①必时重新设计引 物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。④适当提退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

五、出片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出涂抹带或片状带或地毯样带。其原往往由酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过，Mg2+浓度过，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓 度。④增加模板量，减少循环次数。

PCR经验总结 （先声明，此文不如分子克隆第三版权威与分子克隆相背处，请信分子克隆) 一、增加PCR的特异性 1、primers design 这是最重的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物符合下面的一些条件

1）足够长，18-24bp,以保证特异性。当然不是说越长越好，太长的引物同样会降低特异性，并且降低产量