内皮祖细胞与造血细胞体外培养及临床应用研究

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2型糖尿病患者内皮祖细胞数量和功能研究

ＥＣｐｉｅｉｍａｅｃｎｒｕｅｔｔｅｉｕｙｏｓｕａｄｔｅｉｍｏａｅｔｗｔｐｉｂｔｓＰｓｎｔｅｄａｔｙｂｏｔｂｔＯｊｒｖｃｌｅｏｌｆｔｎｓｉｔｅｄａｅ．ｉｙ２ｂｃｉｎｈｆａｒｎｈｕｐｉｈｙ２ｅＫＹＷＯＤＳＴｐｉｅｅ；ｎｏｈｌｒｇｎｔｅｓＶｓｕａｊｒＥＲ：ｙｅｄａｔｓＥｄｔｅａｐｏｅｉｒｌ；ａｃｌｉｕｙ２ｂｉｌｏｃｌｒｎ
ｇｎｔｅｓ（ＰｓｎｔｐｉｅｃｐｔｎｓｅｉｒｌＥＣ）ｉｅ２ｄａｔａｉｔｏｃｌｙｂｉｅ．Ｍｅｏｓ０ｈａｔｙｓｂｅｔａｄ０ｐｔｎｓｉｐｉｔｄｅｈｕｊｃｓｎａｅｔｗｔｔｅ２ｄａｈ３ｌ３ｉｈｙ —
２型糖尿病（ｐｉｅｅ）危害人类生命ｙ２ｂｔｅｄａｔｓ是
复能力的方法。本研究通过对２型糖尿病患者外周血内皮祖细胞的数量和功能活性的研究，讨探内皮祖细胞的数量和功能与糖尿病发病以及相关的血管并发症之间的关系。
ｂｏｄｍｏｏｕｌｒｃｌＰＭＣ）ｗｓｃｕｔｄＡｔ－ａｕｔｅｏＢｓｔｅｐｏｆａｏｎｉａｏｌｎｎｃｅｅｌＢｓａｏｎｅ．ｆｒｄｙｃｌｒｆＭＣ，ｒｉｒｔｎａｄｍｇｔｎｏａｓ（ｅ７ｕＰｈｌｅｉｒｉ
ｄａｅｉａｉｎｓｗｅｅｓｇｉｃｎｙｄｃｅｓｄＣｏｃｕｉｎＴｅｉａｒｄｎｍｂｒａｄｆｎｔｎｃｉｉｅｆｉｔｐｔｔｂｃｅｒｉｎｆａｔｅｒａｅ．ｎｌｓｏｈｍｐｉｕｅｎｕｃｏａａｔｔｓｏｉｌｅｉｌｖｉ

血管内皮祖细胞与炎性因子相关性的研究进展

ห้องสมุดไป่ตู้
预处理的ＥＰＣｓ数量和功能的影响。研究表明，在
万方数据
生理叠堂进星２Ｑ鲤生箜塑鲞筮≥魍
是一种血管生成因子，目前发现的Ａｎｇ家族共有４
改善ＥＰＣｓ的功能。Ｙａｍａｇｕｃｈｉ等旧１对无胸腺、后肢缺血的裸鼠局部注射ＳＤＦ．１，同时给以ＥＰＣｓ移植术。结果表明，给以ＳＤＦ．１后局部ＥＰＣｓ数量增加，缺血组织毛细血管的密度也明显增加。此研究提示，ＳＤＦ—ｌ可能通过增强ＥＰＣｓ的迁移来提高缺血组织新生血管的形成能力，同时也削弱了ＥＰＣｓ的调亡。刘锐等ｐ１研究了细胞因子对淋巴管内皮祖细胞（１ｙｍｐｈａｔｉｃ
ｅｎｄｏ出ｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ
来源于骨髓，是血管内皮细胞的前体细胞，在一定因素刺激下（如组织缺血释放的生长因子或细胞因子）能够动员到外周循环，分化为成熟内皮细胞并参与血管修复或血管形成。一些能够改善内皮细胞功能并提高ＮＯ活性的因素如他汀类药物、促红细胞生成素等具有促进ＥＰＣｓ动员的作用。相反，有些心血管危险因素能降低循环ＥＰＣｓ的数量或减弱其功能，例如：血管紧张素Ⅱ、高血糖、高胆固醇、氧化修饰型低密度脂蛋白、炎症因子Ｃ一反应蛋白（Ｃ—
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ
降低外周血中ＥＰＣｓ的分化、存活和促血管生成功
能，其机制是通过降低ＥＰＣｓ中内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）ｍＲＮＡ的表达，所以ＥＰＣｓ诱导的血管发生依赖于ＮＯ的合成与释放。Ｓｕｈ等又发现ｐＪ，用一定浓度的人重组ＣＲＰ与ＥＰＣｓ共同孵育，可明显降低ＥＰＣｓ和内皮细胞层的黏附，抑制ＶＥＧＦ诱导的ＥＰＣｓ的迁移，这与ＣＲＰ降低ｅＮＯＳ的表达，从而降低ＮＯ的合成与释放有关。另外有研究者认为，Ａｓ等心血管疾病的典型病理生理特征是高水平的活性氧自由基（ｒｅａｃｔｉｖｅ

大鼠心脏血内皮祖细胞的分离培养、鉴定与分化

ａｄｅｉｅｉｌｙｈｒｘ２０，（）５ｎｐｄｍｏｏ．ｏａ，０２５５：２ｇＴ７４
３０ ’ ｉｎＪＪ．ｉＮＡ．ｅｅｇＫ，ｔａ．ｅｓｓＡｍＭｅ２０１０ＢｒｅＭｒＡｌＡｂｒｇＳｅＳｐｉ．１Ｊｄ，０７，２
５Ｕｌｖｔ，ｂａ．Ｒｅｏｎｔｎｏｒｍ— ｅａｉｅｂａｔｒａａｄｅ — ｅｉＲＪＴｏｉｓＰＳｈｃｇｉｉｆｇａｎｇｔｖｃｅｎｏｉｎ
ｄｔｘｎｂｈｎａｅｉｏｏｉｙｔｅｉｎｔｍｍｕｅｓｓｅＣｕｒＯｐｎＩｎｙｔｍ．ｒｉｍｍｕｏ，９９ｌ：９ｎｌ１９，１１
２Ａｔｂｉｋ，ｔａＡ．ｅｐｌｎｒｐｓｃｎｉｒｔｅａｅ５ＡｃｔａａＭａｔｙＭＴｈｕｍｏａｙｈｉｉｎｃｉｉｌｃｒ．：ｕｅｈ
ｌｎｎｕｙａｄｈｃｔｒｓｉｔｒｄｓｒｓｓｎｒｍｅ：ｆｉｏｓｕｇｉｒｎｔｅａｕｅｅｐｒｏｉｅｓｙｄｏｄｉｔｎｊａｙｔｅｎｉ
４参考文献
１Ｖｎ — ＨｅｅＰ，ｕｐｒＷＣ，ｔｅｖｏｄｎＤｅ１ｎｒｔｃｅｌａｌｎＨＫｉｅｓｄｊＳｅｎｏｒｅ，ａ．ｔｒｈａｔＩａａ
ａｒｓｌａｏｆｅｄｔｘｎＬＰ）ｎｔｅｒｔａｃｍｐｅｅｓｅａｉｌｅｏｏｉｔｎｏｎｏｏｉ（Ｓｉ：ｏｒｈｎｉｎｍａｚｉｈａｖ
江西医药２００８年第４３卷第１Ｏ期
Ｉ一、Ｌ１Ｌ６Ｉ一０的浓度显著升高，明内毒素入血后刺表激机体产生多种炎性介质．这些介质通过直接或间接的相互作用．产生炎症级联反应．引起ＡｌＬ或

内皮祖细胞在脑血管疾病的研究进展

Ｈｓ等把ＧＰｅｓＦ标签的雄性老鼠的骨髓移植到同系里面脑动脉闭
锁引起的脑梗死雌性小鼠上，从而跟踪绿色荧光以及Ｙ染色体，我们
看见被标的骨髓细胞整合 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ入缺血部位，并呈现内皮细胞表型。这说明内皮祖细胞有可能被用来加快中风后的恢复过程。事实￣Ｚａｇ【ｈｎ等７
内皮细胞增殖、游走新生。近年来，血管ＥＣ末梢血中的发现，对Ｐ在
血管新生的概念有了新的认识。根据有关研究，当一个比较成熟的单个载体里面骨髓进来的一部分干细胞可参与外履血循环的里面，
癌性。
参考文献
［］ＳｇｌＭＳＳａＡｆａＡ，１￣ｃｏｉｅｃｔｓｅｅａｉｄｃｄ１ｅａ，ｈｈＲ，ｚｌｅａ．ｉｘｄｙｏｋｌｔ１ｕｅｔＮｉｎ
ＥＣ的进一步修复可以修复血管、减轻狭窄，就像面对缺血性疾病的Ｐｓ
治疗一模一样。
５问题与展望
要Ｃ。但要准确定义ＥＣＤＰ的特征目前仍很困难，ＥＣＰ实际是不同分
化阶段祖细胞的集居，因而表面标记有所不同。２ＥＣＰ与血管新生血管新生包括两类： ①在胚胎形成初期新生；是从原有的血管
ａｓｃａｄｉｉｅｓ］ａｅｓ０６５（）０ —０．ｓｉｅｔｄａｔ［．ｂｔ，０，５１１２１９ｏｔｗｈｂｅＪＤｉｅ２：
【］Ａｓｈｒ，ｒｈｒ，ｉｏ，ｔ１ｓｌｏｆｕａｉｅｐｏｎｔｒ２ａａａＴＭｕｏａａＴＡｌｎＳｅ．ｏ￣ｉｎｏｔｔｒｇｉｓａＩｐｖｏｅｄｔｅｉｌｒｇｎｔｒｎｏｈｌｌｅｌｏｇｏｅｅｉ［］ｃｅｃ，ｎｏｈｌｏｅｉｄｔｅｉｌｆａｉｇｎｓＪ．ｉｎｅａｐｏｅａｃｓｎｓＳ

巴曲酶对体外培养下内皮祖细胞数量及功能的影响

“ＩＦＴｃ标记的荆豆凝集素” “ ｉ标记的乙酰化低密度脂蛋白” 染色阳性细胞为正在分化的ＥＣ，式细胞仪和ＤＩ双Ｐｓ流检测其表面标记并进一步鉴定ＥＣ。ＭＴ比色法、良的ＢｙｅＰｓＴ改ｏｄｎ小室及黏附能力测定ＥＣ的增殖、移和黏Ｐｓ迁
维普资讯
・２６・Ｏ
中华老年心脑血管病杂志２００８年３月第ｌ０卷第３期
Ｃｉ－ｉｒＨｅｒＢａｅｓｌｉ，ｒ０８ｖ１，．ｈｎＪＣｒｔａｔｒｉｓｅＤｓＭａ０，（０Ｎｏ３ｅａｎＶ２
ｃｌｕｅｎｄｔｌａｏｅｔｒｃｌｓｕｔｒｄｅｏｈｅｉｌｐｒｇｎｉｏｅｌ
ＳＵＮａ — ｅＨＵ —ｉ，Ｘｉｏｊ，ｉＨｅｊｅＤＥＮＧ —ｈｎｅｌＦｕｓｅｇ，ｔａ
ＤｅｒｍｅｔｆＶｓｕａｒｅｙ，ｈｔｔｉｔｄＰｒｖｎｉｌＨｏｐｔｌｏｐａｔｎａｃｌｒＳｕｇｒｔｅＡｔｌｅｏｉｃａｓｉａｆｏａＡｎｕｄｃｌＵｎｖｒｉＨｅｅ３０１ＣｉａｈｉＭｅｉａｉｅｓｔｙ，ｆｉ００，ｈｎ）２
ＡｂｔａｔＯｂｅｔｅＴｏｉｖｓｉａｅｗｈｔｅａｒｘｂｎＤＦ～１ｕｍｅｔｈｕｅｆｅｄ — ｓｒｃ：ｊｃｉｖｎｅｔｔｅｈｒｂｔｏｏｉ（ｇ５）ａｇｎｓｔｅｎｍｂｒｏｎｏ２

大鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离培养及鉴定

细胞，然后用添加有多种细胞因子的内皮细胞基础培养基（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ，ＥＢＭ一２）诱导培养获取ＥＰＣｓ。
通过形态学观察、ＣＤ１３３和ＶＥＧＦＲ一２抗体免疫荧光染色并结合ＦＩＴＣ－ＵＥＡ－１和Ｄｉｌ — ａｃ — ＬＤＬ的摄取功能来对ＥＰＣｓ进行鉴定分析，同时通过体外管样结构形成能力对ＥＰＣｓ进行功能性评价。结果在ＥＢＭ一２培养基中诱导
12实验方法121epcs的分离培养选用约150g的雄性清洁级sd大鼠采用颈椎脱臼法处死浸泡在70的酒精中消毒510min然后将股骨胫骨迅速从大鼠中剥离下来置于已消毒并盛有含双抗的磷酸缓冲液pbs平皿中将股骨胫骨上残留的肌肉剔除干净用手术剪分别剪去股骨胫骨的两端打开骨髓腔用5ml注射器吸取4ml含10胎牛血清fbs的dmem培养基从骨髓腔的一端将骨髓冲出到培养皿中用吸管将平皿中的细胞悬液轻轻吹打混匀然后将悬液贴壁轻轻加入到预置等体积percoll大鼠淋巴细胞分离液1083gml的离心管中悬于上层2500rmin离心30min用吸管小心地将中间云雾状白膜层的单个核细胞吸取到另一离心管中用dmem培养基洗涤两次1000rmin5min弃上清液用含10fbs和多种细胞因子的ebm2培养基重悬细胞以1105个cm2接种于培养板中1d后将未贴壁细胞悬液接种到fn预先包被好的6孔细胞培养板中置于饱和湿度375co2恒温培养箱
培养７ｄ后，出现类似于血岛样的细胞集落，集落中央的细胞呈圆形，周边的细胞呈放射状；８０以上的细胞都是ＣＤ１３３／ＶＥＧＦＲ一２细胞，并且这些细胞同时能够摄取Ｄｉｌ — ａｃ — ＬＤＬ和结合ＦＩＴＣ－ＵＥＡ－１；ＥＰＣｓ在基质胶表面形成管腔样结构。结论密度梯度离心法结合差时贴壁法从骨髓中分离获得的单个核细胞，然后经ＥＢＭ一２条件培养

人脐血CD133 +血管内皮祖细胞的培养、鉴定与分化研究

可分化为梭形血管内皮细胞及形成集落；ＣＤ１３３细胞培养过程中Ｄｉｌ－ＬＤＬ及ＦＴＣＩ－Ｌｅｃｔｉｎ摄取阳性，双染阳性率为（９５．８３± １．７２）％；ＣＤ１３３细胞培养１周后经免疫组织化学检测ＣＤ３４、 Ⅷ因子阳性率分别为（９５．８３± ２．２３）％和（９５．９２±１．４３）％，与人脐静脉内皮细胞比较差异无统计学意义；ＣＤ１３３细胞体外培养４ｄ、１周可形成小血管结构。结论免疫磁珠分选法可获取较高纯度ＣＤ１３３血管内皮祖细胞，在生长因子作用下诱导其分化为成熟血管内皮细胞。
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２００７年５月第４５卷第９期
ＣｈｉｎＪＳｕｒＫ．Ｍａｙ２００７，Ｖｏ１．４５，Ｎｏ．９
・
６１９・
．
论著
人脐血ＣＤ１３３＋血管内皮祖细胞的培养、鉴定与分化研究
【关键词】血管内皮；干细胞；细胞培养
Ｓｔｕｄｙｏｎｃｕｌｔｕｒｅ．ｉｄｅｎｔｉｉｃｆａｔｉｏｎａｎｄ谶￣ｎｉａｔｉｔｏｎｏｆＣＤ１３３ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓｆｒｏｍ
验、细胞免疫组织化学等进行鉴定。结果经流式细胞仪检测ＣＤ１３３细胞平均占单核细胞的

缺血性视网膜病变的内皮祖细胞移植治疗及抗炎型小胶质细胞神经修复研究

缺血性视网膜病变的内皮祖细胞移植治疗及抗炎型小胶质细胞神经修复研究缺血性视网膜病变中,由于视网膜缺血缺氧,既可诱发视网膜新生血管的形成,又可导致谷氨酸大量释放,促使神经元细胞死亡。

在缺血性疾病中,“神经血管单元”的概念强调神经细胞、内皮细胞和神经胶质细胞在疾病的神经与血管修复过程中均起到至关重要的作用。

内皮祖细胞(EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞,具有高度增殖的潜力及血管内皮的特性,能够聚集到不同的缺血组织中促进血管内皮的修复,具有保护血管内皮功能的重要作用。

小胶质细胞在不同的条件下呈现不同的活化状态,经不同刺激因素活化后可表现为促炎型M1和抗炎型M2。

缺血性视网膜病变中神经细胞的凋亡增多,小胶质细胞通过在低氧条件下使神经细胞表达和释放细胞因子参与视网膜神经细胞死亡调控。

基于此,本研究将EPCs注射到氧诱导视网膜病变小鼠模型的玻璃体腔内,观察其对视网膜血管的作用,并体外培养小鼠视网膜神经元并使用海人藻酸(KA)(谷氨酸结构类似物)诱导建立兴奋毒性神经元损伤的体外模型,与不同激活状态的小胶质细胞共培养,观察小胶质细胞对损伤后的神经元的作用,为缺血性视网膜病变的细胞治疗及免疫治疗提供新的思路。

目的:探讨缺血性视网膜病变中玻璃体腔移植的EPCs对小鼠氧诱导视网膜病变(OIR)视网膜血管损伤的治疗作用及激活的不同亚型小胶质细胞对KA介导的视网膜神经元兴奋毒性损伤的免疫调控机制。

方法:(1)用60%Percoll分离液密度梯度离心的方法分离人脐带血中EPCs,用5μmol/L羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记EPCs。

应用混合气体(75%氧气:25%氮气)制作C57BL/6J小鼠OIR模型。

实验分组:正常对照组(NC组)24眼、高氧组(OIR组)48眼、EPCs组30眼和磷酸盐缓冲液组(PBS组)18眼,其中EPCs组和PBS组分别与OIR小鼠玻璃体腔内注射CFSE标记EPCs或PBS。

分时段处死各组小鼠,行视网膜石蜡切片、冰冻切片、视网膜铺片ADP酶染色、伊文思蓝心腔灌注视网膜铺片等检查,比较EPCs移植前后视网膜新生血管消退情况及示踪EPCs。

高脂大鼠内皮祖细胞生物学特性的实验研究

ａｎｎｃａｉｉｅｗｅｅｄｔｃｅｄｉｕｂｔｏｎｔｍｒｅｅｔｄ．ＲｅｕｔＴｈｅｍｏｐｓｌｓｒｈｏｌｇｙｏｏｆＥＰＣａｆｅｅｔｅｎｈｅｌｐｍｉａｓａｗｓｄｉｆｒｎｔｂｅｗｅｙｐｒｉｅａｒｔｎｄｎｏｒａｍｌｏｎｅ．ＣｏｍｐａｉｇｗｉｈｎｍａｌｒｔｓｒｎｔｏｒａｓＥＰＣｓｉｎｈｙｐｒｉｅｉａｓｗｅｅｓａｌｒｅｌｐｍａｒｔｒｍｌｅ，ａｎｈｅｐｉｉｅｒｔｄｔｏｓｔｖａｅｏｆＣＤ３４ｗａｏｗｅｗｈｉＣＤ４ａｄｓｌｒｌｅ５ｎＣＤ１３ｗｅｅｇｈｅａｔｓｍｅｎｃａｉｎｉｅＴｈｃｐａｉｙ３ｒｈｉｒｔｈｅａｉｕｂｔｏｔｍ．ｅａｃｔｏｆｒｉｅａｉｎ，ｐｏｌｆｒｔｏｄｉｆｒｎｔａｉｎｎｄｐｈａｏｃｔｉｆｅｅｉｔｏａｇｙｏｓｓｏｆＥＰＣｓｉｐｅｌｐｅｉａｏｏ．ＢｒｎｈｙｒｉｍａｗｓｐｒｄＵｓｔｖａｅｗａｓｕｐｔｇｈｌｖｅｆｅｐｏｉｉｅｒｔｏｈｉｅｌａｔｒ
ＥｘｐｒｍｅｔｌｓｕｎｂｏｏｃｌｆａｕｒｓｏｎｄｔｌａｏｎｉｏｒｃｌｓｉｐｒｉｅｉａｓｅｉｎａｔｄｙｏｉｌｇｉａｅｔｅｆｅｏｈｅｉｌｐｒｇｅｔｅｌｎｈｙｅｌｐｍａｒｔＫＯＮＧＺｈａ — ｎｇ，ｏｈｏ
摘要：目的研究高脂大鼠内皮祖细胞（Ｐ）生物学特性，探讨其在体外最佳５溴脱氧尿嘧啶核苷ＥＣ的并一制备高脂模型大鼠，外分离培养ＥＣ，察健康对照组和高脂组大鼠ＥＣ生长及体Ｐ观Ｐ

芪红合剂含药血清对体外培养人外周血内皮祖细胞NO及NOS的影响

ｔｅｌｓｒｓａｎｎｏｆｃｌｍｉｒｓｏｅａｄｔｅｆｗｃｔｍｅｒ．ｅｃｌｒｄＥＰｒｎｕａｅｔｉｆｒｎｏｃｎｒｔｎｏ — ｈａｅｃｎｉｇｃｎｏａｃｏｃｐｎｈｌｙｏｔｙＴｈｕｌｅＣｓｗｅｅｉｃｂｔｄｗｉｄｆｅｅｔｎｅｔａｉｆＱｉｏｕｈｃｏ
ｎｌａｅｌｅｅｉｏｌｔｄｆｏｕｃｅｒｃｌｓｗｒｓａｅｒｍｈｕｍａｒｐｈｅａｂｏｏｎｄｃｉｕｅｉｈＭｅｕｍ９，ｈａｅｅｉｎｉｉｄｔｂｎｐｅｉｒｌｌｄａｕｔｒｄｗｔｄｉ１９ｔｔｗｒｄｅｔｆｅｏｅＥＰＣｓｏｎｄｙ７ｙａｂ
ＮｉｒｃＯｘｄｅＳｙｔｓｏｔｉｉｎｈａｅｏｆＢｌｏｄ— ｄｒｖｄＥｎｄｔｌａｏｅｔｒＣｅｌｅｉｅｏｈｅｉｌＰｒｇｎｉｏｌｓ
Байду номын сангаас
ＧｏｇＪａｆｎ，ａＳｅｉｇｅｌ／ＴｈｅｏｄＨｏｐｔｌＳａｘｄｃｌｉｅｓｔＴａｙａ３０）ｎｉｎａｇＭａＨｕ，ｈｎＪｎ，ｔ／ａｅＳｃｎｓｉ，ｈｎｉａＭｅｉａｖｒｉＵｎｙ（ｉｕｎ０００１ＡｂｔａｔＯｂｅｔｅＴｏｉｖｓｉａｅｔｅｅｆｃｓｏｈｎｅｏｔｎ—ｃｎａｎｎｅｕｏｉｒｃｏｉｅＮＯ）ａｄｎｔｉｏｉｅｓｎｓｒｃ：ｊｃｉｖｎｅｔｔｈｆｅｔｆＱｉｏｇｄｃｃｉｇｏｏｔｉｉｇｓｒｍｎｎｔｉｘｄ（ｎｉｒｃｘｄｙ —

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BM SCs 是存在于骨髓基质内的非造血细胞来源的细胞亚群, 可以在体外扩增培养, 在体外经诱导后可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、肌管、神经细胞及基质。
BM SCs表面标记: BM SCs 不具有造血细胞(CD34, CD45, CD14) 和内皮细胞(CD34, CD31, VW F) 的标记。,BM SCs 表达SH22、 SH23、SH24、CD29、CD44、CD49、CD54、CD71、 CD90、CD106、CD166 等表面抗原; IL 21A、6、7、8、 11、12、14、15、GM 2CSF、G2CSF 等细胞因子; IL 21R、IL 23R、IL 24R、IL 26R、IL 27R、G2CSFR、 EGFR、TGFBIR、TGFBIIR 等细胞因子受体; co llagen I、 III、IV、V、V I,fibronectin、laminin、vimentin、GFAP 等细胞外基质。
T. Asahara et al., Science 275, 964 -966 (1997)
acetylated-low density lipoprotein (Ac-LDL)
Published by AAAS
T. Asahara et al., Science 275, 964 -966 (1997)
但单纯的CD34+细胞体外培养不能持久保持干细胞功能促使对造血干细胞标记的进一步研究 KDR, AC133可能是更早的造血干细胞标记
造血干细胞于内皮祖细胞(EPC)的关系： EPC 表达 CD34,CD133 和 VEGFR2(KDR)等抗原，其中CD34和CD133 2(KDR) CD34 CD133 的表达与HSC相同，提示它与造血干细胞有共同的起源。
应用绿荧光蛋白转染技术进行单个内皮细胞增殖功能研究
将内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells ，HUVECs and human aortic endothelial cells HAECs）分离后进行单个细胞培养结果发现：部分内皮细胞具有HPP-ECFCs (high-proliferative potential–endothelial colony-forming cells)；部分内皮细胞具有 LPP-ECFCs( Low-proliferative potential–endothelial colony-forming cells) 能力；部分内皮细胞（ECs）不具有增殖分化能力
内皮祖细胞（内皮祖细胞（EPC）的体外培养与鉴定方法）
血管新生的三种方式
vasculogenesis: 由内皮祖细胞（EPC）增殖分化形成新生血管丛。胚胎期血管系统就是由 EPC分化增殖而形成,成人体内也存在这种方式 angiogenesis: 由原先存在于血管内皮中的具有有限增殖分化能力的内皮细胞通过分裂、增殖方式形成毛细血管丛 arteriogenesis： arteriogenesis：缺血组织周围的微小血管也可能在缺血组织的刺激和释放FGF、VEGF、PDGF 等细胞因子的作用下发生重塑，形成有足够管腔直径的血管，以达到对缺血组织恢复供血的目的
液体培养后有核细胞扩增倍数
造血干细胞体内植入试验
鉴定体外扩增的造血干细胞是否具有体内植入并重建造血功能步骤：1.照射治疗NOD/SCID鼠 2.将体外扩增的造血细胞经尾动脉注入 3.层流间环境下饲养8周,后采集鼠骨髓和外周血中的血液细胞应用流式细胞以鉴定是否为人源血细胞，且是否已经植入并建立造血功能
Development of a novel clonogenic assay to quantitate the proliferative potential of single EPCs
Ingram DA, Mead LE, Tanaka H, et al. blood. Blood. 2004;104:2752-2760.
加入分选的细胞
骨髓细胞集落培养技术
CFU-GEMM
Primary BFU-E CFU-GM
Mature BFU-E CFU-M
CFU-E
长期液体培养（long term culture initiating cells,LTC-ICs）:将骨髓基质细胞培养在平皿内，形成贴壁细胞层，然后予15GY照射，形成培养体系。将收获的细胞加入培养体系，长期培养，每周半量换液。验证扩增的细胞是否具有长期增殖分化能力
骨髓中的EPC被动员进入外周血循环中并到达血管损伤部被动员进入外周血循环中并到达血管损伤部骨髓中的位进行修复和血管再生
endothelial cell colony-forming unit （ CFU-EC）培养方法
直接将外周血单个核细胞体外培养可形成细胞集落，典型的集落形态为中心为小圆形细胞，周围细胞呈梭形，放射状分布，可摄取 Ac-LDL、结合plant lectin、表达vW因子、 KDR、CD144。但许多细胞同时表达CD45、 CD11b、CD14、CD68 外周血单个核细胞群中具有增植分化成为有内皮细胞标记的细胞包括：造血干细胞（CD34+）；单核/巨噬细胞,等等
骨髓CD34+细胞中细胞中骨髓含有造血干细胞和内皮祖细胞（内皮祖细胞（EPC)
流式细胞仪检测脐带血、测脐带血、胎肝和动员后外周血中CD34+ 周血中细胞群中的
CD34+/VEGFR-2+
亚群含量
成人CD34+细胞分化为内皮细胞研究细胞分化为内皮细胞研究成人
用免疫磁珠分选方法从人外周血中分离出CD34+细胞，应用荧光染料Dil标记，接种到包被collagen type I, 或 fibronectin的培养皿中
内皮祖细胞与造血细胞体外培养及临床应用研究
首都医科大学宣武医院血液科苏力
干细胞的定义：具有高度自我复制能力，同时具有高度增殖能力和分化形成成熟组织细胞能力的一群细胞。
胚胎干细胞
内胚层肺、肠道、肝、尿道肠道、甲状腺、甲状腺、胸腺
中胚层
外胚层
骨髓、肌肉、接缔组织皮肤、神经皮肤、骨髓、肌肉、组织、血管系统与血液组织、垂体腺
2 免疫磁珠分选方法：可针对细胞表面抗原表达进行分选 CD34,CD133,CD,CD3 ,CD56……
3 流式细胞仪分选技术目前分选纯度最高的分选技术，可针对多达4个细胞表面抗体进行分选
造血细胞体外培养扩增技术
短期液体培养： 24孔获96孔塑料培养板，加入培养液，加入细胞因子：SCF ,FLT-3, EPO, TPO, IL-3,IL-6,IL-10,GMCSF…… 分选的细胞加入培养体系中，置37ºC,5%CO2,95% 湿度培养箱中培养，每周半量换液，换出的细胞进行细胞计数，及集落培养以观察细胞数量扩增，和扩增出的细胞类型
应用绿荧光蛋白转染技术进行单个内皮细胞增殖功能研究
外周血中多种细胞可能分化成为内皮细胞
巨噬细胞在血管新生中的作用
多种干/祖细胞都能够分化成为具有内皮细胞标记的细胞
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, BM SCs ) 是骨髓中另一类干细胞, 是由骨髓中分离的有黏附贴壁能力的非造血细胞, 可分化成多种成熟的间质细胞, 因其呈成纤维细胞样生长, 既往被称为成纤维细胞集落形成单位 ( clony forming units fibroblasts, CFU -F )、骨髓基质成纤维细胞( bone marrow stromal fibroblasts) , 1991 年Cap lan 等将其命名为骨髓间充质干细胞
目前人骨髓MSC分离方法,均基于BM SCs 的贴壁特性去除其它细胞, BM SCs增殖为由纺锤形细胞组成的致密贴壁层。连续传代本身就是细胞纯化的过程,由于BM SCs的增殖优势,血细胞和内皮细胞随着传代培养而被剔除,同时 BM SCs进入指数扩增阶段,因此,体外培养的所谓BM SCs只是一个形态和表型相对均一、分化潜能和所处发育阶段迥乎差异的细胞群体。
集落培养（CFC-Assays） 24孔塑料培养板中加入甲基纤维素半固体培养基
加入细胞因子
hSCF, hGM-CSF, hIL-3, hIL-6, hG-CSF
IL-3, hIL-6, hG-CSF,EPO,TPO CFU-E, BFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM
CFU-F中的不同细胞具有不同的增殖能力
将外周血单个核细胞培养，去除非贴壁细胞，结果部分细胞可持续扩增1周，扩增20倍，另一部分细胞可持续扩增2个月，扩增达1000倍。扩增的细胞表达内皮细胞标记，不表达CD45、 CD14。上述具有有限增生能力的细胞被认为是脱落的内皮细胞（CEC）; 而具有高度增植潜能的细胞被命名为 endothelial outgrowth cell, EOCs
原始淋巴细胞 CD34+- TdT+
早幼早幼幼稚幼稚红细胞粒细胞单核细胞巨核细胞 CD33+ CD13+ CD14+ CD41+
幼稚TdT- CD4+ 幼稚淋巴细胞CD8+ 淋巴细胞 CD19+CD20+
中幼中幼红细胞粒细胞晚幼晚幼红细胞粒细胞巨核细胞
红细胞粒细胞单核细胞血小板
造血干细胞移植是目前最成熟的干细胞移植技术。造血干细胞研究也已十分深入，并与进间充质干细胞和内皮祖细胞的研究密切相关，促进了它们的临床应用
造血干细胞 CD34+ 髓系造血祖细胞 CD33+ CD34+
造血干细胞
淋系造血祖细胞CD34+ TdT+ 淋系造血祖细胞