引物设计
1. 引物最好在模板cDNA 的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman ）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2. 引物长度一般在15~30 碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp ，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm 值最好接近72℃。
GC含量（composition ）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大（约1度）。有效启动温度，一般高于Tm 值5~10℃。Tm 值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4. 引物3′ 端要避开密码子的第3 位。
如扩增编码区域，引物3′ 端不要终止于密码子的第3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5. 引物3′ 端不能选择A，最好选择T。
引物3′ 端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为 A 时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T 之间，所以3′ 端最好选择T。
6. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’ 端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′ 端不应超过3 个连续的G 或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4 个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G 值不要过高（应小于4.5kcal/mol ）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
8. 引物5′端和中间△G 值应该相对较高，而3′端△G 值较低。
△G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G 值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G 值相对较高，而3′端△G 值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易
在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G 值可以用Oligo 6软件进行分析）
9. 引物的5′ 端可以修饰，而3′ 端不可修饰。
引物的5′ 端决定着PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。
10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。
11. 引物应具有特异性。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR ，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
引物设计要求简洁版
1) 避免重复碱基，尤其是G.
2) Tm=58-60度，一般为72度。
3) GC=30-80%，一般是45%-55%。
4) 3' 端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
5) 正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
6) PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp 之间都可；80～150 bp 最为合适（可以延长至300 bp ）。
7) 引物的退火温度要高，一般要在60度以上，一般为72度。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在，而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组污染的影响。
如果要扩全长，可直接抄写引物，长度大概为20个碱基。5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
引物设计的原理与方法 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
PCR引物设计的原理及方法 阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都 610014) 摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。 关键词：PCR 引物原理方法 NCBI PrimerPremier5.0 PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site. Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的 一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列
经常有战友对一些常见问题在丁香园反复问答了很多遍，所以希望园子中一些战友，特别是低分与0分战友，能将好的帖子归纳总结了一下，并结合自己的经验整理，一方面这是个学习提高的过程，另一方面也能帮助大家解决这方面的问题。同时如有不当或不完善的地方，希望各位战友不断补充，争取有朝一日我们能把园子里战友的经验系统整理，给大家以帮助。 我先把设计引物如何设计酶切位点这方面的帖子整理一下，因为昨天一下子看到三个相似问题。原帖如下：我想向你求教一个问题,假如说我想把胰岛素基因和腺病毒载体连接起来,如何确定设计目的基因PCR时的引物呢?和相应的限制性核酸内切酶呢?谢谢老师能给予讲解,谢谢 [整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后切不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。但这就需要你仔细设计引物。连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。 （一）设计引物前应做的准备工作： 准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分 对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用 准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题 两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。我看promega的说明书上说，最好隔四个。还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。 两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。 最好使用酶切效率高的。 最好使用双酶切有共同buffer的酶。
Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer ove rall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 最后说一句，敢于尝试就会成功。 第二贴 －－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。 －－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 －－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 －－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。 －－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。 －－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。 谈一下我学这个引物设计的过程吧：
利用IN T ERN ET设计PCR引物举例 周咏东 华西医科大学附属第一医院眼科(610041) 国际互联网上信息资源十分丰富,给人们的生活、学习和工作带来了极大的方便。过去,需要设计PCR引物时,研究人员需要查阅大量文献,有时因无法查到原文,或无相关报道,会使研究工作一开始就不能顺利开展。笔者在科研中发现,有许多科研人员未能掌握I NT ERN ET上有关引物设计的共享资源,故结合实际应用经验予以介绍。使你的科研工作如虎添翼。 IN T ER NET上设计引物,分为两个步骤: 1 检索待扩增基因的DN A序列 首先接入IN T ERN ET,然后键入网址:w w w.ncbi.nlm. nih.g ov便进入了美国国家医学图书馆的生物技术信息中心的主页。在“Sear ch”右边的检索框内选择“G enBank”,然后在“fo r”右边的框内键入你检索的基因序列名,如“human Bcl-2cDN A sequence”,点击“Go”,检索就开始了。 出现的下一网页是“Cur rent Q uery”即告诉你检索出相关文献的数目。如你对结果不满意,该网页下半部分有“A dd T er m(s)to Q uer y”和“M o dify Cur rent Q uer y”两栏供你重新检索;如你对检检索结果满意,即可点击“Retr iev e XX”(X X 为查出的文献数)。接着即显示了刚才调出的文献名。你可选择一篇最符合的,然后将“Display”键右边的框内选择为FA ST A r epor t”(这是下一步设计引物所规定的),点击“D is-play”健,你要的序列就显示出来了。 最后,将这段序列全选,在“编辑”栏中点击“复制”,将此窗口最小化,重开窗口,进入下一步骤。 2 引物的设计 在新开的窗口中,健入网址w ww.g eno me.w https://www.doczj.com/doc/b910329366.html, 你即进入了“Whitehead Instit ut e for Bio medical R eser ch/ M IT Cent er for Genome Resear ch”的主页。在主页中先找到“G enome Center Softw ar e”标题,在其中的标题为“Ex peri-mental W eb-based Softw ar e”中,点击“W WW.P rimer P ick-ing(Pr imer3)”,此项,我们将用此网上软件设计引物。 网页上显示为“P r imer3o ld V ersio n”及“Click Her e T o T r y N ex t Ver sio n”,这两个版本大同小异,随便用哪一个。关键是在“Paste sour ce sequence belo w”文字下方的大空框内,粘贴上第一步查出的那段序列。然后根据自己的要求,对列出的各项引物设计指标作相应变动,否则为默认。确认指标设定完毕后,点击粘贴序列框下方的“Pick Pr imer s”键,你即得到了所需的引物,显示在“P rimer3O utput”网页上,共有5对,你可按需任选其一。 通过上述两个步骤,你如愿以偿,是不是很简便、快捷?快动手试一试吧!。 编辑 陈小娜 2.1.2非标准数字影像设备上网直接接入模块 该模块用于解决一部分带有数字网络接口,但又仅符合生产厂家内部标准的设备上网问题。以往,生产数字影像设备的众多厂家由于没有统一的上网标准,使医院相当一部分数字影像设备难以上网,因此,该模块须克服许多困难和问题,在实践中逐渐地、局部性地予以实现和完善。 2.1.3 非标准数字影像设备上网间接接入模块 此模块专用于对医院过去引进的,生产厂商根本就没提供上网接口的一部分早期非标准数字影像设备,通过对影像重新A/D的方法让它们间接上网。 2.2 数字影像会诊中心模块 建立医院数字影像局域网与PA CS系统,其核心意义在于能够方便地汇集各种各类检查的数字影像,提供给专家进行综合会诊。因此,在PA CS局域网基础上,建立硬件设施过硬、图像显示清晰、显示技术优良,能同时方便地显示各种数字诊断影像的数字化影像会诊中心,在很大程度上将代表整个项目的临床诊断价值与水平。2.3 数字影像局域网网络工程模块 网络工程模块包括:网络服务器、数据存储与管理软件系统模式、网络布局与工作站分布、网络构架与布线等等。此部分模块归属于计算机Intr anet信息网络工程范畴,对当前医院影像局域网In-tr anet的软硬件性能指标及设备系统的可扩展性具有决定性的作用。 2.4 各工程模块的信息流与局域网系统P ACS软件模块 如果说硬件是骨架,软件就是血液。建立了良好的硬件平台以后,必须要建立合理的网络信息流向和配以优良的PA CS 软件系统,才能保证整个系统能够正常运行。因此,这是建立数字影像会诊中心时,必须很好建立的又一个重要模块。 总之,医院建立数字影像局域网,并逐步过度到最终院际广域网连接已是二十一世纪医院计算机网络发展的必然趋势。我们必须紧跟这一时代发展潮流,扎扎实实从手上工作做起,理清各个系统模块关系,做好各方面技术储备,为医院建立数字影像局域网及P A CS系统作好准备。 编辑 杨立新 142?医学信息2001年3月第14卷第3期 Internet应用●
P C R技术(包含引物设 计)
聚合酶链式反应（PCR） 原理： DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR技术分类（常用） （1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA 片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。 （2）锚定PCR技术(Anchored PCR, APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。 （3）不对称PCR技术(asymmetric PCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR 技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。 （4）反转录PCR技术(reverse transcription PCR, RT-PCR)：当扩增模板为RNA 时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。
引物设计的11条黄金法则
PCR引物设计的11条黄金法则 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值
5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T 时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端
1 引物的设计以及初步筛选 引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的，目前运用软件Primer Premier 5 或美国 whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序 Primer 3来设计引物，再用软件Oligo 6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。 ①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配(False pr iming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量[21。 ②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。 ③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。 ④DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减，3’端AG最好不要高于9．0 keaf mol[31。 ⑤避免形成稳定的引物二聚体(Dimer and Cross DimeO 和发夹结构(Hairpin)，AG 高于4．5 keal／mol时易引发上述两种结构的产生。 ⑥引物所在的模板区域应该位于外显子区，最好跨越一个内含子区，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。 ⑦如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。而以mRNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。 ⑧5’ 端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物[2]。只要掌握了以上原则和注意事项，我们可以在软件和程序设计的一组引物中筛选出几对我们需要的目标引物。Primer Premier 5和Oligo 6可以在https://www.doczj.com/doc/b910329366.html,/soft/下载，primer3的主页位置在h ttp://https://www.doczj.com/doc/b910329366.html,。 2 引物的二次筛选 引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出适合我们进行特异、高效PCR扩增的那对引物。本步应注意以下两点，一是得到的一系列引物分别在Genebank 中进行回检。也就是把每条引物在比对工具(https://www.doczj.com/doc/b910329366.html,/blast/) 的bl astnr中进行同源性检索，弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，也就是有可能形成错配的引物。一般连续10 bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3’端应避免连续5-6 bp的同源。二是以mRNA为模板设计引物时要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接位点(例如https://www.doczj.com/doc/b910329366.html,/GENESCAN.html的GENESCA N工具或者GeneParser软，然后弃掉正好位于剪接位点的引物。
引物设计和Primer-BLAST的应用 Lv Peng 2015.11.18
CONTENT 1.PCR-引物设计目的 2.引物设计原则 3.设计引物软件 4.在线设计工具 5.probeBase 简介
1.1PCR（Polymerase Chain Reaction） 聚合酶链式反应 1971 Khorana 提出设想 1985 Kary Mullis 发明了PCR 1986年5月 Mullis在冷 泉港实验室 做专题报告 冷泉港实验室（The Cold Spring Harbor Laboratory，缩写CSHL），又译为科尔德斯普林实验室。
几不同的PCR技术 1.扩增已知序列两侧DNA的PCR：反向PCR（Inverse PCR，IPCR）、锚定PCR（anchored PCR）、RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）、连接介导的PCR（ligation-mediated PCR，LM-PCR）； 2.检测有限量稀有靶序列，即一对引物扩增产物不足以以通过凝胶电泳观察到的时：巢式PCR（nested PCR）； 3.快速、灵敏、特异而准确定量的PCR：实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR，RQ-PCR）。
特性 优化 碱基组成 （G+C ）含量应在40%-60%，4种碱基要分布均匀；长度 一般为18-27个核苷酸长度。上下游引物长度差别不能大于3bp ；重复和自身互补序列 不能有大于3bp 的反向重复序列或自身互补序列存在；上下游引物互补性一个引物的3’末端序列不能结合到另一个引物的任何位点上； 解链温度（Tm ） 两个引物的Tm 值相差不能大于5℃，扩增产物与引物的Tm 值相差不能大于10℃3’末端 引物3’末端碱基尽量为G 或C ，不能使3’末端有NNGC 或NNCG 序列引物序列不要有局部的GC rich 或AT rich （特别是3’端），避开T/C 或A/G 的连续结构 1.2引物设计原则 引物特性及优化设计
摘要： 记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。愣是写了一大段的PCR 条件摸索的讨论。后来PCR成为实验最基本的一步了，但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方。PCR的第一步就是引物设计了。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR 扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： ①引物长度 一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。 在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃ 在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃ 另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。 总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。 ② GC含量 一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm 值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。 ③退火温度 退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。 ④避免扩增模板的二级结构区域 选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
The central role of UDPGDH played in capsule and other polysaccharides synthesis. KPS, capsule polysaccharide; LPS,lipopolysaccharide 简并引物设计方法 （1）利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTP（通过蛋白查蛋白），在整个NR数据库中查找与之相似的氨基酸序列。 （2）对所有的序列进行多序列比对将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W/X，也可在线分析。所有序列的共有部分将会显示出来。“*”表示保守，“：”表示次保守。 （3）确定合适的保守区域设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸残基为宜，使得PCR产物在150~1200bp 之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸的保守区，因为每条引物至少18bp左右。 若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次的结果反复调整。最终目的就是有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。 （4）利用软件设计引物当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中Primer 5.0 支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入Primer 5.0 中，将其翻译成核苷酸序列，该序列群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T，该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在Primer 5.0 中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。 （5）对引物的修饰若得到的引物为： 5-NAGSGNGCDTTANCABK-3 则简并度=4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度很高不利于PCR，可以通过次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤可以很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度。 这样设计出来的简并引物对，适用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。 简并引物设计原则
microRNA的引物设计 以ssc-miR-222-3p为例设计引物，其成熟体序列为：AGCTACATCTGGCTACTGGGTCT 反向引物：每个反向引物的都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环， 固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3， 在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是ssc-miR-222-3p从后面数八个碱基的反向互补序列，就是CTGGGTCT的反向互补：AGACCCAG ，最后得到的反向引物的序列为 5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGACCCAG -3， 正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG 在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除掉后面六个碱基后序列为：AGCTACATCTGGCTACT 5，-ACACTCCAGCTGGG AGCTACATCTGGCTACT -3， URP：统一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCG U6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA ，R-AACGCTTCACGAATTTGCGT 使用方法： 1逆转的引物：所有要做的miRNA反向引物的混合，每个10微升 2PCR的引物：50微升的体系，30微升的水，10微升的正向引物，10微升的URP
2．hsa-miR-124（hsmq-0032 引物） 推荐退火温度：60℃ hsa-miR-124 扩增曲线示意图hsa-miR-124 融解曲线示意图 3．hsa-miR-125b(hsmq-0034 引物) 推荐退火温度：60℃ hsa-miR-125b 扩增曲线示意图hsa-miR-125b 融解曲线示意图
1-2890(引物1) #1: Product of length 640 (rating: 171) Contains region of the molecule from 1 to 640 Tm: 72.1 C TaOpt: 48.8 C GC: 32.3 Sense Primer: CCTGGTTAATCCAAATCAC Similarity: 100.0% Length: 19 Tm: 44.1 C GC: 42.1 dH: -142.0 kcal/mol dS: -372.4 cal/mol dG: -29.2 kcal/mol Antisense Primer: GACAGGCCCTAATTAAGTT Similarity: 100.0% Length: 20 Tm: 45.0 C GC: 42.1 dH: -158.0 kcal/mol dS: -418.4 cal/mol dG: -31.5 kcal/mol Tm Difference: 0.9 GC Difference: 0 #1: Product of length 540 (rating: 171) Contains region of the molecule from 1 to 540 Tm: 72.2 C TaOpt: 49.4 C GC: 33.1 Sense Primer: CCTGGTTAATCCAAATCACT Similarity: 100.0% Length: 20 Tm: 45.8 C GC: 40.0 dH: -149.8 kcal/mol dS: -393.2 cal/mol dG: -30.8 kcal/mol Antisense Primer: ATAAGATTTGAGGTCAGCCA Similarity: 100.0% Length: 20 Tm: 46.4 C GC: 40.0 dH: -147.7 kcal/mol dS: -386.3 cal/mol dG: -30.7 kcal/mol Tm Difference: 0.6 GC Difference: 0.0 1-2890(引物2) #1: Product of length 603 (rating: 171) Contains region of the molecule from 514 to 1116 Tm: 73.9 C TaOpt: 50.3 C GC: 37.0 Sense Primer: TTGAAGATGGCTGACCT Similarity: 100.0% Length: 18 Tm: 42 C GC: 47.1 dH: -129.6 kcal/mol dS: -335.0 cal/mol dG: -27.9 kcal/mol Antisense Primer: GGAGGCCCTTTAACTTAA
PCR引物设计的原则 引物设计的原则: 首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm 值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点： 1. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导 致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度。 2. 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR 影响不大，因 此常用来引进修饰位点或标记物。 3. 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T 比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。但也有认为：原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。 4. 引物所对应模板序列的Tm 值最好在72℃左右。（Tm 值曲线以选取72 度附近为 佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在55－80℃之间 5. ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。 6. 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，并且不好找其他更 合适的引物，那么这对引物也是可以接受的。 7. Frq 曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。选 取引物时，宜选用Frq 值相对较低的片断。 8. 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即
引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。
LAMP原理及引物设计与实例 ．LAMP引物的设计 LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同. B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。 2．扩增原理 60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链（如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl 为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3' 末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。 第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。 https://www.doczj.com/doc/b910329366.html,MP的特点 LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点： (1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产