核糖核酸酶Onconase的稀释复性条件优化研究

西北大学学报(自然科学网络版) 2004年11月，第2卷，第11期Science Journal of Northwest University Online Nov. 2004, V ol.2. No.11收稿日期：2004-06-03基金项目：国家自然科学基金资助项目（20175016）离子交换色谱对溶菌酶复性的色谱条件优化刘红妮，龚波林，耿信笃（西北大学 现代分离科学研究所/分离科学陕西省重点实验室，陕西 西安，710069）摘要：对离子交换色谱中影响溶菌酶（Lys ）复性的各个因素逐一进行考察。

结果表明，当流动相中含有3.0 mol/L 脲、洗脱剂(NH 4)2SO 4、还原型/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG ）比例为5:1、流速2.0 mL/min 、pH 8.0、温度25 ℃时，在蛋白初浓度为20.0 mg/mL 时还原变性Lys 的活性回收率可达95.4%。

认为此方法对蛋白的复性效率优于稀释法。

关键词：蛋白复性；溶菌酶；离子交换色谱中图分类号：O652.63 文献标识码：A 文章编号：1000-274X(2004)0109-09蛋白质折叠是生物化学中的前沿课题。

它不仅涉及生命科学中生命是如何起源的重大理论问题，而且对于基因重组蛋白质的复性等应用也有十分重要的意义。

传统的蛋白质复性方法有稀释法、透析法。

近年来报道了一些新的复性方法，包括超滤法[1]、分子伴侣法[2]及人工分子伴侣[3,4]法、添加折叠促进剂法（如PEG [5]、L-精氨酸[6]、四氢糠醇[7]等帮助蛋白复性）及液相色谱法（LC ）[8,9]。

其中，LC 法是近年来发展最快的复性方法之一，其优点在于利用蛋白质以单分子状态吸附于固定相上，避免或减小单个分子间的相互作用，从而达到了抑制聚集，提高活性回收率的目的。

同时，在复性过程中，复性的目标蛋白还可以与大部分杂蛋白进行分离，实现了蛋白复性与纯化同时进行的目的。

自1991年耿信笃等首次将高效疏水相互作用色谱（HIC ）和尺寸排阻色谱（SEC ）用于重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）的复性及同时纯化[10,11]以来，国外科学家分别用离子交换色谱（IEC ）[12]、排阻色谱法（SEC ）[13,14]和亲合色谱法(AFC)[15]进行了蛋白折叠的研究，迄今已有百余篇论文发表，说明LC 用于蛋白质的复性已引起广泛注意。

L-精氨酸助溶菌酶复性过程动力学研究
范向东;孙在柏
【期刊名称】《化学与生物工程》
【年(卷),期】2010(027)010
【摘要】通过测定复性后酶活性和计算蛋白复性收率,研究了L-精氨酸助溶菌酶的最佳复性条件,利用蛋白质的复性和聚集反应竞争三态动力学模型描述了L-精氨酸助溶菌酶复性动力学,在溶菌酶浓度为100～500 μg·mL-1、L-精氨酸浓度为0～1.0 mol·L-1的条件下,分析了溶菌酶浓度及L-精氨酸浓度对复性动力学常数的影响.结果表明,L-精氨酸助溶菌酶复性符合三级聚集反应动力学,L-精氨酸的主要作用是抑制蛋白聚集体的生成速率,从而达到抑制蛋白沉淀、提高复性收率的效果.【总页数】5页(P50-54)
【作者】范向东;孙在柏
【作者单位】上海大学环境化学学院,环境污染与健康研究所,上海,200072;上海大学环境化学学院,环境污染与健康研究所,上海,200072
【正文语种】中文
【中图分类】O629.73;O643.1
【相关文献】
1.荧光相图法研究变性蛋白溶菌酶在脲和盐酸胍溶液中的复性过程 [J], 张潭;边六交;王世祥;郑晓晖
2.体积排阻色谱法研究变性溶菌酶分子复性过程中集聚体的形成 [J], 边六交;杨晓
燕;刘莉
3.脲或盐酸胍溶液中变性溶菌酶复性过程中集聚体的研究 [J], 边六交;杨晓燕;刘莉
4.非还原脲变性蛋白溶菌酶稀释复性过程中集聚现象的研究 [J], 边六交;梁长利;杨晓燕;刘莉
5.用蛋白电泳和高效凝胶排阻色谱法分析还原脲变性蛋白溶菌酶稀释复性过程的集聚体 [J], 梁长利;边六交
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核糖核酸酶Onconase的稀释复性条件优化研究郭红;徐殿胜;王庆诚【摘要】采用稀释复性方法从包涵体中复性得到有活力的Onconase蛋白,并与传统的醋酸沉淀复性方法进行了比较,考察了复性温度、尿素浓度、氧化型谷胱甘肽(GSSG)加入时间对复性效果的影响.结果表明,在最佳复性温度为4℃、采用最佳复性体系(先加GSSG的含2 mol·L-1尿素的稀释复性缓冲溶液)时,复性纯化后Onconase含量和回收率明显高于醋酸沉淀复性法.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2013(030)010【总页数】4页(P57-60)【关键词】核糖核酸酶;包涵体;稀释复性;分离纯化【作者】郭红;徐殿胜;王庆诚【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;上海南方模式生物研究中心,上海201210【正文语种】中文【中图分类】Q511核糖核酸酶是一类广泛存在于动植物体内的、具有水解作用的一类酶。

它通过剪切转录核糖核酸及对核糖核酸进行修饰和降解来达到抑制肿瘤细胞生长的目的［1］。

Onconase（豹蛙酶）是一种从北极豹蛙卵母细胞和早期胚胎中提取的核糖核酸酶，对人肺腺癌细胞、慢性粒细胞白血病细胞、黑色素瘤细胞及人体肺腺癌上皮细胞等都有细胞毒性作用［2，3］，是一种具有很大开发潜力的蛋白质。

目前，国内多通过毕赤酵母和大肠杆菌发酵来制备Onconase。

作者在此先提纯大肠杆菌发酵获得的包涵体，再使包涵体复性得到有活力的Onconase蛋白。

由于氧化型谷胱甘肽（GSSG）对蛋白质中二硫键的重新形成起到很重要的作用，尿素对蛋白质的复性也有意想不到的效果，因此，在复性缓冲溶液［4］中加入一定量的GSSG和尿素，并考察了复性温度、尿素浓度、GSSG加入时间对复性效果的影响，以确定最优稀释复性条件，并与传统的醋酸沉淀复性法进行了对比。

某大学生物工程学院《普通生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（140分，每题5分）1. 合成胆固醇的限速酶是HMG还原酶。

（）[中山大学2018研]答案：错误解析：合成胆固醇的限速酶是HMGCoA还原酶。

2. 磷酸吡哆醛只作为转氨酸的辅酶。

（）[山东大学2017研]答案：错误解析：磷酸吡哆醛不仅是氨基酸代谢中的转氨酶的辅酶，同时也是脱羧酶的辅酶。

3. ATP为GMP的合成提供能量，GTP为AMP的合成提供能量，缺乏ATP和GTP中的任何一种都会影响另一种的合成。

（）答案：正确解析：4. 磷酸吡哆醛只作为转氨酶的辅酶。

（）答案：错误解析：磷酸吡哆醛可作为转氨酶，氨基酸脱羧酶和δ氨基γ酮戊酸合成酶（ALA合酶）的辅酶分别参与转氨基作用，脱羧基作用和血红素合成反应。

5. 核苷酸从头合成途径的起始物都是PRPP。

（）答案：错误解析：嘌呤核苷酸合成的起始物是PRPP；嘧啶核苷酸的合成一开始没有核糖参加。

6. 核苷中碱基和糖的连接一般是CN连接的糖苷键，不存在CC连接的糖苷键。

（）[华东理工大学2007研]答案：错误解析：假尿嘧啶核苷中含有CC连接的糖苷键。

7. 真核细胞内的RNA都从DNA转录而来，是由一种RNA聚合酶合成的。

（）答案：错误解析：真核细胞内的RNA不都是从DNA转录而来，有些是本身就有的。

8. rRNA基因的启动子序列在不同种属中变化很大，超过RNA pol Ⅱ识别的启动子序列。

（）答案：正确解析：9. 人体内若缺乏维生素B6，维生素PP，维生素B12和叶酸，均会引起氨基酸代谢障碍。

（）答案：正确解析：维生素B6是转氨酶辅酶磷酸吡哆醛的成分之一，维生素PP是L谷氨酸脱氢酶辅酶NAD＋或NAPP＋的成分之一，叶酸和维生素B12在一碳单位代谢中分别是一碳单位的载体和转甲基酶的辅酶，因此，缺乏时均会影响氨基酸代谢。

生物技术进展２０２１年㊀第１１卷㊀第２期㊀２１４~２２２ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０２１￣０１￣１４ꎻ接受日期:２０２１￣０１￣２７㊀基金项目:上海市浦东新区科技发展基金(ＰＫＸ２０１９￣Ｓ０９)ꎮ㊀联系方式:张博慧Ｅ￣ｍａｉｌ:ｙａｏｙａｏｚｈｄ＠１６３.ｃｏｍꎻ∗通信作者许俊彦Ｅ￣ｍａｉｌ:ｊｕｎｙａｎ.ｘｕ＠ｄｒａｇｏｎｂｏａｔｂｉｏ.ｃｏｍ利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化张博慧ꎬ㊀贾戴辉ꎬ㊀程倩ꎬ㊀许俊彦∗ꎬ㊀邵喆ꎬ㊀黄应峰宝船生物医药科技(上海)有限公司药物分析部门ꎬ上海２０１２０３摘㊀要:为了优化利用Ｎ糖苷酶Ｆ(ＰＮＧａｓｅＦ)酶解单克隆抗体中Ｎ糖的方法ꎬ应用本公司生产的单抗对ＰＮＧａｓｅＦ酶的酶解条件进行优化ꎬ包括缓冲液ｐＨ㊁酶种类㊁仪器㊁酶解程度㊁变性缓冲液及酶加入量等ꎬ总结酶解条件对Ｎ糖谱结果的影响ꎮ结果显示ꎬ置换缓冲液至１ˑＰＢＳ中可以避免某些单抗在低ｐＨ酶解时Ｇ０Ｆ转化为Ｇ０Ｆ￣ＧＮ并可改善峰型ꎻ快速ＰＮＧａｓｅＦ和加入变性缓冲液能有效提高酶解效率ꎻＵＰＬＣ和１.７μｍ粒径色谱柱能提高分离度ꎻ不完全酶解影响Ｎ糖含量结果ꎮ研究结果表明ꎬ采用优化的酶解条件可快速㊁有效的酶解单抗上的Ｎ糖ꎬ使Ｎ糖谱结果准确可靠ꎬ为细胞株筛选和单抗药物质量控制提供有效手段ꎮ关键词:单克隆抗体ꎻＮ糖ꎻＰＮＧａｓｅＦ酶ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０２１.０００５中图分类号:Ｑ８１９ꎬＲ９７㊀㊀㊀文献标识码:ＡＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙＰＮＧａｓｅＦ㊀ＺＨＡＮＧＢｏｈｕｉꎬＪＩＡＤａｉｈｕｉꎬＣＨＥＮＧＱｉａｎꎬＸＵＪｕｎｙａｎ∗ꎬＳＨＡＯＺｈｅꎬＨＵＡＮＧＹｉｎｇｆｅｎｇＤｒｕｇＡｎａｌｙｓｉｓＤｅｐａｒｔｍｅｎｔꎬＤｒａｇｏｎｂｏａｔＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ.ꎬＬｔｄꎬＳｈａｎｇｈａｉ２０１２０３ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅａｍｅｔｈｏｄｏｆｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙｕｓｉｎｇＰＮＧａｓｅＦꎬａｓｅｒｉｅｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒｐＨꎬｅｎｚｙｍｅｔｙｐｅꎬｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓꎬｄｅｇｒｅｅｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓꎬｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｅｄｏｓａｇｅｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｕｓｉｎｇｓｅｖｅｒａｌｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ.Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔꎬｂｕｆｆｅｒｅｘｃｈａｎｇｉｎｇｉｎｔｏ１ˑＰＢＳｃｏｕｌｄａｖｏｉｄｔｈｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｓｏｍｅｍＡｂｓｆｒｏｍＧ０ＦｔｏＧ０Ｆ￣ＧＮａｔｌｏｗｐＨａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｐｅａｋｓｈａｐｅ.ＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｎｄｄｅｎａｔｕｒｅｂｕｆｆｅｒｃｏｕｌｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ.ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＵＰＬＣａｎｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｌｕｍｎｗｉｔｈ１.７μｍｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｃｏｕｌｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ.ＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｏｕｌｄａｆｆｅｃｔｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔ.ＲｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＰＮＧａｓｅＦｃａｎｑｕｉｃｋｌｙａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｈｙｄｒｏｌｙｚｅｔｈｅＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍｔｈｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎬｗｈｉｃｈｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇＮ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｅｌｌｌｉｎｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｄｒｕｇｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎻＮ￣ｇｌｙｃａｎꎻｐｅｐｔｉｄｅＮｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ(ＰＮＧａｓｅＦ)㊀㊀Ｎ糖基化修饰是单克隆抗体药物普遍存在的翻译后修饰现象ꎮ目前研究表明ꎬ糖基化修饰与单克隆抗体药物的功能㊁药物代谢㊁免疫原性等关系密切[１￣３]ꎬ如核心岩藻糖缺失能显著增强ＡＤＣＣ效应[４]ꎬ半乳糖能够增强ＣＤＣ活性[５]ꎻ末端Ｎ￣乙酰葡萄糖影响抗体药物半衰期[６￣７]ꎻ唾液酸化糖型具有抗炎症功能[８]ꎻα(１￣３)半乳糖和ＮＧＮＡ型唾液酸易引起免疫原性[９]等ꎮＮ糖对抗体结构也具有重要作用ꎬ能稳定ＣＨ２结构域ꎬ去糖抗体稳定性会变差ꎬ更易发生去折叠和聚集[１０]ꎮＮ糖类型和含量受细胞株㊁培养条件㊁纯化和储存[１１￣１３]等过程的影响ꎬ因此在单抗药物细胞筛选㊁工艺优化㊁纯化㊁产品放行和稳定性考察中控制和监测Ｎ糖含量ꎬ保证单抗药物安全性㊁有效性等尤为重要ꎮ目前检测Ｎ糖的方法主要有亲水色谱－荧光法[１４]㊁ＣＥ￣ＬＩＦ法[１５￣１６]和质谱法[１７￣１８]. All Rights Reserved.等ꎮ其中亲水色谱－荧光法是目前应用最为广泛的方法ꎬ该方法通常需要用糖苷酶水解糖蛋白上的Ｎ糖链ꎬ再用标记试剂进行衍生化ꎬ采用亲水色谱柱分离ꎬ荧光检测器检测ꎮ由于ＰＮＧａｓｅＦ几乎能水解所有哺乳动物细胞产生的Ｎ糖ꎬ因此得到广泛应用[１９]ꎮ传统的Ｎ糖谱检测方法一般耗时较长ꎬ目前快速Ｎ糖样品制备的试剂盒已经商品化ꎬ大幅提高了Ｎ糖的检测效率ꎬ但是通常价格昂贵ꎮ而应用快速ＰＮＧａｓｅＦ酶与传统制备过程相组合成为提高检测效率和降低检测成本的一种选择ꎮ本研究基于亲水色谱－荧光法ꎬ针对ＰＮＧａｓｅＦ水解条件进行了优化ꎬ发现和解决了酶解过程中易对结果产生影响的一些因素ꎬ建立了高效准确的Ｎ糖检测方法ꎬ以期为Ｎ糖的检测研究提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验材料１.１.１㊀供试品㊀本研究所用ｍＡｂ１㊁ｍＡｂ２和ｍＡｂ２￣Ｆ均为宝船生物医药科技(上海)有限公司生产的ＩｇＧ１型单克隆抗体ꎮ１.１.２㊀试剂和耗材㊀Ｎ糖苷酶Ｆ(ＰＮＧａｓｅＦ)㊁快速ＰＮＧａｓｅＦ酶(ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ)及变性缓冲液(５ˑ)均购自ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ公司ꎻ无水乙醇㊁甲酸铵㊁乙酸㊁二甲基亚砜(ＤＭＳＯ)㊁２￣氨基苯甲酰胺(２￣ＡＢ)㊁氰基硼氢化钠㊁β￣巯基乙醇等均购自Ｓｉｇｍａ公司ꎻ甲酸和乙腈购自Ｆｉｓｈｅｒ公司ꎻＰＢＳＢｕｆｆｅｒ(１ˑ)购自上海生工ꎻ１０ｋＤ超滤离心管购自Ｍｅｒｃｋ公司ꎻ１００ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ(含１％ＳＤＳꎬｐＨ９.０)溶液和非涂层－熔融石英毛细管购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻ纯化柱(ＧｌｙｃｏＣｌｅａｎＴＭＳＣａｒｔｒｉｄｇｅｓ)购自Ｐｒｏｚｙｍｅ公司ꎻ色谱柱ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ(１.７μｍꎬ２.１ｍｍˑ１５０ｍｍ)购自Ｗａｔｅｒｓ公司ꎻ色谱柱ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏＧｌｙｃａｎＭａｐｐｉｎｇＣｏｌｕｍｎ(２.７μｍꎬ４.６ｍｍˑ１５０ｍｍ)购自Ａｇｉｌｅｎｔ公司ꎮ１.１.３㊀主要仪器设备㊀高效液相系统(ＨＰＬＣꎬ１２６０)购自Ａｇｉｌｅｎｔ公司ꎻ超高效液相系统(ＵＰＬＣꎬＨ￣ＣｌａｓｓＰｌｕｓ)购自美国Ｗａｔｅｒｓ公司ꎻ液质联用系统(ＬＣ￣ＭＳꎬＱＥｘａｃｔｉｖｅ)和数据处理软件(ＢｉｏｐｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒ)均购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司ꎻ毛细管电泳仪(ＣＥꎬＰＡ８００Ｐｌｕｓ)购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻ真空离心浓缩干燥仪(ＲＶＣ２￣２５)购自德国Ｃｈｒｉｓｔ公司ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀蛋白沉淀和Ｎ糖衍生化㊀向酶解后的样品中加入３倍体积的冰乙醇ꎬ－１５~－２５ħ放置约１ｈꎬ高速离心１０ｍｉｎꎬ取上清干燥ꎮ加入１０μＬ２￣ＡＢ衍生化试剂ꎬ６５ħ避光孵育３ｈꎮ用纯化柱纯化后干燥ꎬ５０％乙腈复溶ꎬ准备上机分析ꎮ１.２.２㊀ＨＰＬＣ色谱条件㊀仪器采用高效液相系统(Ａｇｉｌｅｎｔꎬ１２６０)ꎻ色谱柱采用ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏＧｌｙｃａｎＭａｐｐｉｎｇＣｏｌｕｍｎꎻ流动相Ａ为１００ｍｍｏｌ Ｌ－１甲酸铵(ｐＨ４.５)ꎬ流动相Ｂ为１００％乙腈ꎻ进样量２μＬꎻ流速０.５ｍＬ ｍｉｎ－１ꎻ荧光检测器激发波长２６０ｎｍꎬ发射波长４３０ｎｍꎻ色谱柱温度５５ħꎻ梯度洗脱ꎮ１.２.３㊀ＵＰＬＣ色谱条件㊀仪器采用超高效液相系统(ＷａｔｅｒｓꎬＨ￣ｃｌａｓｓｐｌｕｓ)ꎬ色谱柱采用ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎꎮ流动相Ａ为１００ｍｍｏｌ Ｌ－１甲酸铵(ｐＨ４.５)ꎬ流动相Ｂ为１００％乙腈ꎬ进样量２μＬꎬ流速０.５ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ荧光检测器激发波长３３０ｎｍꎬ发射波长４２０ｎｍꎬ色谱柱温度６０ħꎬ梯度洗脱ꎮ１.２.４㊀质谱参数㊀应用液质联用系统(ＬＣ￣ＭＳꎬＱＥｘａｃｔｉｖｅ)的ＨＥＳＩ正离子模式(ＨＥＳＩ＋)ꎬ离子源的温度和电压分别为３２０ħ和３.８ｋＶꎬ离子传输管温度为２００ħꎬ其他仪器参数设置均经过优化以获得最佳信号响应ꎻ母离子扫描范围７００~３０００ｍ ｚ－１ꎬ分离度１５０００ꎬ分析时长６０ｍｉｎꎻ数据处理软件采用ＢｉｏｐｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒꎮ１.２.５㊀还原毛细管凝胶电泳(ＲＣＥ￣ＳＤＳ)㊀将蛋白沉淀用１００ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ(含１％ＳＤＳꎬｐＨ９.０)溶液复溶ꎬ加入β￣巯基乙醇还原ꎮ仪器采用毛细管电泳仪(ＢｅｃｋｍａｎꎬＰＡ８００ｐｌｕｓ)ꎬ毛细管采用非涂层－熔融石英毛细管ꎬＰＤＡ检测器ꎬ波长２２０ｎｍꎬ电动进样(－５ｋＶ)２０ｓꎬ电压分离(－１５ｋＶ)４０ｍｉｎꎮ２㊀结果与分析２.１㊀缓冲液ｐＨ对结果的影响分别将ｍＡｂ１和ｍＡｂ２样品调ｐＨ至４㊁５㊁６和７ꎬ取２００μｇ进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解２４ｈꎬ检测Ｎ糖含量ꎮ实验结果如表１和图１所示ꎬｍＡｂ２在不５１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.同ｐＨ缓冲液酶解的Ｎ糖含量高度一致ꎬ说明ｐＨ对该样品Ｎ糖水解无影响ꎻ而ｍＡｂ１中Ｎ糖含量随ｐＨ的变化出现明显差异ꎬ其中缓冲液ｐＨ为４时ꎬ峰２(ｐ２)含量出现大幅度升高ꎬ相应的峰３(ｐ３)含量明显下降ꎬｐＨ６和７条件下Ｎ糖含量基本一致ꎮ表１㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在不同ｐＨ缓冲液中酶解的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ１㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ样品名称ｐＨＮ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７ｍＡｂ１４２.０２３.４５７.６６.２３.４１.６０.４５３.７４.２７６.６５.１４.２２.２０.４６３.９１.３７９.８４.８４.３２.２０.４７３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４ｍＡｂ２４/７.４４６.０５.３２４.１８.２４.８５/７.６４５.８５.４２３.９８.２４.８６/７.６４５.７５.４２４.０８.２４.９７/７.４４５.７５.４２４.０８.２４.９图１㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在不同ｐＨ缓冲液中酶解的Ｎ糖色谱图Ｆｉｇ.１㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ６１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.㊀㊀将ｍＡｂ１不同ｐＨ酶解后的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ结果(图２)显示含Ｎ糖重链(ＨＣ)基本已被酶解成非糖基化重链(ＮＧＨＣ)ꎬ说明不同ｐＨ缓冲液下ＰＮＧａｓｅＦ酶解Ｎ糖２４ｈ后均酶解完全ꎬＮ糖含量的变化并非不完全酶解造成ꎮ利用液质联用鉴定各Ｎ糖的种类ꎬｐ２和ｐ３分别为Ｇ０Ｆ￣ＧＮ(Ａ１Ｆ)和Ｇ０Ｆ(Ａ２Ｆ)ꎮ通过比较不同时间(１㊁８和２４ｈ)酶解结果(表２)ꎬ发现缓冲液ｐＨ为４和５时ꎬｐ２和ｐ３含量的变化随着酶解时间的增加而呈梯度变化ꎬｐＨ４时尤为明显ꎻｐＨ为６和７时ꎬ变化不明显ꎮ因此推测在某些单抗分子上ꎬＧ０Ｆ上的Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖在低ｐＨ条件下易从Ｎ糖链上脱落ꎬ使Ｇ０Ｆ形成Ｇ０Ｆ￣ＧＮꎬ从而引起Ｇ０Ｆ￣ＧＮ和Ｇ０Ｆ含量的变化ꎮ因此在进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解时ꎬ应避免酶解体系中ｐＨ过低ꎮ图２㊀ｍＡｂ１不同ｐＨ酶解蛋白ＲＣＥ￣ＳＤＳ电泳图Ｆｉｇ.２㊀ＲｅｄｕｃｅｄＣＥ￣ＳＤＳｏｆｄｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｍＡｂ１ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ表２㊀ｍＡｂ１在不同ｐＨ缓冲液中酶解不同时间的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ２㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｓｐＨ时间/ｈＮ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７Ｍａｎ４Ｇ０Ｆ￣ＧＮＧ０ＦＭａｎ５Ｇ１ＦａＧ１ＦｂＧ２Ｆ４１９.３１.０７０.７８.０４.５１.９０.８８３.４７.３７３.０５.８４.３２.００.４２４２.０２３.４５７.６６.２３.４１.６０.４５１４.５０.８７８.６６.０４.６２.２０.４８３.８２.３７８.５５.２４.４２.３０.４２４３.７４.２７６.６５.１４.２２.２０.４６１４.５０.７７９.１５.７４.５２.２０.４８３.９１.０８０.４４.９４.４２.４０.３２４３.９１.３７９.８４.８４.３２.２０.４７１４.４０.７７９.７５.４４.５２.２０.４８３.９０.８８０.４４.８４.４２.４０.３２４３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４７１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.２.２㊀置换缓冲液的选择为避免样品缓冲液ｐＨ及成分对ＰＮＧａｓｅＦ酶解的影响ꎬ用超滤离心管将样品换液至合适的溶液中再进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎮ本研究选择了１ˑＰＢＳ溶液(ｐＨ７.４)和超纯水分别置换ｍＡｂ１和ｍＡｂ２的样品缓冲液ꎬ以未置换缓冲液(ｐＨ７)为对照ꎬＰＮＧａｓｅＦ酶解２４ｈꎬ进行Ｎ糖谱检测ꎮＮ糖色谱图和含量分别见表３和图３ꎬ结果表明１ˑＰＢＳ溶液㊁超纯水和样品缓冲液(ｐＨ７)的Ｎ糖谱结果一致ꎮ因为蛋白在超纯水中稳定性较差ꎬ所以本研究选用１ˑＰＢＳ溶液(ｐＨ７.４)置换样品的缓冲液ꎮ表３㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在样品缓冲液㊁１ˑＰＢＳ和超纯水中的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ３㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒꎬ１ˑＰＢＳａｎｄｗａｔｅｒ样品名称缓冲液Ｎ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７ｍＡｂ１样品缓冲液(ｐＨ７)３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４１ˑＰＢＳ３.９０.８８０.４４.８４.４２.４０.３超纯水３.９１.０８０.４４.９４.４２.４０.３ｍＡｂ２样品缓冲液(ｐＨ７)/７.４４５.７５.４２４.０８.２４.９１ˑＰＢＳ/７.６４５.９５.４２４.０８.２４.８超纯水/７.７４５.８５.４２４.０８.２４.８图３㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在样品缓冲液㊁１ˑＰＢＳ和超纯水中的Ｎ糖色谱图Ｆｉｇ.３㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒꎬ１ˑＰＢＳａｎｄｗａｔｅｒ２.３㊀不同ＰＮＧａｓｅＦ酶对Ｎ糖结果的影响直接取２００μｇ样品ꎬ分别加入快速ＰＮＧａｓｅＦ酶(ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ)和ＰＮＧａｓｅＦ进行酶解ꎬＮ糖谱如图４所示ꎮ结果显示用ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ进行酶解时ꎬ若选择用ＵＰＬＣ和１.７μｍ粒径的ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ色谱柱ꎬ则由于分离度的提高ꎬｍＡｂ２的Ｎ糖色谱图(图４Ｂ)中Ｇ０Ｆ和Ｇ１Ｆａ出现肩峰ꎬ而ＨＰＬＣ结果８１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.Ａ:ｍＡｂ２未置换缓冲液ＨＰＬＣ检测ꎻＢ:ｍＡｂ２未置换缓冲液ＵＰＬＣ检测ꎻＣ:ｍＡｂ２置换缓冲液ＵＰＬＣ检测ꎮ图４㊀不同ＰＮＧａｓｅＦ的Ｎ糖谱结果Ｆｉｇ.４㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔＰＮＧａｓｅＦ(图４Ａ)由于分离度较差ꎬ此峰未得到有效分离ꎮ当将ｍＡｂ２样品缓冲液置换至１ˑＰＢＳ中时(图４Ｃ)ꎬ该肩峰消失ꎮ综合２.１~２.３部分的研究结果可知ꎬ将样品置换缓冲液至合适的溶液中再进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎬ对改善Ｎ糖谱峰形和结果准确度至关重要ꎬ本研究采用了１ˑＰＢＳ溶液ꎬ效果良好ꎮ另外ꎬ在置换缓冲液的基础上使用快速ＰＮＧａｓｅＦ能将酶解时间缩短为数十分钟ꎬ有效提高了检测效率ꎮ选择ＵＰＬＣ能有效提高分辨率ꎮ２.４㊀蛋白变性对酶解效率的影响本研究发现ꎬ在非变性条件下利用快速ＰＮＧａｓｅＦ酶解不同单抗所需酶解时间差异明显ꎬ从数分钟至数小时不等ꎮ为了有效提高酶解效率ꎬ选择所需酶解时间最长的ｍＡｂ２￣Ｆ置换缓冲液至１ˑＰＢＳ中ꎬ加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶ꎬ５０ħ孵育１０ｍｉｎ后进行Ｎ糖谱检测处理ꎬ将沉淀的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ以未加变性缓冲液(５ˑ)样品为对照ꎮ由图５还原ＣＥ￣ＳＤＳ结果可知ꎬ相同的酶解时间条件下ꎬ蛋白变性后由于高级结构被破坏ꎬＮ糖充分暴露与酶接触ꎬ所以其酶解效果更好ꎮ２.５㊀酶解程度对Ｎ糖结果的影响在非变性条件下加入不同体积的ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶对ｍＡｂ２￣Ｆ进行Ｎ糖谱检测处理ꎬ将沉淀的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ以加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶的样品为对照ꎬ酶解条件均选择５０ħ㊁１０ｍｉｎꎮ由图６(左)９１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.可知ꎬ在非变性条件下酶解相同时间ꎬ酶量的增加使非糖基化组分增多ꎬ但酶量增加至２μＬ时酶解效果仍较差ꎬ而变性条件下用１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎬ糖基化组分基本被转换成非糖基化组分ꎮＮ糖水解的程度不同ꎬＮ糖含量(表４)明显成梯度变化ꎬ说明ＰＮＧａｓｅＦ对不同类型的Ｎ糖水解效率不同ꎬ因此为了获得样品中真实的Ｎ糖含量水平ꎬ应将Ｎ糖尽量酶解完全ꎮ图５㊀ｍＡｂ２￣Ｆ在变性和非变性条件下切糖后还原ＣＥ￣ＳＤＳ图谱Ｆｉｇ.５㊀ＲＣＥ￣ＳＤＳｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２￣Ｆｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｉｎｎａｔｕｒｅａｎｄｄｅｎａｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ表４㊀不同体积ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ｍＡｂ２￣Ｆ的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ４㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ２￣ＦｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｍｏｕｎｔＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ/μＬＮ糖含量/％Ｇ０Ｍａｎ５Ｇ１ａＧ１ｂＧ２０.５４３.４１８.４１８.４５.５２.６１.０４８.０１２.９２０.１６.４２.９２.０５４.５７.９２１.２７.３３.１１＋变性５５.２７.５２０.０８.０３.１３㊀讨论Ｎ糖检测结果的准确性受多种因素的影响ꎮ在缓冲液ｐＨ对ＰＮＧａｓｅＦ酶解的影响研究中发现ꎬ低ｐＨ能使某些单抗在酶解过程中Ｇ０Ｆ逐渐转化为Ｇ０Ｆ￣ＧＮꎬ造成检测结果的严重偏差ꎬ这种情况通常出现在ＰｒｏｔｅｉｎＡ亲和纯化后的样本ꎬ在低ｐＨ洗脱后直接进行酶解ꎬ若先将样品缓冲液ｐＨ调至中性或进行换液处理ꎬ能够避免ｐＨ的影响ꎮ对照ｍＡｂ２置换和未置换样品缓冲液酶解结果ꎬ置换缓冲液能有效消除Ｇ０Ｆ和Ｇ１Ｆａ的肩峰ꎬ消除样品缓冲液成分对检测结果的影响ꎮ另外ꎬ本研究对多种单抗的研究发现ꎬ酶解程度不同的Ｎ糖检测结果存在明显差异ꎬ说明Ｎ糖苷酶Ｆ对不同类型的Ｎ糖水解效率不同ꎬ这与已有文献报道[２０]一致ꎮ因此为了获得样品中真实的Ｎ糖含量水平ꎬ应将Ｎ糖尽量酶解完全ꎮ酶解程度可采用将蛋白沉淀进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ观察非糖基化组分含量的变化情况ꎮ在细胞株筛选和工艺优化阶段ꎬ快速㊁准确的Ｎ糖检测结果能够有效推进开发进度ꎬ而该阶段０２２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.图６㊀不同体积ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ｍＡｂ２￣Ｆ的ＲＣＥ￣ＳＤＳ和Ｎ糖谱图Ｆｉｇ.６㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎａｎｄＲＣＥ￣ＳＤＳｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２￣ＦｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｍｏｕｎｔ巨大的样本量又对成本控制提出更高的要求ꎬ因此建立一种高效㊁准确且低成本的Ｎ糖检测方法尤为重要ꎮ本研究确定了较为通用的ＰＮＧａｓｅＦ酶对单克隆抗体的酶解条件ꎬ即为将样品置换缓冲液至１ˑＰＢＳꎬ取适量样品加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶ꎬ５０ħ孵育１０ｍｉｎꎬ进行后续除蛋白㊁干燥等处理ꎬ快速ＰＮＧａｓｅＦ酶和变性处理的应用ꎬ将酶解时间大幅缩短ꎬ提高了检测效率ꎻ同时采用传统的ＵＰＬＣ和ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ色谱柱ꎬ有效提高了分离度ꎬ并控制了检测成本ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＦＲＩＥＳＳＷꎬＳＥＩＤＬＡꎬＳＯＥＲＧＥＬＦꎬｅｔａｌ..Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙａｎｄｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｈａｒ￣ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＦｃｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｅｕｒ.Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｂｉｏｐｈａｒｍ.ꎬ２０１６ꎬ１００:９４－１００. [２]㊀刘晓宇.单克隆抗体糖基化修饰的研究现状和进展[Ｊ].中国生物制品学杂志ꎬ２０２０ꎬ３３(２):２１６－２２１. [３]㊀ＬＩＵＬ.Ａｎｔｉｂｏｄｙｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｉｍｐａｃｔｏｎｔｈｅｐｈａｒｍａｃｏ￣ｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＦｃ￣ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｓｃｉ.ꎬ２０１５ꎬ１０４(６):１８６６－１８８４.[４]㊀ＳＨＩＥＬＤＳＲＬꎬＬＡＩＪꎬＫＥＣＫＲꎬｅｔａｌ..Ｌａｃｋｏｆｆｕｃｏｓｅｏｎｈｕ￣ｍａｎＩｇＧ１Ｎ￣ｌｉｎｋｅｄｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｍｐｒｏｖｅｓｂｉｎｄｉｎｇｔｏｈｕｍａｎＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｔｏｘｉｃｉｔｙ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００２ꎬ２７７:２６７３３－２６７４０.[５]㊀ＢＯＹＤＰＮꎬＬＩＮＥＳＡＣꎬＰＡＴＥＬＡＫ.Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｒｅ￣ｍｏｖａｌｏｆｓｉａｌｉｃａｃｉｄꎬｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄｔｏｔａｌｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣａｍｐａｔｈ￣１Ｈ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.ꎬ１９９５ꎬ３２:１３１１－１３１８.[６]㊀ＪＯＮＥＳＡＪꎬＰＡＰＡＣＤＩꎬＣＨＩＮＥＨꎬｅｔａｌ..Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｃｌｅａｒ￣１２２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.ａｎｃｅｏｆｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓｏｆａｃｏｍｐｌｅｘｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｃａｕｓｅｄｂｙｔｅｒｍｉｎａｌＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｎｈｕｍａｎｓａｎｄｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍｏｎｋｅｙｓ[Ｊ].Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００７ꎬ１７:５２９－５４０.[７]㊀ＫＥＣＫＲꎬＮＡＹＡＫＮꎬＬＥＲＮＥＲＬꎬｅｔａｌ..ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｏｍｐｌｅｘｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｗｈｏｓｅｖａｒｉａｂｌｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｃｌｅａｒａｎｃｅｉｎｈｕｍａｎｉｓｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｔｅｒｍｉｎａｌＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔ[Ｊ].Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓꎬ２００８ꎬ３６:４９－６０.[８]㊀ＮＩＭＭＥＲＪＡＨＮＦꎬＲＡＶＥＴＣＨＪＶ.Ｔｈｅａｎｔｉ￣ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｃ￣ｔｉｖｉｔｙｏｆＩｇＧ:ｔｈｅｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓＩｇＧｐａｒａｄｏｘ[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.ꎬ２００７ꎬ２０４:１１－１５.[９]㊀王冲ꎬ郭怀祖.不同细胞系表达的抗ＥＧＦＲ单抗糖基化结构对比分析[Ｊ].生物工程学报ꎬ２０１７ꎬ３３(６):１０１８－１０２７. [１０]㊀ＺＨＥＮＧＫꎬＢＡＮＴＯＧＣꎬＢＡＹＥＲＲ.Ｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌａ￣ｔｉｏｎｏｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ[Ｊ].ＭＡｂｓꎬ２０１１ꎬ３:５６８－５７６.[１１]㊀ＫＩＬＤＥＧＡＡＲＤＨＦꎬＦＡＮＹＺꎬＳＥＮＪＷꎬｅｔａｌ..Ｇｌｙｃｏｐｒｏｆｉｌ￣ｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｄｉａａｄｄｉｔｉｖｅｓｏｎＩｇＧｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＣＨＯｃｅｌｌｓｉｎｆｅｄ￣ｂａｔｃｈｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇｉｎ.ꎬ２０１６ꎬ１１３(２):３５９－３６６.[１２]㊀ＢＥＮＪＡＭＩＮＤꎬＮＥＨＡＭꎬＭＩＣＨＡＥＬＢ.Ａｌｏｗｒｅｄｏｘｐｏｔｅｎｔｉａｌａｆｆｅｃｔｓｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１７ꎬ２４６:７１－８０.[１３]㊀ＳＴＥＦＡＮＦꎬＪＯＥＲＧＨꎬＨＡＮＮＳ￣ＣＨＲＩＳＴＩＡＮＭ.Ｇｌｙｃａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｓｔｏｒａｇｅａｎｄａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｆｏｒｍｕ￣ｌａｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｅｕｒ.Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｂｉｏｐｈａｒｍ.ꎬ２００８ꎬ７０:４２－５０. [１４]㊀丛宇婷ꎬ胡良海.单克隆抗体药物糖基化修饰分析研究进展[Ｊ].色谱ꎬ２０１６ꎬ３４(１２):１１８６－１１９１.[１５]㊀ＭＥＬＩＳＳＡＨꎬＹＡＮＧＷꎬＲＩＣＨＡＲＤＲ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎＮＳ０ｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｌａｓｅｒ￣ｉｎｄｕｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓ￣ｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓꎬ２０１３ꎬ６:３９３－４０６. [１６]㊀ＧＥＮＮＡＲＯＬＡꎬＳＡＬＡＳ￣ＳＯＬＡＮＯＯ.Ｏｎ￣ｌｉｎｅＣＥ￣ＬＩＦ￣ＭＳｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈｅｄｉｒｅｃｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃａｎｓｆｒｏｍｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００８ꎬ８０:３８３８－３８４５.[１７]㊀李媛ꎬ邱建华ꎬ陈家琪ꎬ等.液相色谱－质谱技术对利妥昔单抗及其类似药结构表征和相似性的研究[Ｊ].国际生物制品学杂志ꎬ２０１６ꎬ３９(３):１１６－１２１.[１８]㊀ＣＨＥＮＸꎬＦＬＹＮＮＧＣ.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｓｆｒｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧｂｙｏｎ￣ｌｉｎｅｒｅｖｅｒｓｅｄ￣ｐｈａｓｅｈｉｇｈ￣ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ/ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ[Ｊ].Ａｎ￣ａｌｙｔ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.ꎬ２００７ꎬ３７０:１４７－１６１.[１９]㊀ＴＡＲＥＮＴＩＮＯＡＬꎬＧÓＭＥＺＣＭꎬＰＬＵＭＭＥＲＴＨＪ.Ｄｅｇｌｙｃｏ￣ｓｙｌａｔｉｏｎｏｆａｓｐａｒａｇｉｎｅ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃａｎｓｂｙｐｅｐｔｉｄｅ:Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ[Ｊ].Ｂｉｏ￣ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ１９８５ꎬ２４:４６６５－４６７１.[２０]㊀ＨＵＡＮＧＹＮꎬＲＯＮＯ.ＫｉｎｅｔｉｃｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｒｅｌｅａｓｅｆｒｏｍｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ(ＩｇＧ)ｂｙＰＮＧａｓｅＦ:ａｌｌｇｌｙｃａｎｓａｒｅｎｏｔｃｒｅａｔｅｄｅｑｕａｌ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｍｏｌ.Ｔｅｃｈｎ.ꎬ２０１７ꎬ２８:１５０－１５７.２２２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。

某大学生物工程学院《普通生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（140分，每题5分）1. 真核生物成熟mRNA的两端均带有游离的3′OH。

（）答案：正确解析：成熟的mRNA两端都带有游离的3′OH，防止被降解。

2. 由1克粗酶制剂经纯化后得到10mg电泳纯的酶制剂，那么酶的比活较原来提高了100倍。

（）答案：错误解析：因为不知道纯化前后的比活分别是多少，因此无法计算比活的提高倍数。

3. 参与蛋白质组成的氨基酸中Trp、Tyr和Phe在紫外区有光吸收，这是紫外吸收法定量蛋白质的依据。

（）[中山大学2018研]答案：正确4. 多糖无还原性，也无旋光性。

（）答案：正确解析：多糖属于非还原糖，不存在变旋现象，无甜味。

5. 自然界中的单糖绝大多数为D型糖，由于果糖是左旋的，因此它属于L型糖。

（）[厦门大学2014研]答案：错误解析：旋光性与DL构型并无关系，DL构型是根据甘油醛的构型判断的。

6. 转录过程中RNA聚合酶需要引物。

（）[中国科学院大学2013研]答案：错误解析：RNA聚合酶主要以双链DNA为模板，以4种核苷三磷酸作为活性前体，并以Mg2＋Mn2＋为辅助因子，催化RNA链的起始、延伸和终止，它不需要任何引物，催化生成的产物是与DNA模板链相互补的RNA。

7. 雄性激素在机体内可变为雌性激素。

（）答案：正确8. 磷酸吡哆醛只作为转氨酶的辅酶。

（）答案：错误解析：磷酸吡哆醛可作为转氨酶，氨基酸脱羧酶和δ氨基γ酮戊酸合成酶（ALA合酶）的辅酶分别参与转氨基作用，脱羧基作用和血红素合成反应。

9. 人体内色氨酸可以通过两步反应转化为5羟色胺。

（）[浙江大学2018研]答案：正确解析：色氨酸经色氨酸羟化酶催化首先生成5羟色氨酸，再经5羟色氨酸脱羧酶催化成5羟色胺。

钱洗谦，乔乐克，张洪锋，等. 海洋细菌Sphingomonas sp. Q2产琼胶酶发酵条件优化、酶学性质及降解产物研究[J]. 食品工业科技，2023，44（18）：139−146. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022090058QIAN Xiqian, QIAO Leke, ZHANG Hongfeng, et al. Optimization of Fermentation Conditions, Enzymatic Properties and Degradation Products of Agarase Produced by Marine Bacterium Sphingomonas sp. Q2[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(18):139−146. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022090058· 生物工程 ·海洋细菌Sphingomonas sp. Q2产琼胶酶发酵条件优化、酶学性质及降解产物研究钱洗谦1，乔乐克2，张洪锋3，江晓路4，王　鹏1，张京良2,4, *（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003；2.青岛海洋生物医药研究院，山东青岛 266100；3.青岛海莱美生物科技有限公司，山东青岛 266400；4.中国海洋大学医药学院，山东青岛 266003）摘　要：本研究旨在对从江蓠中筛选获得的Sphingomonas sp. Q2菌株产琼胶酶能力条件进行优化并对其酶学性质及降解产物进行研究。

通过响应面法对发酵条件进行优化，采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶层析等方法对发酵所得酶液进行纯化并对纯化后的酶液进行酶学性质研究。

体外重折叠核糖核酸酶A及其荧光结构表征谭培生;罗曼;盛清;关怡新;姚善泾【期刊名称】《浙江大学学报（农业与生命科学版）》【年(卷),期】2006(032)005【摘要】核糖核酸酶A(RNase A)作为蛋白质体外重折叠研究的模型蛋白,考察了稀释复性过程中脲浓度、稀释倍数、氧化还原环境(GSH浓度和GSH/GSSG比例)、pH值、温度以及聚集抑制剂的添加对该酶活性回收率的影响.在变性蛋白浓度为100 μg·mL-1,复性液含有2 mol·L-1脲,GSH浓度2 mmol·L-1,GSH/GSSG比为4:1,pH8.0,并添加终浓0.1%的PEG,转速为150 r·min-1,温度37℃的条件下复性,RNase A的活力回收率可达70%以上.利用荧光分析法对RNase A复性过程的结构变化进行了表征,在此基础上对RNase A体外重折叠过程蛋白质分子的构象变化以及活性中心的形成过程进行了阐述.【总页数】6页(P483-488)【作者】谭培生;罗曼;盛清;关怡新;姚善泾【作者单位】浙江大学,化学工程与生物工程学系,浙江,杭州,310027;浙江大学,化学工程与生物工程学系,浙江,杭州,310027;浙江理工大学,生命科学学院,浙江,杭州,310018;浙江大学,化学工程与生物工程学系,浙江,杭州,310027;浙江大学,化学工程与生物工程学系,浙江,杭州,310027【正文语种】中文【中图分类】Q518.4【相关文献】1.感光受体外周蛋白结合蛋白对虫荧光素酶体外折叠的促进作用 [J], 刘成刚;朱美财;占志;王荫静;李文;刘亚宁2.用发光法测定DnaJ类分子伴侣MRJ对虫荧光素酶体外重折叠的促进作用 [J], 刘亚宁;朱美财;刘成刚;赵新华;陈涛3.椰子花粉过敏原profilin蛋白体外重折叠过程的光谱学研究 [J], 罗海梅;肖杰;邬玉兰;刘志刚;Jun Lu;徐宏4.感光受体外周蛋白结合蛋白对虫荧光素酶体外折叠的促进作用 [J], 刘成刚;朱美财;占志;王荫静;李文;刘亚宁5.B36-12 重组人可溶性Fas配基在大肠杆菌中的表达、纯化、重折叠和表征Sun KH等 [J], 龚家玮;胡又佳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。