分子生物学实验技术全攻略

2006年《分子生物学实验技术》实验内容一、RT-PCR（一）总RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。

为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。

操作步骤：1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。

2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。

3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。

4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。

5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。

6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。

7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。

8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。

注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。

3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。

（二）反转录实验安排：每人做一管。

反应体系（20μl）：按下列顺序加样反应条件：42℃ 1h注意事项：1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。

如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。

2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。

3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。

实验一 CTAB法提取植物基因组总DNA及分析一、实验目的分离纯化植物DNA是植物分子生物学和基因工程的基本技术要求，CTAB法是提取植物基因组DNA的一种新型方法，可以抽提许多其它方法难以抽提的植物材料（如含多酚较多的植物材料、干燥后的茶叶、老树根等）中的DNA，得率高，质量好，用于PCR、Southern杂交、分子标记、DNA文库构建等。

二、基本原理植物材料在液氮中研磨可以迅速破坏其细胞壁，游离出细胞器和原生质，并防止DNA降解。

采用CTAB （十六烷基三甲基溴化胺，一种非离子型去污剂）抽提液抽提（65℃）上述研磨物，在高盐条件下不但溶解细胞膜相物质，而且CTAB与核酸形成可溶性的复合物，采用离心可以将变性的蛋白质和多酚、多糖等杂质（沉淀相）去除，水相中含有核酸与CTAB的复合物及其它可溶性的杂质。

直接向水相中加入异丙醇则导致核酸的沉淀，CTAB和其它多数杂质留于异丙醇与水的混合相中，吸出核酸沉淀团经过多次乙醇漂洗和沉淀、TE溶解得到DNA粗提物。

粗提的DNA一般可用于粗略PCR等。

用于精细PCR、Southern杂交和DNA文库构建的DNA则应进一步纯化。

用RNase水解RNA，用酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提去除蛋白杂质等，经乙醇沉淀后可获得较为纯净的植物总DNA。

三、实验材料甘蓝型油菜(Brassica napus L.)幼叶。

四、主要仪器设备及耗材Eppendorf 5804R低温离心机，Hettich Universal 32R低温离心机，Eppendorf Minispin离心机，Sanyo SIM-F124制冰机，TOMY SS-325自动灭菌锅，Millipore Elix纯水系统，Eppendorf research微量移液器系列，GingTian JA2003A电子天平，Satorius PB-10 pH计，HH·S21-4-S恒温水浴锅，UVP GDS8000自动高效紫外透视成像仪，DYY-8C型双稳定时电泳仪及水平电泳槽，Gene spec I快速核酸蛋白自动分析仪，长岭BCD-239家用冰箱，TNZ-30-50液氮生物容器及液氮，微波炉，研钵，离心管（15ml、1.5ml），枪头（10、200和1000μl），两面板，枪头盒，离心管盒（1.5ml）等。

一CTAB 法微量提取植物总DNA1. CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）的作用：CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB 与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。

因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。

2. β-巯基乙醇的作用：巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚轻易去除基因组DNA。

巯基乙醇有消泡的作用。

3. EDAT（乙二胺四乙酸）的作用：是一种重要的络合剂，抑制某些金属蛋白酶的活性，防止DNA被DNase 酶解。

4. 为什么用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。

乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA 很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA 周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。

一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。

因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。

但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。

折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。

也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。

一般在室温下放置15－30分钟即可。

2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc 或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。

大学生物教案：分子生物学实验的操作指南1. 引言本指南旨在提供大学生物专业的教师和学生们关于分子生物学实验的具体操作步骤与技巧。

分子生物学是现代生命科学研究中至关重要的一部分，通过实验操作可以加深对分子级别生命现象的理解。

在这个指南中，我们将介绍几个常见的分子生物学实验，并提供详细步骤以及相关注意事项。

2. 实验1：DNA提取2.1 实验原理在本节中，我们将介绍DNA提取实验的基本原理和背景知识。

这包括了DNA 提取方法、材料准备和实验目标等内容。

2.2 实验步骤•样品准备：选择适当来源（如水果、血液等）并根据实验要求进行预处理。

•细胞破碎：使用细胞裂解缓冲液和搅拌器将样品细胞破碎。

•DNA沉淀：添加盐和酒精使DNA沉淀出来，并用无菌水洗涤。

•DNA溶解：使用缓冲液溶解沉淀的DNA。

2.3 注意事项•材料应严格按照实验要求选用，确保实验结果的可重复性。

•使用无菌操作技巧以避免外源性DNA污染。

•注意个人安全，佩戴实验室所需的防护装备。

3. 实验2：PCR扩增反应3.1 实验原理在本节中，我们将介绍PCR（聚合酶链式反应）扩增反应的原理和背景知识。

这包括了PCR技术的基本原理、引物设计和酶选择等内容。

3.2 实验步骤•反应体系准备：根据实验目标计算并配置PCR反应所需的试剂和底物。

•DNA模板制备：提取样品中的DNA，并以适当浓度加入到PCR反应中。

•PCR反应设置：配置好PCR反应管，包括引物、酶和缓冲液等。

•PCR条件设定：根据要扩增的序列特点合理设定温度和时间参数。

3.3 注意事项•注意使用不同样本DNA之间相互污染的可能性，避免交叉污染。

•检查引物设计是否正确并符合预期扩增目标。

4. 实验3：凝胶电泳分析4.1 实验原理在本节中，我们将介绍凝胶电泳分析的原理和背景知识。

这包括了DNA迁移速度、凝胶类型选择和标记物设计等内容。

4.2 实验步骤•凝胶制备：根据实验需要配置适当浓度的琼脂糖凝胶。

分子生物学实验技术分子生物学实验技术专注于研究生物分子的结构、功能和相互作用。

通过分析和操作不同的生物分子，分子生物学实验技术可以为生物学研究提供有力的工具和方法。

本文将介绍分子生物学实验技术的一些常见方法和应用。

第一部分：DNA和RNA的分析与操作方法（1000字）在分子生物学研究中，DNA和RNA是最常见的研究对象之一。

了解DNA和RNA的序列、结构和相互作用对于我们理解生物基因组、遗传变异和蛋白质合成等过程至关重要。

以下是一些常见的DNA和RNA的分析与操作方法：1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种通过DNA的放大，使其达到可以检测的程度的技术。

它可以扩增DNA片段并产生大量的复制品。

PCR的优点是速度快、灵敏度高、操作简便。

这使得它在基因检测、基因组测序和遗传变异研究等领域得到广泛应用。

2. 基因克隆：基因克隆是指将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA 中，形成重组DNA分子的过程。

通过克隆，可以研究和操纵特定的DNA 序列，以确定其功能、表达和调控。

常用的克隆方法包括限制性内切酶消化和连接技术，例如使用DNA连接酶将DNA片段连接到载体上。

3. DNA测序：DNA测序是指确定DNA序列的过程。

它是研究基因组、疾病突变和基因功能的重要工具。

常见的DNA测序方法包括链终止法和碱基测序法。

链终止法使用有标记的二进制探针和DNA聚合酶，通过测量信号强度来确定DNA序列。

碱基测序法则通过测量不同碱基释放的荧光信号来确定DNA序列。

4. RNA干扰（RNAi）：RNA干扰是一种通过干扰RNA分子的转录和翻译过程来沉默特定基因表达的技术。

通过使用双链RNA或小分子RNA（siRNA）来介导干扰，可以选择性地抑制或沉默特定的基因，从而研究其功能和相互作用。

第二部分：蛋白质的分析与操作方法（1000字）蛋白质是生物体内最重要的功能分子之一。

了解蛋白质的结构、功能和相互作用对于研究生物学和疾病机制至关重要。

现代分子生物学技术及实验技巧1 自由基技术自由基技术是分子生物学中的一种技术，它能够探测分子物质中的自由基浓度以及自由基的反应，从而深入研究分子物质的性质。

自由基技术采用的是自由基信号分子，通过对其进行观察或者对其进行探测和量化，可以了解分子物质的反应过程和分子物质中自由基的浓度。

2 聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术是一种分子生物学技术，是一种能够进行DNA 复制的技术。

聚合酶链式反应技术可以迅速扩增DNA片段，因此被广泛应用于DNA检验、生物工程、基因工程等领域。

聚合酶链式反应技术的原理是，在适当的酶和DNA单链片段存在的条件下，通过反复进行变性、退火和扩增等步骤，将DNA片段快速扩增至数量足够进行检验。

3 基因编辑技术基因编辑技术是一种通过人工干预改变生物个体基因组序列的技术。

基因编辑技术主要应用于基因治疗、育种、制药等领域，能够快速地对基因组进行编辑，从而改变生物的基因表达及特性。

现如今，基因编辑已经成为研究生命科学、探求生命本质的一项重要技术手段。

4 蛋白结晶技术蛋白结晶技术是一项关键提取遗传工程、药物研发和生物晶体学所需的蛋白质结晶技术，是在分子生物学中应用广泛的一种实验技术。

它可用于发现新药物、解决蛋白质功能、交互和酶学机制等多方面的问题，从而促进分子生物学、药学、生物技术、医药化学等领域的发展。

蛋白结晶技术的发展，对于建立高清晰度的蛋白质立体结构图库至关重要，对于发现生命科学的秘密有重要的作用。

5 特异性溶解曲线PCR技术特异性溶解曲线PCR技术是一种在PCR扩增反应中，通过检测DNA 的特征溶解温度来区分目标DNA和异质DNA的技术。

该技术结合了不需要胶回的扩增、高诊断准确性和高速度等优点，极大地提高了实验效率。

特异性溶解曲线PCR技术的应用使DNA的扩增和监测更加精确、简单和操作高效，可以广泛地应用于生命科学研究、临床试验等领域。

分子生物学的实验技术【分子生物学的实验技术】分子生物学作为现代生物科学领域的重要组成部分，以其独特的实验技术为研究人员提供了许多强有力的工具。

本文将对分子生物学中常见的实验技术进行介绍，包括DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、克隆和测序等。

一、DNA提取DNA提取是分子生物学研究的第一步，也是最基本的实验技术之一。

DNA提取的目的是从生物样本中分离出DNA，并纯化得到高质量的DNA溶液，以便后续实验使用。

常用的DNA提取方法有酚/氯仿法、离心柱法和磁珠法等。

酚/氯仿法是一种传统的DNA提取方法，它利用酚和氯仿的不同密度分离DNA。

首先，将生物样本与裂解缓冲液混合并加入酚/氯仿混合液，通过离心分离出DNA在上层的细胞碎片，然后进行酚/氯仿再萃取和乙醇沉淀，最后得到纯化的DNA。

离心柱法是一种高效的DNA提取方法，它利用离心柱上的纤维素膜或硅胶膜对DNA进行捕获和纯化。

在这种方法中，生物样本与裂解缓冲液混合后，加入离心柱进行离心，DNA能够通过纤维素膜或硅胶膜的作用被固定，而其他杂质则被洗脱掉，最后用纯化缓冲液洗脱得到高质量的DNA。

磁珠法是一种快速、高通量的DNA提取方法，它利用表面修饰的磁珠对DNA进行特异性捕获。

在这种方法中，生物样本与裂解缓冲液混合后，加入磁珠混悬液，并利用磁力使磁珠与DNA结合，然后用磁力将磁珠与DNA一起沉淀到管壁上，洗脱杂质后得到纯化的DNA。

二、PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种用于体外扩增DNA的技术，通过反复的循环性温度变化，可以扩增特定的DNA片段。

PCR由于其高度敏感和高效性，被广泛应用于基因分型、基因定量、基因突变分析等领域。

PCR反应的基本组成包括DNA模板、引物、聚合酶、四种脱氧核苷酸和缓冲液。

首先，将DNA模板与引物、脱氧核苷酸和缓冲液混合，并添加聚合酶，然后进行多次温度循环，包括变性、退火和延伸等步骤，从而使DNA模板经过反复扩增，最后得到目标DNA片段的数量大幅增加。

植物分子生物学的研究对象和实验技术方法植物分子生物学是研究植物在分子水平上的生物学规律的科学领域。

通过分析植物的遗传物质、基因表达和代谢途径等，可以深入了解植物的生命过程，揭示植物与环境的互作关系，以及探索植物在抗病、抗虫和适应恶劣环境等方面的潜力。

本文将介绍植物分子生物学的研究对象以及常用的实验技术方法。

一、植物分子生物学的研究对象1. DNA（脱氧核糖核酸）DNA是组成植物遗传物质的分子，携带着植物的遗传信息。

研究DNA可以帮助人们了解植物的遗传特征、遗传变异和遗传传递机制等。

比如，通过测序整个植物基因组的DNA，可以揭示植物的基因组结构和功能注释，进而推动植物基因组学的发展。

2. RNA（核糖核酸）RNA是DNA的转录产物，不仅可以传递遗传信息，还参与植物的蛋白质合成。

研究RNA可以揭示植物的基因表达机制、基因调控网络以及非编码RNA等。

常见的RNA研究包括转录组学、函数性基因组学、小RNA研究等。

3. 蛋白质蛋白质是植物生命过程中的重要分子机器，参与植物的代谢、信号传导和细胞结构等方面。

研究蛋白质可以揭示植物的蛋白质互作网络和功能调控机制等。

常见的蛋白质研究技术包括质谱分析、蛋白质组学、蛋白质互作研究等。

4. 代谢产物代谢产物是植物基因表达和代谢途径的终产物，可以反映植物在不同生理状态下的变化。

研究代谢产物可以揭示植物的代谢途径和代谢调控等。

常见的代谢物研究包括代谢组学和药物组学等。

二、植物分子生物学的实验技术方法1. PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种基于DNA扩增原理的技术，可以在短时间内扩增特定DNA片段。

它被广泛应用于植物基因克隆、遗传多样性分析和基因表达分析等。

PCR技术具有高效、灵敏和可靠的特点。

2. 基因克隆基因克隆是指将感兴趣的基因从DNA中分离并插入到载体中，然后再将载体导入植物细胞，实现外源基因的表达。

常见的基因克隆技术包括限制性内切酶切割、DNA连接和质粒构建等。

第一部分分子生物学实验入门一、实验室规则（一）实验室安全规则1．水电使用安全规则：注意节约用水（不管是自来水还是纯净水），清洗器皿时，先用自来水洗干净后，根据实验需要再用纯净水冲洗l～3遍；随时注意水龙头是否关掉，水池是否堵塞、漏水；注意节约用电，不能随意调节空调，仪器使用前应了解是否漏电、短路，使用完后按操作程序关掉电源；最后离开实验室的同学应检查实验室的照明灯、仪器电源、水龙头是否关掉。

2．药品使用安全规则：易燃易爆药品远离火源；注意有毒或腐蚀性药品—的使用方法；绝对禁止药品、试剂间的相互污染；废弃液体入水池后用水冲掉，固体废弃物严禁入水池；有毒废弃物倒到指定地点。

3．仪器使用安全规则：实验室任何仪器不能随意操作，严格按照操作规程进行；仪器在使用过程中出现故障要报告，不能自行处理；使用完仪器后要清洁仪器和台面并记录仪器使用情况。

（二）实验室卫生规则1．维护实验室的清洁卫生：不能随地吐痰，乱扔废纸屑等物品。

每小组实验完后清洗器皿和清理台面。

2．严格执行卫生值日制：实验完后实验室的清洁卫生由值日小组按照布置严格执行，不能无故不做。

（三）学生守则1．每位同学都应衣冠整齐，自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不得无故迟到早退，保持室内安静。

2．注意实验室环境、仪器和实验桌面的整洁，每次实验完成后该清洗的器皿清洗完后按原位放好，经老师检查后方可离开。

3．每次开始做实验前，应预习好实验指导，要充分了解实验原理、方法及仪器设备的使用方法，原则上按照实验指导的方法进行，如经预习，查资料后，有更好的实验方法，可与老师讨论后进行，鼓励创新。

4．使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约，应特别注意保持药品和试剂的纯净，严防混杂。

5．注意安全。

易燃易爆物远离火源，注意有毒或腐蚀药品的使用方法，玻璃器皿的使用、洗涤，尽可能减少损坏、割伤手。

行走时不要碰撞他物。

废弃液体倒入水槽并用水冲走，固体废弃物严禁入水槽，应丢入垃圾桶中。

分子生物学实验技术与操作规范分子生物学实验技术与操作规范是在分子生物学实验中必须遵循的一系列准则和步骤。

这些规范旨在确保实验的准确性、可重复性和安全性。

本文将介绍分子生物学实验中常用的技术和操作规范。

一、引物设计与合成引物是在PCR反应中用于扩增目标DNA片段的短寡核苷酸序列。

引物的设计应遵循以下原则：引物长度应在18-25个碱基对之间，GC含量应在40-60%之间，避免引物间的互补性和自身互补性。

合成引物时应选择可靠的供应商，并进行质量检测。

二、核酸提取核酸提取是从生物样本中提取目标DNA或RNA的过程。

常用的核酸提取方法包括酚-氯仿法、盐析法和商用试剂盒法。

在进行核酸提取前，必须严格遵守实验室的安全操作规范，佩戴手套和口罩，避免污染。

三、PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA片段的技术。

在进行PCR反应时，应注意以下几点：准备反应液时要避免污染，使用无菌的试剂和器具；设置阳性对照和阴性对照以验证实验结果的准确性；选择合适的PCR条件，包括温度和时间参数。

四、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的分离和检测DNA或RNA片段的方法。

在进行凝胶电泳前，应先准备好琼脂糖凝胶和电泳缓冲液。

电泳时要注意以下几点：将样品加入凝胶孔中时要避免气泡的产生；设置适当的电压和电泳时间以获得清晰的电泳带；使用DNA分子量标记物来确定目标片段的大小。

五、蛋白质表达与纯化蛋白质表达与纯化是研究蛋白质功能和结构的重要步骤。

在进行蛋白质表达时，应选择合适的宿主细胞和表达载体，并进行优化实验条件。

在蛋白质纯化过程中，常用的方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。

在进行蛋白质表达与纯化实验时，应注意操作的无菌性和安全性。

六、基因克隆基因克隆是将目标基因插入到载体中的过程。

常用的基因克隆方法包括限制性内切酶切割、连接反应和转化。

在进行基因克隆实验时，应注意以下几点：选择适当的限制性内切酶和连接酶，并进行酶切和连接的优化实验；使用无菌的试剂和器具，避免污染；进行正反向测序以验证插入的正确性。