博莱霉素诱导大鼠肺纤维化过程中羟脯氨酸及氧化应激指标

博莱霉素诱导大鼠肺纤维化过程中羟脯氨酸及氧化应激指标
【摘要】目的:观察博莱霉素诱导的肺纤维化模型中组织羟脯氨酸(Hyp)及各氧化应激指标的变化,探讨氧化抗氧化失衡在该病发生发展中的作用. 方法:二级SD大鼠40只,随机分为模型组与对照组,每组20只. 气管内注入博莱霉素A5(BLMA5)溶液,建立肺纤维化模型. 分别于3,7,14和28 d每组随机抽出5只,处死后取肺脏行HE, Masson染色鉴定模型并测定Hyp含量. 同时分别以八木国夫荧光法测定肺组织脂质过氧化产物(MDA);改良盐酸羟胺法测定组织总超氧化物歧化酶(SOD)的酶活力;改良荧光法测定还原型谷胱甘肽(GSH)含量;荧光法测定氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量. 并计算GSH/GSSG值. 结果:成功建立博莱霉素诱导的肺纤维化模型. 各指标在不同时间点出现变化. 模型组Hyp含量于7 d
时高于对照组,28 d达到最高(P<). 模型组MDA含量随时间延长而增加,其中14 d 时显着高于对照组(P<),但在28 d时有下降. SOD活力在7 d, 14 d均降低,28 d 时上升. 模型组GSH/GSSG在3 d, 7 d显着低于对照组(P<),14 d, 28 d又回升. 结论:Hyp可作为博莱霉素诱导的肺纤维化的一个指标. 博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化伴有氧化损伤,且在不同阶段细胞内、外的氧化抗氧化出现失衡.
【关键词】肺纤维化;羟脯氨酸;氧化应激
0引言
肺纤维化是一组由多种病因所引起的肺破坏性疾病,目前的治疗方法尚不能改善其不良的预后,加强对肺纤维化机制的研究,并在此基础上发展新的治疗策略已成为更加迫切的现实需要. 一般认为,在肺部,损伤组织及激发纤维化的主要病理机制在于炎症和免疫反应,但是大量研究表明,氧自由基在炎症和免疫介导的组织损伤中扮演了重要角色. 故本研究通过建立博莱霉素诱导的肺纤维化模型,观察各氧化指标在此过程中的变化,从自由基理论的角度,深入探讨氧化抗氧化失衡在该病发生发展中的重要作用.
1材料和方法
材料
博莱霉素A5,天津太河制药有限公司产品(批号:030305),8 mg/支. 丙二醛(MDA)标准品(Merk公司);2Thiobarbituric acid(Merk公司);磷钨酸(中国医药集团上海化学试剂公司);盐酸羟胺(AR, 天津化学试剂一厂);氯化硝基四氮唑蓝,NBT,NEMI(华美公司);Triton X100(上海试剂一厂); 7210分光光度计(上海分析仪器厂虹桥分厂);970CRT荧光分光光度计(上海分析仪器总厂);GL20A全
自动高速冷冻离心机(湖南仪器仪表离心机厂).
二级SD大鼠40只,雄性,体质量180~240 g,由第四军医大学实验动物
中心提供. 随机分为模型组与对照组,每组20只.
方法
制备模型以10 g/L戊巴比妥钠(10 mg/kg, ip)麻醉大鼠,取仰卧固定位,常规消毒,行颈部正中切口,钝型分离暴露气管,于气管软骨环间隙穿刺注入BLMA5生理盐水溶液~ mL(5 mg/kg),立即将动物直立并行旋转,缝合皮肤,待动物自然清醒后置笼内常规饲养. 对照组(假手术组)以等容量生理盐水(NS)注入气
管代之.
模型鉴定分别于气管内滴药后第3,7,14和28日处理. 每批每组随机抽出5只,麻醉处死. ①剖开胸腔及颈部,分离气管和肺脏,结扎后取出肺脏,洗去血渍,去除结缔组织,吸干水分;②从气管插管至左主支气管,结扎固定. 分离结扎
右主支气管后离断,取右上叶置体积分数为40 g/L甲醛中固定1 wk,行HE和Masson染色.
肺脏羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)含量测定参考杨陟华等的方法,
将肺组织样品剪碎,置于磨口试管中,用6 mol/L HCl (W∶V=1∶4)水解(125℃) 3 h后,稀释至10 mL,过滤. 取滤液 mL(空白管和标准管分别用蒸馏水和标准Hyp
代替)加蒸馏水到 mL,充分氧化,加入 mL柠檬酸缓冲液( mol/L,pH )和 mL氯胺
T溶液( mol/L)后6 min,用过氯酸( mol/L, mL)终止反应(静置5 min). 加入100 g/L PDMAB mL,于80℃水浴中保温10 min,显色完全后,自来水(25℃)冷却5 min. 最后用7210分光光度计在560 nm波长比色,测量其吸光度A值,用下式计算Hyp 含量:肺组织Hyp含量(mg/g)=(×A样/A标)/m. 其中,A样为样品管吸光度,A标为标准管吸光度,m为肺重.
氧化损伤指标的测定剪取左肺,称质量,按1∶5加入生理盐水制备匀浆. 3000 r/min离心10 min,取上清,冻存备用. 分别以八木国夫荧光法测定肺组织脂质过氧化产物(MDA);改良盐酸羟胺法测定组织总SOD的酶活力;改良荧光法测定还原型谷胱甘肽(GSH);荧光法测定氧化型谷胱甘肽(GSSG). 并计算GSH/GSSG 值.
统计学处理:数据均以x±s表示. 采用SPSS 统计软件包进行分析,采
用成组t检验,方差不齐时用t′检验. P<为有显着性差异.A: Control groupHE ×100; B: BLM groupHE ×100; C: Control groupMasson×100; D: BLM groupMasson ×100.
2结果
大体形态观察对照组双肺呈粉红色,表面光滑,弹性良好. 模型组3 d
未见有明显改变,而7 d见双肺有点状出血、灶状瘀斑. 14 d双肺色泽暗淡,局部见大小不等结节样改变,仍有陈旧出血点. 28 d双肺呈灰白色,硬度增加,体积缩小. 表面有条索样凹沟.
光镜观察对照组各观察点均未出现明显病变. 模型组3 d时出现炎性细胞浸润等急性肺泡炎改变;7 d时肺泡间隔增厚,大量炎性细胞浸润,成纤维细胞开始增多;14 d时肺泡炎仍较重,纤维组织进一步增加;28 d炎症较前减轻,肺纤维化程度加重,部分肺泡腔消失,为大量胶原纤维、成纤维细胞、淋巴细胞所占据(Fig 1).
肺脏Hyp含量(Fig 2)模型组Hyp含量于7 d时高于对照组,28 d达到最高(P<).
肺组织匀浆MDA含量、SOD活力、GSH/GSSG比值变化(Tab 1~3)各指标在不同时间点出现变化. 模型组MDA含量随时间延长而增加,其中14 d时显着高于对照组(P<),但在28 d时有下降. SOD活力在7 d和14 d均降低,28 d时上升. 模型组GSH/GSSG在3 d和7 d显着低于对照组(P<),14 d和28 d又回升.表1两组大鼠肺组织匀浆MDA含量变化(略)表2两组大鼠肺组织匀浆SOD活力变化(略)表3两组大鼠肺组织匀浆GSH/GSSG比值变化(略)
3讨论
活性氧(ROS, Reactive oxygen species) 如超氧阴离子及过氧化氢是多种疾病的重要介质,包括肺纤维化. 在正常的生理条件下,自由基引发的组织损伤可被内源性抗氧化物质所抑制. 然而,当这些抗氧化物不足以对抗大量的氧化物即氧化抗氧化系统失衡时,组织就会发生不可逆性损伤. 博莱霉素与铁离子反应可以产生ROS从而损伤蛋白、脂质和DNA,其诱导的肺纤维化包括两个阶段. 早期的炎症阶段,大量的炎性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞浸润到间质或肺泡中. 在随后发生的纤维化阶段,炎症细胞转移到肺部后,因被激活释放过量的氧自由基,除直接引起肺组织的脂质过氧化,启动PF前的炎症反应,尚可能通过激活核因子κB(NFκB)上调细胞因子的产量,间接促进纤维化的形成;同时,肺纤维化的动物模型或患者中抗自由基的保护系统功能也有所降低. 据此,提出抑制自由基的产生,清除已产生的自由基及加强抗自由基系统的策略.
本实验应用博莱霉素复制大鼠肺纤维化模型,观察发现7 d时肺泡炎明显,28 d形成纤维化,且模型组28 d时羟脯氨酸含量显着高于对照组(P<). 主要病变与指标都与文献一致,说明动物模型复制成功. Hyp是机体胶原蛋白的主要成分之一,约占其氨基酸总量的13%,其他除弹性蛋白含有少量Hyp(约1%)外,均不含Hyp. 因此组织中Hyp含量可作为其胶原组织代谢的重要指标[11]. 本研究还发现作为体内脂质过氧化指标的MDA 14 d时与对照相比较显着增高(P<),而
GSH/GSSG比值在3 d和7 d时有显着降低,其他时间组未见明显变化. 对照组、模型组总SOD活力在7 d和14 d时都有所降低. 以上结果提示,肺组织氧化与抗氧化指标在不同时间点出现不同的变化,作为细胞内最丰富的抗氧化剂,GSH在
细胞清除ROS过程中发挥关键作用,尤其在肺纤维化早期炎症阶段大量耗竭;MDA 含量和SOD活力在纤维化阶段有所变化,推测在成纤维细胞过度增殖并分泌大量胶原的过程中,SOD可能发挥一定抑制作用. 而据文献报道,胞外SOD是肺组织的主要抗氧化剂,它分布于细胞表面及胞外基质中,对于保护肺泡细胞及抑制基质的过度重建有重要作用[11]. 因此,研究如何调控细胞基质细胞间氧化/抗氧化系统的平衡等肺纤维化的发生机制,为防治肺纤维化的发生、发展提供新的思路.。