分子生物学实验报告：大肠杆菌基因组DNA的提取
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大肠杆菌基因组DNA的提取
生技基地
实验目的与要求
以大肠杆菌培养物为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。
实验原理
基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
常规实验中从细菌基因组上PCR扩增目的基因时，一般所用的DNA量较少，可以采用较简单的沸水浴裂解法制备少量的DNA。在短时间的热脉冲下，细胞膜表面会出现一些孔洞，此时就会有少量的染色体DNA从中渗透出来，然后离心去除菌体碎片，上清中所含的基因组DNA即可用于PCR模板。而对于大量的基因组DNA制备（如Southern Blotting，需大量基因组），可采用试剂盒抽提。
DNA测序常见问题分析及解决办法总结
PCR类型测序模板注意事项
PCR类型测序模板注意事项
• 总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。3ul样品总量不低于50ng(非常小的PCR产物可以酌情减小)，PCR产物产量过低说明PCR扩增结果不是很理想，应改进条件重新扩增。
• 对于有杂带和扩增弥散的PCR产物，需经琼脂糖电泳将目的片段切下来并回收，建议将PCR产物作克隆后进行测序。有杂带的和扩增弥散的PCR产物即使通过琼脂糖电泳纯化，测序仍有可能出现双峰等异常结果。
• 经上述检测合格的PCR产物，需经过琼脂糖电泳纯化去除未反应的引物，dNTP，引物二聚体等影响测序反应的组分。有多种纯化方法可供选择，Promega，Qiagen和生工等公司都有相应的产品可供选择。纯化后的PCR产物经电泳检测估计总量应不低于200ng/Kb(非常小的PCR产物可以酌情减小)。
• 与质粒模板相比，PCR产物彼此间差异很大，因此，每个PCR模板应尽可能提供相应的PCR退火温度和PCR产物的长度，以供测序时参考。
• PCR模板一般不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后进行测序。
• 纯化好的PCR产物应溶于双蒸水中，TE缓冲液会严重影响测序反应。
• 若让公司对PCR产物进行纯化，PCR产物需满足∶总量不低于1ug/kb，片段长度不低于200bp
• 各种PCR测序模板均应提供相应的测序引物，并尽可能提供引物的全序列，并将引物浓度准确稀释到5pmole/ul 。
引物浓度的换算关系∶
总ng数 = pmole x 分子量/1000
由于PCR产物测序相对较难，为使您能拿到一个好的结果，请尽量满足上述要求。
DNA测序常见问题分析及解决办法总结
常见问题 具体情况 可能的原因 处理办法 备注
样品准备问题 菌培养不好或失败 抗性不对或菌已死 核对抗性，尽可能提供载体信息。
植物基因组DNA的提取及分析
一、植物基因组DNA提取的步骤：
1.样本的准备：从植物中选择健康和新鲜的组织样本，如叶片、茎、根等。样本选择要避免含有大量的绒毛、叶色不正常等因素的部位。
2.细胞破碎：将样本放入液氮中迅速冷冻，然后用研钵和研钉对样本进行研磨，直至样本完全破碎。
3.细胞裂解：将研磨的样本加入裂解缓冲液，边振荡边研磨使样本均匀混合。
4.蛋白质去除：使用酚/氯仿提取法去除蛋白质。加入等体积的酚/氯仿/异丙醇混合液，轻轻混合，然后离心离心管以分离上清和下层。
5.DNA沉淀：将上清转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇进行DNA沉淀。静置一段时间后，离心离心管以沉淀DNA。
6.DNA洗涤：将DNA沉淀物用70%乙醇洗涤一至两次，去除残留的盐和其他杂质。
7.DNA溶解：用适量的稳定缓冲液溶解DNA，使其达到一定浓度并避免降解。
二、植物基因组DNA分析的方法：
1.PCR扩增：PCR技术可以通过放大DNA片段来研究特定基因或DNA序列。首先选择适当的引物，然后将DNA样本与引物、核酸酶、dNTPs等反应液混合，进行多次循环的变温扩增反应。 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳：将PCR扩增的产物与DNA分子量标记物置于聚丙烯酰胺凝胶中，然后进行电泳。电泳结束后，通过紫外线照射或染色剂染色，观察电泳图谱，可以得到DNA片段的大小和数量。
3.酶切电泳：使用限制性内切酶切割DNA片段，然后将切割后的DNA片段进行电泳分析。根据DNA片段的大小和相对迁移速度，可以进行DNA的分析和比较。
4.南方杂交：将DNA样本与标记了放射性同位素或荧光染料的DNA探针进行杂交反应。通过探针与目标DNA片段的互补配对，可以检测目标DNA的存在和数量。
5.DNA测序：通过测序技术获得DNA序列信息，可以揭示基因组的结构和功能。
通过以上方法，我们可以提取和分析植物基因组DNA，更好地了解植物基因组的组成和功能，为植物的遗传改良和研究提供重要的信息。
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DNA提取中DNA浓度过低的原因及解决方法
