凝点测定法 中国药品检验标准操作规范 2010年版

文件内容：1、主题内容和适用范围 (2)2、引用标准 (2)3、简介 (2)4、仪器 (3)5、紫外可见分光光度计的检定 (3)6、样品测定方法 (5)7、注意事项 (6)8、结果判断 (8)9、吸收系数测定法 (8)10、更改信息 (9)颁发部门：质量管理部。

分发清单：QC办公室、中药室、化学室、稳定性考察室。

1 主题内容和适用范围本程序规定了紫外-可见分光光度法的测定方法和影响因素，使其规范化、标准化，并描述了更改信息。

本程序适用于药品紫外-可见分光光度法的测定。

2 引用标准中国药典2010年版一部附录Ⅴ A和二部附录Ⅳ“紫外-可见分光光度法”、中国药品检验标准操作规范2010年版P54“紫外-可见分光光度法”。

3 简介紫外光-可见分光光度法是通过被测物质在紫外光区或可见光区的特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。

本法在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。

定量分析通常选择物质的最大吸收波长处测出吸收度，然后用对照品或吸收系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定；对已知物质定性可用吸收峰波长或吸光度比值作为鉴别方法；若该物质本身在紫外光区无吸收，而其杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或杂质的吸收峰处该物质无吸收，则可用本法作杂质检查。

物质对紫外辐射的吸收是由于分子中原子的外层电子跃迁所产生，因此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱又称电子光谱。

有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环等发色基团，均可在紫外区(200～400nm)或可见光区(400～850nm)产生吸收。

通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长范围为190～900nm，紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。

朗伯—比尔(Lambert-Beer)定律为光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量分析的依据，其数学表达式为： A=log（1/T）=Ecl式中：A为吸光度；T为透光率；E为吸收系数；c为溶液浓度；l为光路长度。

原子吸收分光光度法（缩写为AA或AAS）
原子吸收法与紫外可见分光光度法在基本原理上是相同的 ——都是基于物质对紫外可见光的吸收而建立的方法。但 是，它们的吸光物质的状态不同；原子吸收法是基于基态 原子对光的吸收现象，而紫外可见分光光度法则是基于溶 液中的分子或离子对光的吸收，这是这两种分析方法的根 本区别。
重量分析 本法测得结果的精密度好、准确度高，但操作较繁，耗时 较长，仅在不能应用容量分析法进行化学原料药的含量测 定时，方可考虑选用。
容量分析
容量（滴定）分析是化学分析中的一类重要的分析方法。 此类分析方法是将一种已知浓度的液体即滴定溶液用滴定 管（手动或自动）加到被测物质的溶液中，直到所加滴定 液和被测组分按化学计量反应完全为止。
吸收系数法
按各品种项下的方法配置供试品溶液，在规定的波长处测 定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含 量。用本法测定时，吸收系数宜在100以上，并注意仪器 的校正和检定。 凡制剂的含量测定采用吸收系数计算的分光光度法，应在 原料药的性状项下增订”吸收系数”。
比色法 供试品本身在紫外-可见区没有强吸收，或在紫 外区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当 的显色剂显色后测定，这种方法称之比色法。 该法的显色时影响显色深浅的因素较多，应取供试品与对 照品或标准品同时测定，并同时作空白试验校正。 比色法所用的空白，系指用同体积的溶剂代替对照品或供 试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法 处理。
红外分光光度法（IR法）
红外光谱是分子的振动-转动光谱，特振性强，用于鉴别 组分单一、结构明确的原料药，是一种较为合适的方法， 尤其适用于其他方法不易区分的同类药物，如磺胺类、甾 体激素类和半合成抗生素类药品等。 样品的制备：气体、液体和固体样品均可利用红外分光光 度法进行分析，测定时应根据样品情况选择相应的制备方 法。

红外分光光度法1 简述化合物受红外辐射照射后，使分子的振动和转动运动由较低能级向较高能级跃迁，从而导致对特定频率红外辐射的选择性吸收，形成特征性很强的红外吸收光谱，红外光谱又称振-转光谱。

红外光谱是鉴别物质和分析物质化学结构的有效手段，已被广泛应用于物质的定性鉴别、物相分析和定量测定，并用于研究分子间和分子内部的相互作用。

习惯上，往往把红外区分为3个区域，即近红外区（12800~4000cm-1,0.78~2.5μm），中红外区（4000~400cm-1,2.5~25μm）和远红外区（400~10cm-1,25~1000μm）。

其中中红外区是药物分析中最常用的区域。

红外吸收与物质浓度的关系在一定范围内服从于朗伯-比尔定律，因而它也是红外分光光度法定量的基础。

红外分光光度计分为色散型和傅里叶变换型两种。

前者主要由光源、单色器（通常为光栅）、样品室、检测器、记录仪、控制和数据处理系统组成。

以光栅为色散元件的红外分光光度计，波数为线性刻度，以棱镜为色散元件的仪器，以波长为线性刻度。

波数与波长的换算关系如下：波数(cm-1)=104波长(μm)傅里叶变换型红外光谱仪（简称FT-IR）则由光学台（包括光源、干涉仪、样品室和检测器）、记录装置和数据处理系统组成，由干涉图变为红外光谱需经快速傅里叶变换。

该型仪器现已成为最常用的仪器。

2 红外分光光度计的检定所用仪器应按现行国家质量与核查技术监督局“色散型红外分光光度计检定规程”、“傅里叶变换红外光谱仪检定规程”和《中国药典》附录规定，并参考仪器说明书，对仪器定期进行校正检定。

2.1 波数准确度2.1.1 波数准确度的允差范围傅里叶变换红外光谱仪在3000cm-1附近的波数误差应不大于±5cm-1，在1000cm-1附近的波数误差应不大于±1cm-1。

2.1.2 波数准确度检定方法2.1.2.1 以聚苯乙烯膜校正按仪器使用说明书要求设置参数，以常用的扫描速度记录厚度为50μm的聚苯乙烯膜红外光谱图。

抗生素微生物检定法1 简述生素微生物检定法系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。

依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。

后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。

《中国药典》也采用这两种方法。

抗生素微生物检定管碟测定法系琼脂扩散法，是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。

此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。

抗生素微生物比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验菌的液体培养基内，混匀后，经培养，测量培养基的浊度。

此法系根据抗生素在一定的浓度范围内，其浓度或浓度的数学转换值与试验菌生长产生的浊度（浊度与细菌数量、细菌群体质量及细菌细胞容积的增加之间存在直接关系）之间存在线性关系而设计，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准晶与供试品对试验菌生长抑制的程度，计算出供试品的效价。

抗生素效价以“单位（U）”或“微克（μg）”表示。

抗生素管碟测定法2 仪器与用具2.1 操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。

半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为100~10000级）及空调设备，控制室温在20~25℃之间，达到无菌或半无菌状态。

操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。

注意操作，避免室内抗生素污染。

2.2 双碟内径约90mm，高16~17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。

碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一张白纸，碟内加水2~3ml，再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。

用过的双碟经高压灭菌倒出培养基后，置清洗液中浸泡过夜，冲洗，沥干，置150~160℃干热灭菌2h或高压121℃蒸气灭菌30min，备用。