黑龙江茴鱼_Thymallusarctic_省略_rubeiDybowski_精
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第21卷第1期2008年5月水产学杂志CH I N ESE JOURNAL OF F I S HER I ESVol.21,No.1May.2008文章编号:1005-3832(2008)01-0009-06黑龙江茴鱼(Thy m a llus a rcticus grubeiD ybowsk i)精子活力的观察韩英1,张澜澜1,徐革峰2,牟振波2,赵吉伟2(1.东北农业大学动物科学技术学院,黑龙江哈尔滨150030;2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,黑龙江哈尔滨150070)摘要:用BSS和水两种激活剂对黑龙江茴鱼精子活力进行测定,并在4℃和14℃(室温)条件下,对精原液和用ASP稀释的精液分别进行保存试验。
试验结果显示,用BSS和水均可激活黑龙江茴鱼精子,其精子活率分别可达100%和98%。
14℃条件下,用BSS激活黑龙江茴鱼精子平均寿命为72.1s,A级(快速)运动时间平均为14.1s;用水激活精子平均寿命为67.2s,A级运动时间平均为12.5s。
不同温度保存的精子寿命和快速运动时间也有显著差异:精原液4℃保存2h后精子失去A级运动,其激活率在70%以上,保存6h后激活率小于20%;精原液14℃保存1.5h后精子失去A级运动,其激活率大于70%,4h后激活率小于20%。
经ASP(pH分别为7.0、7.8、8.0、8.5、9.0)稀释的精液,在4℃和14℃条件下,BSS和water对精子的激活率均小于20%,且精子均呈现C、D级运动,1.5h后各保存组激活率为0。
试验结果表明,BSS对黑龙江茴鱼的精子有良好的激活效果;精原液4℃保存效果好于14℃,在4℃保存条件下2h以内使用,可以得到理想的结果;精液不宜用ASP稀释保存。
关键词:黑龙江茴鱼;精子活力;激活剂;保存中图分类号:Q418 文献标识码:A精子活力泛指精子群体的运动状况,包括精子的激活与抑制、运动精子占精子总数的比例(激活率)、精子运动激烈程度及运动时间等,反映了精子的质量。
近年来国内外学者针对冷水性鲑科鱼类精子的新陈代谢、渗透压、受精动力学和细胞兴奋性等开展了广泛研究[1、2]。
黑龙江茴鱼Thym allus arcticus grubei D ybo w ski属鲑形目、茴鱼科、茴鱼属,俗名斑鳟子,在我国自然分布于黑龙江流域的支流和溪流中,为黑龙江水系特有的名贵冷水性鱼类[3]。
黑龙江茴鱼的人工繁殖刚刚起步,其繁殖生物学研究尚属空白,有关其精子活力的研究未见报道,因此开展黑龙江茴鱼精子活力与保存方法的研究对其人工繁殖具有重要的指导意义。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验用鱼 试验所用黑龙江茴鱼为2006年秋季在牡丹江支流海浪河捕获,饲收稿日期:2008-03-03养于黑龙江水产研究所渤海冷水性鱼类试验站。
2007年4月,选择体质健壮、体表无伤、成熟良好的雄性亲鱼15尾,年龄为2~4龄(多为3龄),其平均体重为165.1(132.1~185.4)g,平均体长为25.3(22.8~27.3)c m 。
1.1.2 药品的配制 BSS (Balanced salt s oluti on,即生理盐水缓冲液)与ASP (A rtificial se m inal p las ma,即人工精浆)按照Toru 的方法配制[4]。
BSS:将NaCl 7.50g 、KCl 0.20g 、CaCl 2・2H 2O 0.20g 和NaHCO 30.02g,溶解于1000mL 蒸馏水中,pH 7.1;ASP:将NaCl 7.60g 、KCl 2.98g 、CaCl2・2H 2O0.37g 、MgCl 2・6H 2O 0.31g 和NaHCO 30.21g,溶解于1000mL 蒸馏水中。
用1%Na OH 溶液和1%HCl 将pH 分别调整为9.0、8.5、8.0、7.8、7.0。
1.1.3 试验器材 Motic (B5Prafessi onal Series )显微镜、一次性试管、细玻璃棒、微量移液器、载玻片等。
1.2 试验方法选择5尾体质健壮、成熟良好的雄性亲鱼,采用挤腹法采集精液。
将其精液混合后分成2份,分别用于精子活力检测与保存试验。
1.2.1 精子活力检测 14℃(室温)下,吸取50μL 水和50μL BSS 激活剂,分别滴于载玻片上,随即用纤细玻璃棒蘸取少量(<5μl )精液与激活剂调匀,同时按下秒表,在10×10镜下观察记录。
作10组重复试验。
精子群体运动状况按以下指标进行评价:精子激活率(%):已激活的活动精子占检测精子总数的百分比。
精子运动状态分级:参照周定刚的方法[5],将精子按运动状态分为4级。
A 级为呈快速直线前向运动的精子;B 级为呈慢速或非直线前向运动的精子;C 级为原地颤动或旋转的非前向运动的精子;D 级为无活力的不动精子。
精子寿命(精子运动时间):精子激活开始至停止运动所经历的时间。
1.2.2 精液保存 精原液保存:将精原液分别置于4℃和14℃(室温)保存。
ASP 溶液稀释保存:将精液分别用pH 值7.0、7.8(精原液pH 值)、8.0、8.5和9.0的ASP 溶液稀释50倍,分别置于4℃和14℃保存。
每0.5h 镜检观察,用BSS 激活,记录精子活力情况,至群体存活数量为20%结束试验。
每1处理设3重复。
2 结果2.1 精子活力室温(14℃)条件下,用BSS 激活,黑龙江茴鱼精子的平均寿命为72.1(68.1~76.4)s,A 级运动时间为14.1s;用水激活,其精子的平均寿命为67.2(60.5~69.8)s,A 级运动时间为12.5s 。
BSS 激活效果好于水激活,二者差异显著(p <0.05)(表1、图1)。
・01・水 产 学 杂 志 第21卷表1 不同激活剂下黑龙江茴鱼精子的活力Tab 1 Sper mat ozoon vital i m pulse of Amur grayling under different activat or激活方式激活比率(%)最小存活时间(S )最大存活时间(S )平均精子寿命(S )A 级运动时间(S )BSS10068.176.472.1a ±2.214.1a±0.7water >9860.569.867.2b ±2.812.5b ±0.8 注:表中肩标字母不同表示差异显著(p <0.05)图1 不同激活方式下黑龙江茴鱼精子活力级数与运动时间Fig 1 The s per m motility and move ment ti m e of Amur grayling under different activat or2.2 精子保存4℃保存条件下,精原液中的精子2h 后失去A 级运动,其激活率高于70%,6h 后激活率小于20%;14℃保存条件下,精原液中的精子1.5h 后失去A 级运动,其BSS 激活率大于70%,4h 后激活率小于20%(图2、图3)。
4℃和14℃条件下,保存于不同pH 值人工精浆ASP 中的精子,在1.5h 内其激活率小于20%,且精子均呈C 、D 级运动;1.5h 后各保存组激活率为0。
图2 4℃保存时间与黑龙江茴鱼精子运动时间的关系 图3 14℃保存时间与黑龙江茴鱼精子运动时间的关系 Fig 2 The relati onshi p bet w een s per mat oz oa move ment Fig 3 The ralati onshi p bet w een s per mat oz oa move ment ti m e and p reserving ti m e of Amur grayling at 4℃ ti m e and p reserving ti m e of Amur grayling at 14℃・11・1期 韩英等:黑龙江茴鱼(Thy m a llus a rcticus grubei Dybowski )精子活力的观察3 讨论鱼类精液中由于精子过稠,缺乏氧气与水分,而二氧化碳浓度过高,因此,精子在精原液中是不活动的。
低渗液和等渗液可以激活鱼类的精子[6,7]。
由于鱼类精子的能量储存极为有限,一旦被激活,能量即被迅速消耗,因而相对于体内受精的哺乳动物来说,体外受精的鱼类的精子寿命是短暂的,一般只有几十秒至几分钟,而哺乳动物可长达几个小时。
这种短暂运动与精子新陈代谢、细胞的兴奋性和渗透压调节有关。
试验结果表明,水与生理盐水缓冲液BSS 均可激活黑龙江茴鱼的精子,平均寿命分别为67.2s 和72.1s,从精子被激活后的运动能力和寿命来看,BSS 对黑龙江茴鱼精子被激活效果显著优于水,这与Lahnsteiner 等对圆鳍雅罗鱼[8]、徐革峰等对细鳞鱼[1]以及Christen 等[9]对虹鳟的精子研究结果相同。
精子在水中处于低渗环境,运动耗能只占一少部分,大部分能量消耗于渗透压的调节,因而加快了精子的死亡。
而在等渗液中,由于不需调渗耗能,精子寿命会大大延长。
环境的离子成份对鱼类精子活力也有一定影响,其中Ca 2+与Na +对精子激活的作用十分重要。
周定刚[5]研究发现,Ca 2+是调节精子鞭毛摆动的重要离子,当细胞内Ca 2+浓度升高,ATP 酶被激活,由ATP 分解产生的能量使鞭毛产生摆动。
通常细胞膜去极化可使细胞内Ca 2+浓度升高。
Na +则是维持细胞兴奋性和渗透压的主要阳离子,Na +通过诱发细胞膜去极化产生动作电位,进而引起细胞内Ca 2+浓度的变化,起到间接激活精子运动的作用。
T oru 等[4]对虹鳟的研究表明,激活剂中Ca 2+、Na +浓度较高时可延长精子活动时间。
BSS 含有一定浓度的Ca 2+和Na +,精子不会与其发生Ca 2+-Na +的大量交换,也就不会在短时间内将ATP 大量活化而导致动能全部释放,从而延长了精子的活动时间和寿命。
christen 等的研究结果显示[9],虹鳟精子激活后获得动能,快速直线运动约15s,此后即进入慢速运动阶段,与本研究结果相近。
精子质量常常是人工授精成败的关键因素。
快速泳动的精子数量越多、运动持续时间越长,受精率越高。
因此,在黑龙江茴鱼的人工繁殖中要选择质量好的亲鱼,选择适宜的激活剂(如BSS ),以保证良好的授精效果。
试验结果表明,随保存时间的延长,精子的激活率、快速运动时间和寿命均显著下降,与赵强对暗纹东方鲀精液的研究结果相似[10]。
在一定的条件下,较低的保存温度可以降低精子的代谢强度,减缓精子内在能量的衰减,从而延长精子的寿命。
因而4℃保存的精子质量要好于14℃,精原液保存在4℃保存条件下2h 以内使用可以得到理想的受精效果。