维生素B_1_B_12_在雨生红球藻不同培养阶段的作用研究

第43卷 增 刊2004年8月厦门大学学报(自然科学版)Journal of Xiamen University (Natural Science)Vol.43 Sup.Aug.2004文章编号:0438-0479(2004)S -142-05维生素B 1、B 12在雨生红球藻不同培养阶段的作用研究收稿日期:2004-05-17基金项目:厦门市科技项目(3052Z20031086),海洋与环境学院学生科研创新项目(2003)和/挑战杯0科研计划大赛厦门大学学生课外科研自强启动基金(2004)联合资助作者简介:张英(1983-),女,学士.*Corresponding autho r,E -mail:mg cai@x 张 英1,蔡明刚1,2*,齐安翔1,金贵娥1,王鑫煌1(1.厦门大学海洋与环境学院, 2.厦门大学化学与化工学院,福建厦门361005)摘要:研究了维生素B 1、B 12对雨生红球藻营养生长及胁迫阶段各生长指标的影响.研究结果表明适量维生素的加入具有促进雨生红球藻生长、提高胁迫条件下的微藻存活率、以及促进虾青素积累等作用.其中,在培养基中添加w (B 12)=5@10-8维生素B 12,可以使雨生红球藻的生长率、存活率和虾青素产量分别较空白组提高21%、264%和43%以上.此外,研究还发现在单独加入维生素B 1和B 12的培养组中,大部分培养组的孢子比率均明显下降,这为降低虾青素的提取难度和提高虾青素的利用率提供了新的思路.关键词:雨生红球藻;维生素B 1、B 12;生长;虾青素;积累中图分类号:Q 78文献标识码:A 雨生红球藻(H aematococcus p luvialis )属绿藻门,团藻目,红球藻科,是一种单细胞微藻[1].该藻在适宜条件下,以游动细胞形式存在,在不利于生存(高光照、高温、高盐和营养盐饥饿等)胁迫条件下,开始积累虾青素,并迅速转变为红色厚壁孢子[1~3].近年来研究表明,虾青素具有清除氧自由基的强大能力,其抗氧化性是类胡萝卜素的10倍、维生素E 的550倍,被誉为/超级抗氧化剂0[4,5].鉴于虾青素卓越的生理功能,在国外已被应用于食品、医药等行业及水产养殖业中[6].据报道,雨生红球藻在特定条件下可积累占干质量1%以上的虾青素,被看作是天然虾青素的/浓缩品0[2].此外,其在稳定性、氧化活性、生物利用安全性及生物效价等性能方面均显著优于人工合成产品[7].雨生红球藻已被公认为自然界中生产天然虾青素的最好生物来源,因此利用雨生红球藻提取虾青素,无疑具有广阔的发展前景,并已成近年来国际上虾青素研发的热点[8,9].目前,雨生红球藻的培养条件研究主要处于实验阶段[2].国内外有关雨生红球藻培养条件主要集中于温度、光强、自养异养等生长环境的测定,各培养基之间的比较[10~12]和C 、N 、P 等常量元素对藻生长及虾青素积累的影响[13,14].研究表明,雨生红球藻生长速度慢可能是因为亏缺某些微量物质导致的,可以通过添加微量物质来提高它的生长速度[2].国内外有关报道表明添加维生素B 1、B 12对甲藻、金藻等藻类的生长有一定的促进作用[15~17],但迄今为止其对雨生红球藻生长的作用仍有争议[18,19],本研究拟通过添加不同浓度的维生素B 1、B 12,考察它们对雨生红球藻在生长及胁迫阶段中各项指标的影响.1 材料与方法1.1 藻种及生长条件雨生红球藻藻种由中科院水生所藻种库提供.每瓶接种指数生长期培养物约20mL,接种体积比为1÷5,置光照培养箱中静置培养.控制温度为23?1.5e ,光强为1300~1500lx ,连续侧光照.每实验组设置两个平行样.于适宜条件连续培养10d 后转至高光强条件下,光照度约为10000~12000lx,诱导培养14d 后对培养物进行藻细胞存活率、孢子比率、单位体积藻粉含量和虾青素含量等指标的测定.表1 对雨生红球藻生长及胁迫阶段影响的试验中添加维生素B 的浓度T ab.1 Ex perimental scheme for testing effects of various concentrations of Vitamin B on the two culture stagesof H aematococcus plv ialis w (B)=10-6组号添加物12345K V B120.000050.00050.0050.050.5M V B10.010.1110100NV B 1/V B120.01/0.000050.1/0.00051/0.00510/0.05100/0.51.2 相关生长指标测定方法采用血球计数板进行细胞计数[20].指数生长率为单位时间内单位组织或整体的增长量,按公式K =(ln N 2-ln N 1)/(t 2-t 1)进行计算,其中:N 1和N 2分别为t 1、t 2时刻的细胞数[19].孢子比率即指孢子数在总细胞数中所占的百分比,利用细胞计数结果直接进行计算.单位体积藻粉含量取50mL 藻液离心去上清液,60e 下干燥,冷却后称至恒重计算.虾青素含量测定采用Boussiba 法在波长490nm 处测吸光值,以此数据按公式进行计算[21].具体计算公式如下:C =A 490@V @104@f /E cm t%@V 0式中:C 为虾青素浓度(mg/L);E cm t%为比消光系数,此处取2220;A 490为波长490nm 处1cm 比色皿测得吸光值;V 为原提取液体积(m L);f 为稀释因子;V 0为所取藻液体积(m L).1.3 实验设计t /d t /d t /d 图1 添加维生素B 对微藻生长影响比较F ig.1 Effect of V itamin B on cell number of the H aematococcus p luv ialis本实验以BBM 配方为基础,加入一定量的维生素B 1、B 12作为培养基,在相同培养条件下同时进行实验,为便于说明将样品分为3个组(K 、M 、N 组),其中K 、M 组分别为单独添加维生素B 12、B 1的实验组,N 组为按固定比例(V B 12÷V B 1=1÷200)同时添加维生素B 1、B 12的实验组,添加维生素B 的浓度如表1所示.为便于比较另设一个空白组,采用完全BBM 配方,不添加任何维生素.2 结果与讨论2.1 维生素B 1、B 12对雨生红球藻营养细胞阶段生长指标的影响2.1.1维生素B 12对雨生红球藻生长影响单独添加维生素B 12(表1中K 组)的研究结果表明,低浓度的维生素B 12对微藻生长促进作用较不明显,如图1a 所示,当维生素w (B 12)=5@10-10时,其生长曲线与对照组的相差不远.随着培养基中维生素B 12浓度的升高,雨生红球藻的藻密度不断增加,当维生素w (B 12)=5@10-8时,对红球藻生长的促进效果最好,培养至第7天,获得最大细胞数34.65@104cell/mL,该组指数增长率达到0.40d -1,较空白组0.33提高了21%.当维生素w (B 12)>5@10-8时,维生素B 12对微藻的促进作用则有所下降.有研究表明,藻类接种至较高浓度的营养盐中,一般其生长状况不及低浓度营养状态[22].维生素B 12作为藻类生长的微量营养元素,同样符合这样的作用规律.2.1.2维生素B 1对雨生红球藻生长影响#143#增 刊 张 英等:维生素B 1、B 12在雨生红球藻不同培养阶段的作用研究如图1b 所示,通过细胞计数,计算指数生长率可以获知,单独添加维生素B 1时,当添加w =10-6时对微藻生长有较明显的促进作用,指数增长率达到0.41d -1,其余浓度下,对微藻的生长也有一定的促进作用,但影响较小.2.1.3同时添加维生素B 1、B 12对雨生红球藻生长影响以固定比例(V B 12÷V B 1=1÷200)添加的维生素B 1、B 12对雨生红球藻生长的影响如图1c 所示,在低浓度范围内,随着浓度的增加,维生素对微藻生长的促进作用更加明显,但是当添加的维生素浓度过高时,微藻的生长明显受到抑制.当维生素w (B 12)=5@10-9,维生素w (B 1)=10-6时,促进效果最为明显.通过添加维生素B 1、B 12对雨生红球藻生长的研究表明大部分维生素添加组对雨生红球藻生长均有促进作用,单独添加w (B 12)=5@10-8维生素B 12或w =10-6维生素B 1促进效果尤为明显.2.2 维生素B 1、B 12对雨生红球藻胁迫阶段生长指标影响2.2.1维生素B 1、B 12对胁迫后藻细胞存活率影响在维生素B 1、B 12对胁迫后藻细胞存活率影响的实验中,经高光强胁迫14d 后,空白组的存活率仅为13.99%,而添加维生素各组的存活率均比空白组有所提高.其中单独添加维生素B 12的效果最为明显,且比较稳定,存活率普遍在45%以上,平均值可达52.36%,较空白组提高了82%~494%(表2). 如表2所示,M 组为单独添加维生素B 1组,存活率随维生素B 1浓度的增加而增加,但增加的幅度较小.同时添加维生素B 1、B 12的N 组的存活率基本介于K 组与M 组的中间.在M 组和N 组中,当维生素w (B 1)=10-4时,胁迫后藻细胞数目较胁迫前分别提高了21%和194%,这种异常高值与维生素B 1的高浓度之间的关系还有待于进一步研究.2.2.2维生素B 1、B 12对胁迫后孢子比率影响研究结果表明,单独添加维生素B 1或B 12,其孢子比率基本上均低于空白组(表2),使孢子比率平均值由对照组的100%分别降至76.24%和50.48%.其中,单独添加维生素B 12,孢子比率随着浓度的增加而增加,当维生素w (B 12)=5@10-9时,出现了最大值76.67%,随后随着浓度增加而减小.单独添加维生素B 1,表现出的规律却恰恰相反,除了w =10-6时孢子比率仅有27.66%,而当w >10-6或w <10-6时,孢子比率均较大.庄惠如等(2000)对雨生红球藻胁迫条件的研究中发现在培养第9天,氮饥饿和磷饥饿两种胁迫条件的孢子比率分别高达95.17%和89.13%[23].厚壁孢子使虾青素的提取难度增大,虾青素生物利用率降低.通过添加适量的维生素B 1或B 12能有效降低孢子比率,促使虾青素富集于营养细胞内,这也为解决孢子破壁率和虾青素生物利用效率低的问题提供了新的思路.2.2.3维生素B 1、B 12对藻粉产量影响表2 维生素B 1、B 12对于雨生红球藻胁迫阶段影响 T ab.2 Effect of V itamin B on H aematococcus p luvialis un -der str ess condit ion样品号存活率/%孢子比率/%藻粉含量/(g #L -1)虾青素含量mg/L mg/g 13.991000.7917.0621.69K 146.0437.970.7215.8322.11K 283.1741.090.7717.5822.7K 325.4976.670.6413.2620.59K 450.9355.380.7824.4731.41K 556.1541.270.5817.3629.73M 110.421000.7514.4119.12M 217.641000.7913.2116.77M 317.8827.660.6817.1625.16M 424.5575.010.7419.7823.02M 5120.8878.510.6810.8615.91N 141.8572.410.8619.8623.01N 219.8997.140.9819.319.77N 336.8998.820.969.9110.38N 424.241000.85 5.46 6.42N 5293.9492.270.7310.7914.83研究结果表明,同时添加维生素B 1、B 12能很好的提高藻粉产量,平均可达0.88g/L(表2),与空白组相比增幅达10.89%.当固定V B 12÷V B 1=1÷200添加比例时,藻粉产量随着维生素浓度的增加而增加,当维生素w (B 1)=10-7,w (B 12)=5@10-10时达到最高值0.98g/L,较空白组提高了24.05%,而后藻粉产量随着浓度的继续增加而降低(表2).2.2.4维生素B 1、B 12对虾青素积累影响如表2所示,单独添加维生素B 12时,单位体积虾青素含量基本随着维生素B 12浓度增加而增加,当维生素w (B 12)=5@10-8,虾青素含量高达24.47mg/L,较对照组提高了43.43%,当浓度继续增加#144#厦门大学学报(自然科学版) 2004年时,单位体积虾青素含量相对减少.单独加入维生素w(B12)=5@10-9时,单位体积虾青素含量相对偏低,这可能是高死亡率及高孢子比率所导致的.然而为何处于该浓度维生素B12环境的红球藻具有如此高的死亡率与孢子比率,有待进一步的研究.单独添加适量的维生素B1,随着浓度的增加,单位体虾青素含量也随之增加.当维生素w(B1)= 10-5时,其虾青素含量达到19.78mg/L,较对照组提高了15.94%,随后浓度继续增加,而单位体积虾青素有所减少.同时添加维生素B1、B12对虾青素积累并无明显的促进作用.如表2所示,藻粉内虾青素含量(mg/g)与单位体积虾青素含量(g/L)的变化趋势基本一致.当单独添加w(B12)=5@10-8维生素B12时效果最佳,两者均达到最大值,分别为31.41mg/g和24.47mg/ L,与Yuan和Chen(2000)报道值32.2mg/g相当[24].3结语通过开展添加维生素B1、B12对雨生红球藻生长与虾青素积累影响的研究,结果表明:1)单独添加维生素B12可促进雨生红球藻的生长,使细胞存活率较空白组提高82%~494%,孢子比率仅为空白组的37.97%~76.67%,单位体积虾青素含量和藻粉虾青素含量平均较空白组提高了3.75%和16.68%.2)添加维生素B1实验组的藻细胞存活率,孢子比率平均值分别可达38.27%和76.24%,分别为空白组的2.74倍和76.24%.3)同时添加维生素B1、B12也可有效提高藻粉产量和虾青素含量,其中藻粉产量平均可达0.88g/ L,与空白组相比增幅达10.89%.4)综合而言,在传统BBM培养基配方中单独添加w(B12)=5@10-8维生素B12的改良效果较好,可使雨生红球藻的生长率、存活率以及虾青素含量等指标较空白组分别提高21%、264%和43%.此外,胁迫后孢子比率也有明显降低.参考文献:[1]庄惠如,陈文列,卢海生,等.雨生红球藻不同形态细胞的超微结构研究[J].应用与环境生物学报,2001,7(5):428-433.[2]殷明炎,刘建国,张京浦,等.雨生红球藻和虾青素研究评述[J].海洋湖沼通报,1998,(2):53-62.[3]邱保胜,刘其芳.红球藻研究进展[J].水生生物学报,2000,24(5):546-554.[4]Nakag aw a K,K ang S,Park D,et al.Inhibition by beta-carotene and astax anthin of NADPH-dependent microso-mal phospholipid peroxidation[J].J.Nutrit Sci.Vitamin,1997,43:345.[5]Naguib Y M A.Antiox idant activ ities of astax anthin andr elated car otenoids[J].J.Ag ric Food Chem.,2000,48:1 150.[6]蔡明刚,王杉霖,李文权,等.天然虾青素在水产养殖中的研究进展[J].台湾海峡,2003,22(3):377-385. 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