《基因组文库的构建》PPT课件

三、cDNA克隆载体
Zap cDNA克隆载体来自腺病毒系统，属于 噬 菌粒（phagemid）载体。线状的 Zap cDNA克 隆载体在体内能通过噬菌粒获救(phagemid rescue) 变成环状的表达载体。
(a) 噬菌体连续感染两个不同的E.coli 菌株，在这 两个菌株中一个噬菌体不受“限制”，而另一个 受到“限制”。结果,在kanr 菌落中获救，此菌落 中含有多个拷贝的双链质粒。
巨细胞病毒第三节 cDNA的筛选间接用探针筛选噬菌体cDN相关氨基酸密码子的简 并寡核苷酸探针；
（2）纯化蛋白质的相应抗体探针； （3）针对差异表达基因的扣除
cDNA探针。
探针的特异性可通过以下的策略来解决： ①选基因的特异序列为探针； ②长度不低于17～20nt； ③控制片段但酶的选择和酶切反应条件的选择是取决于克隆载体的类型重组噬菌体细胞基因组噬菌体尼龙膜与放射性探针进行分子杂交用放射自显影定位阳性克隆阳性克隆用限制性酶剪切提取dna用限制性酶剪切用连接酶连接重组体dna细菌感库的构建
用体外包装系统将串联体中单个的基因组DNA分 别包装入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌 体颗粒。
用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每 一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。
各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
限制性
(a)
酶切位点
Alu散在元件
启动子 外显子探针1 启动子启动子
探针2
探针3
将DNA亚克隆到质粒载体中的通用策略
①根据已知的酶切图谱进行定向克隆
（directed cloning）；
②用常用的限制性酶交错剪切或平切进行
随机亚克隆。
这种策略也称为“鸟枪法（shot-gun）”，即将 完整的基因组或部分基因组的DNA用限制性酶 或机械的方法随是将小片段逐一测序，再拼接 成序列图谱。

NA分子导入宿主细胞， 让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子机挑取一些转化子或重组子，提取质 粒DNA，电泳量越高，可大大减轻后续 筛选基因工作量。
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
sa c B
K anr
p a c lo x P
D N A h ea d fu l
+
+ p a c c le a v a g e
p r o te in
C re
R e c o m b ila tio n
DNA
A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
C o s o r i A pr S
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
35-45kb DNA 片 段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S
库载
感 染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装

洗菌体碎片和 Pr
使单链DNA牢 固结合在膜上
• ⑵ 免疫结合法
• 噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA 表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢 固地结合在膜上。然后将膜放入含有特 异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗 去未结合的抗体后，再与125 I 标记的第 二抗体结合, 从而找出带有放射性示踪信 号的斑点, 进而找出对应噬菌斑, 克隆扩 增, 提取DNA后经酶切可获目的基因。
衔接头：一端为平头，一端为粘末端。
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体，以保证它们的遗传性状相同。
筛选目的基因
⑴ 核酸杂交法 特殊标记的寡核苷酸链为 探针
利
用
基
因
文
库
筛
选某一Fra bibliotek基因
片 段
An efficient technique commonly used to detect a bacterial colony carrying a particular DNA clone.
4.7 DNA与蛋白质相互作用技术
•凝胶阻滞法
•DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
DNA来 源
基因组的大 小
（bp）
被克隆的 DN95 P=0.99
大肠杆 菌 酵母 果蝇
4.639X106 1.4X107 1.8X108
1.4X104 1.4X104 1.4X104
720 2300 2300
0
940 300皿内所形成的菌落或噬 菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加 带标记的探针进行杂交，能显示特异结合 探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取， 再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目 的基因。（如图）

用小体系连接来寻找最适的比 例。 在电转化和包装侵染过程中， 在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化 效率高的感受态细胞或行脱盐处理也可以明显地提高 其效率。 其效率。 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不 对于电转化而言， 同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。 的转化效率功与否的关键，载 载体的好坏是影响连接成功与否的关键， 体的制备要求两点： 体的制备要求两点： 一是纯度高； 一是纯度高； 二是去磷酸化好。 二是去磷酸化好。
Hale Waihona Puke 2．高质量大分子量基因组 DNA的提取和 mRNA 分离； 分离； 第一， 第二，第一链 cDNA 合成； 合成； 第二， 第三，第二链 cDNA 合成； 合成； 第三， 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并 第四， 导入宿主中繁殖。 导入宿主中繁殖。
表示重组克隆平均插入片段的大小和基表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组因组dnad体噬菌体phagephage粘粒载体粘粒载体cosmidcosmid细菌人工染色体细菌人工染色体bacterialcosmidcosmid细菌人工染色体细菌人工染色体bacterialbacterialbacterial载体的选择载体的选择artificialchromosomesbacartificialchromosomesbac酵母人工染酵母人工染色体色体yacyacyeastartificialchromosomesyeastartificialchromosomesyacsyacsp1p1bacteriophagep1bacteriophagep1和DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。 cDNA cDNA）。 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内 的 mRNA 经体外反转胞内转录水平上的基因的群体， 时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包 括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上 括该生物的全部基因， 存在很大差异。 存在很大差D表明，提取的基因组 DNA 分子 实践表明， 量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。 量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。