肿瘤实验动物模型 ppt课件
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肿瘤动物模型的建立可以:
(1)评价抗肿瘤免疫治疗的疗效;
(2)作为抗肿瘤药物筛选模型;
(3)为肿瘤转移研究提供更好的研究平台;
(4)为研发抗肿瘤转移性药物提供良好的实验工具。
实验方法:诱发性肿瘤动物模型
实验方法原理:诱发性肿瘤动物模型是指研究者用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。
实验材料:肿瘤细胞小鼠
试剂、试剂盒、无血清培养基质、3%中性甲醇石腊
仪器、耗材、低温离心机、血球计数器、游标卡尺
实验步骤
一、肝癌
1.二乙基亚硝胺(DEN)诱发大白鼠肝癌
(1)取体重250 g左右的封闭群大白鼠,雌雄不拘;
(2)按性别分笼饲养。除给普通食物外,饲以致癌物,即用0.25%DEN水溶液灌胃,剂量为10 mg/kg,每周一次,其余5天用0.025%DEN水溶液放入水瓶中,任其自由饮用;
(3)共约4个月可诱发成肝癌;
(4)也可以单用0.005%掺入饮水中口吸服8个月诱发肝癌。
2.4-2甲基氨基氮苯(DBA)诱发大鼠肝癌
(1)用含0.06%DBA的饲料喂养大鼠,饲料中维生素B2不应超过1.5~2 mg/kg;
(2)4~6月就有大量的肝癌诱发成功。
3.2-乙酰氨基酸(2AAF)诱发小鼠、狗、猫、鸡、兔肝癌
(1)给成年大鼠含0.03% 2AAF标准饲料;
(2)每日每平均2~3 mg 2AAF(也可将2AAF混于油中灌喂),3~4月后有80~90%动物产生肝肿瘤。
4.二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌:
(1)用剂量为每日0.3~14 mg/kg体重,混于饲料或饮水中给予;
(2)6~9个月后255/300大鼠发生了肝癌。
5.亚胺基偶氮甲苯(OAAT)诱发小鼠肝癌
(1)用1%OAAF苯溶液(约0.1 ml含1 mg)涂在动物的两肩胛间皮肤上,隔日一次,每次2~3滴,一般涂100次。
(2)实验后7~8周即而出现第一个肝肿瘤,7个月以上可诱发小鼠肝肿瘤约55%。
(3)或用2.5 mg OAAT溶于葵瓜子油中,给C3H小鼠皮下注射4次,每日间隔10天,也可诱发成肝癌。
肿瘤动物模型的构建
第一类是皮下移植瘤
顾名思义,这种模型的建立是将肿瘤细胞或肿瘤组织直接种植在小鼠的皮下。种植的点也有讲究,一般选择血运淋巴回流丰富的腹股沟和腋窝。可根据实验设计选择移植点,统一移植点的位置,除了遵守实验统一的条件外,待肿瘤成熟后收集肿瘤时留下照片证据也显得美观。
裸鼠(Balb/c 鼠, 无毛发, T 淋巴细胞缺陷)是比较常见和常用的实验用鼠,尤其是在皮下移植瘤肿瘤模型的建立中起到重要作用。裸鼠移植瘤模型的建立具有建立周期短、成瘤率高、易于操作、成本低的优点。当然,这种肿瘤模型也有缺陷,即不能很准确的模拟正常人体肿瘤发生发展的过程。
肿瘤细胞移植时的简要步骤:
首先准备好要移植的肿瘤细胞(细胞量根据不同肿瘤略有不同,我们所用的前列腺癌细胞系每个移植点一般选择 1x106左右;肿瘤细胞可与基质胶 1:1 混匀后用 1 ml 注射器吸取,基质胶能够给肿瘤细胞提供营养环境,有助于肿瘤细胞生长)。
戴无菌手套后,将小鼠用左手大拇指和食指捏住颈部皮肤,然后将鼠尾用左手无名指和小指固定于左手大鱼际。将腋窝或腹股沟用 75% 酒精消毒 3 次。右手持吸有肿瘤细胞和基质胶混合液的注射器,在腹股沟或腋窝的位置,45 度斜角进针,注意不要突破腹膜,将针头保持于皮下位置。
然后近水平位置将针头几乎完全插入皮下,将混有基质胶的肿瘤细胞注射入皮下(肿瘤细胞量约 1x106),快速退针,左手食指轻压针孔约 1 min 后将小鼠放回饲养笼中,注意将小鼠侧放于垫料上,防止其不适呕吐时呕吐物误入呼吸道引起窒息。2~3 h 后观察小鼠是否苏醒。
如果是利用肿瘤组织(人体肿瘤标本或小鼠移植瘤传代)建立裸鼠皮下移植瘤模型,则需要首先将肿瘤组织用无菌 PBS(或 1640 培养基)洗涤 3 次,然后在无菌平皿上切成或用无菌剪刀剪成<1 mm3 体积的小块(种植前可裹基质胶)备用。
将小鼠用水合氯醛麻醉后平卧于解剖板上,四肢用胶带固定,将腋窝或腹股沟用 75%
肿瘤模型我们一般常用的就是小鼠模型和人肿瘤裸小鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下模型,另外还有腹水(或者尾静脉注射)以及原位模型,其他的模型很少用,就不提他们了。
小鼠模型分三大类:第一类是以S180、EAC、H22等为代表的,他们的宿主小鼠多选用KM,可产生腹水,也可在皮下成瘤。多以腹水传代,实验时抽取腹水,经过一定稀释后皮下接种构建模型,接踵后第二天开始给药,给药7到10天,接种10天后结束试验,剥取肿瘤称瘤重。
1. 关于构建瘤种
可以用体外细胞株培养后,用PBS悬浮至1~3×106/mouse,接种即可,最好用6号左右的针头,就是常用的2ml一次性注射的针头。
2. 关于腹水传代
观察到第一代的种鼠肚子较大后(一般约8~9天左右),可以传代,传代时取1ml注射器,用2ml注射器的针头,种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可,注意不要把针头插得很深,尽量浅一点,还可以把老鼠拎起来,利用重力,让腹水集中在某处便于抽取,一般抽个就可以了,不用离心,直接用PBS3~6倍稀释后,接种到新的老鼠腹腔,腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的,但是血性腹水说明不好,需要注意调整,第二代以后,尽量6~7天的时候传代,不要等的时间太久,否则腹水容易血性。三代后可用于试验。
3. 关于接种进行试验
这个时候抽取的腹水需要量比较多,一般需要处死种鼠后,小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤,注意不要弄破肌肉,然后,用镊子(最好是哪种前面有倒勾的镊子,学名好像是唇型镊)拎起腹部的肌肉,用剪刀剪开一个小口,然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。然后进过一定的稀释后,接种到小鼠的腋下。关于稀释量,各个实验室的情况都不一样,最好摸索一下,开始的时候可以适当的计数,但是要用台盼兰染色后计活细胞数。接种部位在小鼠腋下,但是不要深入到腋窝里面,会给以后的操作带来麻烦。接种时的进针处离接种处远一点,让针头在皮下多走一段,不容易污染。有的人接种的时候喜欢针头向上用力,紧贴着表皮往里走,然后注射的时候感觉阻力较大,打出来的皮丘又紧又圆,这样的接种,会使肿瘤与皮肤严重粘连,不利于最后肿瘤的剥取。也不要紧靠肌肉,肿瘤会与肌肉严重粘连。应该在两者之间,进针的感觉轻松自如,针头很自由,虽然打出来的肿瘤不会很圆很漂亮,但是相对好剥取一些。
一、常用肿瘤模型实验动物介绍:
1、BALB/c 小鼠 (近交系)
特性与用途:
◇其发病率低,但对致癌因子敏感。乳腺肿瘤发生率约为10﹪~20﹪。
◇有一定数量的卵巢、肾上腺和肺部肿瘤的发生,对放射线极度敏感。易患慢性肺炎。
◇多数个体于6月龄以后出现免疫球蛋白过多症。主要是IgG1和IgA量的增加。
◇免疫球蛋白的绝对量依饲养条件而异。腹腔注射矿物油后可引起浆细胞瘤。
◇广泛地应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学研究,以及单克隆抗体研究和生产等。
2、DBA/2 小鼠 (近交系)
特征与用途:
◇免疫:在普通饲养条件下三月龄鼠血清免疫球蛋白量为1000ug/ml左右,仅相当C57BL/6,C3H/He和BALB/c的1/2。其中,IgM值较高,而IgG为低值。在IgG各亚类中,IgG1最高,IgG2最低。缺乏补体C5。对鼠斑疹伤寒补体C5较敏感。
◇肿瘤:对DBA/1 的大部分移植瘤有抗性。雌鼠白血病发病率为34%,雄鼠为18%,经产母鼠乳腺癌发生率为50- 60%,雌雄鼠中均有淋巴瘤生长。
◇微生物和寄生虫:对疟原虫、利什曼原虫有抗力。对猫后睾吸虫、曼氏血吸虫较敏感。对白色念球菌有抗力,由于具有Hc0等位基因, 对新型隐球菌有抗力。
◇生理:红细胞多。血压较低。维生素K缺乏,氯仿和氧化乙烯引起的死亡率高。肾上腺脂质贮存少,心脏有钙盐沉着。具低嗜酒性及吗啡嗜好。对百日咳组织胺易感因子敏感。
◇病理:听源性癫痫发作率在35日龄时为100%,55日龄时为5%,约一半动物肝可出现由巨噬细胞构成的蜡样质的肉芽肿。
3、ICR 小鼠 (封闭群)
特征与用途:
◇适应性强,体格健壮,繁殖力强,生长速度快,实验重复性较好。
◇雌鼠自发性畸胎瘤和管状腺瘤发病率为0%~1%,用氨基甲酸乙酯诱发时,11~16天胚胎期畸胎瘤和管状腺瘤发病率为5.9%,离乳个体管状腺瘤和囊瘤发生率为30%,孕鼠为3%。