中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s㊀２０１８,３４(５)D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０１８．００．０６８ 综㊀述环介导等温扩增技术检测方法的研究进展刘亚东,冷㊀雪,时㊀坤,李建明,张姗姗,刘㊀艺,宫庆龙,孙志博,宗㊀颖,曾范利,杜㊀锐国家自然科学基金(N o ．３１３７２４３６)和吉林省科技厅科技支撑计划(N o ．２０１６０２０９００６Y Y )联合资助通讯作者:杜㊀锐,E m a i l :d u r u i ７１＠１２６．c o m 作者单位:吉林农业大学,长春㊀１３００００摘㊀要:环介导等温扩增技术是一种可用于临床诊断的快速检测方法,可用于检测病毒㊁细菌㊁寄生虫等多种病原体.经不断完善,现已在临床检测过程中发挥重要作用.可用显色试剂对反应结果实现可视化,即结果的即时显示,无需后续验证.但是,无论是荧光染料还是显色指示剂,对反应过程都会产生或多或少的影响,目前研究表明羟基萘酚蓝是最好的显色试剂.同时,人们发现电化学技术也可以应用于此,使检测反应更快,操作更加简单.生物传感器可以对多种反应产物进行同步检测,而微流控芯片技术更是方便携带,有望成为实时检测技术的理想载体.关键词:L AM P ;可视化;电化学检测法;生物传感器;微芯片中图分类号:R ３７㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０１８)０５－０４６０－０６A d v a n c e do f t h e d e t e c t i o nm e t h o do f l o o p Ｇm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m pl i f i c a t i o n L I U Y a Ｇd o n g ,L E N G X u e ,S H IK u n ,L I J i a n Ｇm i n g,Z H A N GS h a n Ｇs h a n ,L I U Y i ,G O N G Q i n g Ｇl o n g ,S U NZ h i Ｇb o ,Z O N G Y i n g,Z E N GF a n Ｇl i ,D U R u i (J i l i nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,C h a n gc h u n １３００００,C h i n a )A b s t r a c t :l o o p Ｇm ed i a te d i s o t h e r m a l a m p l if i c a t i o n i s a r a p i dd e t e c t i o nm e t h o d t h a t c a nb e u s e d f o r c l i n i c a l d i a gn o s i s a n d c a n b eu s e d t od e t e c t v i r u s e s ,b a c t e r i a ,p a r a s i t e s a n d o t h e r p a t h o g e n s ．I t h a s b e e n i m p r o v e d a n d p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e c l i n i Ｇc a l t e s t i n gp r o c e s s ．T h e c o l o r r e a c t i o n c a nb eu s e d t o a c h i e v ev i s u a l i z a t i o no f t h e r e s u l t s ,a n d t h e r e s u l t s c a n i mm e d i a t e l y di s Ｇp l a y ．H o w e v e r ,b o t h t h e f l u o r e s c e n t d y e a n d t h e c o l o r i n d i c a t o r c a n i m p a c t t h e r e a c t i o n p r o c e s s ．T h e c u r r e n t s t u d y s h o w s t h a t h y d r o x y l n a p h t h o l b l u e i s t h e b e s t c o l o r r e a g e n t ．A t t h e s a m e t i m e ,i tw a s f o u n d t h a t e l e c t r o c h e m i c a l t e c h n o l o g y c a n a l s o b e a pＧp l i e d t o t h em e t h o d ,w h i c hc a nm a k e t h ed e t e c t i o nr e a c t i o nb e f a s t e r a n dt h eo p e r a t i o n m o r e s i m p l e ．B i o s e n s o r s c a ns yn c h r o Ｇn i z e dd e t e c t a v a r i e t y o f r e a c t i o n p r o d u c t s ．A n dm i c r o f l u i d i c c h i p i s e a s y t o c a r r y a n d i s e x pe c t e d t ob e c o m e t h e i d e a l c a r r i e rf o r r e a l Ｇt i m e d e t e c t i o n t e c h n o l og y．K e yw o r d s :l o o p Ｇm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n ;v i s u a l i z a t i o n ;e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t i o n ;b i o s e n s o r s ;m i c r o c h i p s S u p p o r t e db y t h eN a t i o n a lN a t u r a l S c i e n c eF o u n d a t i o no f C h i n a (N o ．３１３７２４３６),a n d t h e S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y S u p p o r t P r o Ｇgr a mo f J i l i nP r o v i n c i a l (N o ．２０１６０２０９００６Y Y )C o r r e s p o n d i n g au t h o r :D uR u i ,E m a i l :d u r u i ７１＠１２６．c o m ㊀㊀目前已存在几种核酸扩增方法[１Ｇ４],而P C R (聚合酶链式反应)是目前使用最广泛的技术,该基因扩增方法已被应用于临床,特别是在分子检测方面,在传染病诊断中尤其如此,例如肝炎和结核等,以及一些遗传疾病.基因检测步骤包括从标本中提取核酸,进行基因扩增和检测,这些步骤需要一定的操作技术和昂贵的仪器设施,在资金投入紧张的国家和地区,使用受到限制,且P C R 的循环过程变温会消耗一定时间.环介导等温扩增(L o o pＧm e d i a t e d i s o Ｇt h e r m a l a m pl i f i c a t i o n ,L AM P )是N o t o m i 等[５]人研究的一种分子扩增技术,可以快速大量的扩增目的片段,等温扩增解决了变温的时间损耗,现被应用于临床检测中,并被不断完善,在临床检测中具有非常重要的意义.１㊀L A M P 原理L AM P 技术的核心之一在于引物的设计,设计出特异性强的引物是L AM P 的第一步也是开始的关键.L AM P 引物是针对D N A 的靶序列设计一对０６４外引物F３与B３,以及一对内引物F I P和B I P,内引物F I P是由F２和F I c组成,B I P是由B２和B１c组成[６].反应的进行依托于D N A置换酶的活性和引物的特异性.在初始过程中,４个引物都参与反应,但是在循环反应中只有内引物参与D N A序列的置换合成.内引物分为上内引物(F I P)和下内引物(B I P),每一个内引物含有２个不同的序列,与靶序列的正向序列和反向序列相对应,一个用于第一步的启动,另一个以自身为模版进行第二阶段的循环扩增,即目的片段的尾端内侧序列被命名为F２c和B２.F２c和B２尾端内侧的２个序列被称为F１c和B１,外侧的２个序列称为F３c和F３.鉴于这种结构,F I P和B I P被命名为内引物.F I P包含F１c,１个T T T T片段以及互补于F２c的序列F２.B I P包含的是与B１互补的序列B１c,T T T T片段和B２.２个外引物包括的是B３和F３c互补的序列F３.１个含有靶序列和４个引物的D N A样品加热变性后在冰上快速冷却.之后,加入B s tD N A大片段置换酶,６５ħ１h,开始L AM P反应[５].２㊀反应特点L AM P反应的几个方面与其他扩增方法不同. L AM P方法的主要特征是只需要一种酶,使其在６５ħ范围内的等温条件下扩增核酸.因此,它允许使用简单且具有低成本效益的反应设备,在临床检测中可以更好的实施.L AM P方法具有高特异性和高扩增效率.由于L AM P方法使用４种识别模板D N A上６个不同区域的引物,其特异性极高.例如,L AM P方法可以特异性扩增来自区分单个核苷酸差异的人类基因组标本中的特定基因[７].L AM P方法的分离效率非常高,等温也不需要变温过程的时间浪费.L AM P方法在３０~６０m i n 内对２５μL反应混合物合成１０~２０μg特异性D N A[８].尤其加入特异性环引物可以有助于将扩增时间缩短到原始L AM P方法的１/２或１/３[９].该方法还可用于扩增靶R N A序列.N o t o m i 等人开发了一步,单管,实时逆转录循环介导的等温扩增(R TＧL AM P)测定法,用于检测甲型肝炎病毒(H A V)基因组中非翻译区的序列[１０].在这种情况下,与D N A的扩增相同的一步扩增可以通过同时添加逆转录酶进行,因为逆转录酶也显示出链转移活性.３㊀L A M P研究进展自从２０００年[５]第一次报道了L AM P,L AM P 就成为了分子扩增领域广泛研究的重点,在不断的研究中L AM P技术越来越完善.２００２年N a g aＧm i n e等人[９]设计应用环引物,大大缩短了L AM P 反应时间;同年N a g m i n e等人[１１]使用T s p R I酶实现了D N A的单链分离扩增;２００５年E n o m o t o等人[１２]通过将L AM P与逆转录相结合,建立了R TＧL AM P技术;２００６年Y o n e y a m a等人[１０]开发了单管一步逆转录法,对肝炎病毒进行了逆转录;同年H i r a y a m a等[１３]应用L AM P方法对水牛胚胎进行了性别鉴定并克隆了性染色体的特异性序列,对于物种的繁殖作出了非常重要的贡献.此外,２００６年P o o n等人[１４]未提取D N A直接进行L AM P,成功检测到恶性疟原虫阳性反应,对之后的检测技术产生深远的影响.K a n e k o等人[１５]在２００７年通过检测L AM P对生物的耐受性,进行了未提取D N A的病毒L AM P实验,再一次表明L AM P可以不经过D N A提取而进行扩增,只是结果没有经过提取的效果好.３．１㊀可视化发展㊀２００１年M o r i等人发现了根据浊度对反应进行肉眼的直观判断[８],但是因根据肉眼分辨浊度具有强烈的主观性,L e等人[１６]发现,在阳光照射下,用肉眼确定管之间的灵敏度和变异性是困难的,且阳性样品的浊度只在短时间内稳定.意味着必须在反应之后尽快进行监测[１７],更需要浊度计进行准确客观的判断,然而使用浊度计进行检测,不够经济实用,因而,实现反应结果的可视化,成为了学者们关注的焦点.D N A具有能和染料结合的特异性分子结构d s D N A,通常,染料与d s D N A的复合物的形成会使染料发生可见的颜色变化,因此此类染料可用于L AM P产物的可视化.２００３年,I w a m o t o等人[１８]首次使用S Y B R G r e e n I用于L AM P结果鉴定,研究发现[１９]D N A结合染料的检测灵敏度都远高于浊度检测的灵敏度.目前,许多荧光染料已被用于定性检测.在存在足够的d s D N A的情况下,荧光染料S Y B RＧG r e e n I的颜色从橙色变为绿色,且在自然光下,颜色变化依然易于分辨[１９Ｇ２０].另一方面,通过添加D N A结合染料提高灵敏度与较高的运行成本有关.另外,由于需要打开反应管以增加染料,因此增加了污染风险.为了克服后者的缺点,２０１２年,H o n g等人[２１]研究出了两步法,以避免打开管: S Y B RＧG r e e nI染料悬浮在管内的锡箔上,在L AM P反应后,将管离心,使染料落入L AM P反应１６４５期刘亚东等:环介导等温扩增技术检测方法的研究进展混合物中.使用该方法,当最小模板浓度为１拷贝/μL时,可以检测到L AM P的产物.同样,Q u a n tＧi T P i c o G r e e n[２２],G e n e F i n d e r[１７,２３Ｇ２４],和溴化乙锭[２２]也被用于L AM P结果的检测.２００６年,Y a s u y o s h i等人[２５]把聚乙烯亚胺用于L AM P的结果检测,用来增强染料标记.在使用聚乙烯亚胺增强的方法中,使用荧光标记的D N A探针结合L AM P产物,随后加入聚乙烯亚胺中和染料标记的L AM P产物,产生具有清晰的颜色的沉淀物,可以通过肉眼直接对结果判定.然而,D N A结合染料的方法存在一定的缺陷,主要为会对L AM P的扩增过程产生抑制[２５],这意味着染料试剂必须在终点加入,避免影响L AM P反应.此外,这些染料中的一些,例如溴化乙锭[７]可能是诱变剂,致癌物质或致畸物,虽然这取决于接触程度.此外,这种方法需要在扩增后打开反应管,可能会造成污染.对此,L i a n g等人[２６]在２０１３年用微晶蜡将S Y B RＧG r e e n I染料提前密封在反应管中,在L AM P反应结束后通过加热使蜡融化释放染料进行显色,这种方法即应用了荧光染料的灵敏度又解决了因开盖而可能产生的污染问题.在２０１４年J i a n g等人[２７]成功的应用这种方法对恶性疟原虫进行了检测.另一种使用间接显色指示剂的肉眼观测方法,指示剂可以加入到L AM P反应体系中,进行密封一步测定.因此,与两步的D N A结合染料方法相比,降低了产生污染的风险[２８],比如,钙绿黄素.在２００８年钙绿黄素被T o m i t a等人[７]首次应用在L AM P反应结果检测.在扩增反应前,钙黄绿素分子与锰离子结合,L AM P反应溶液为橙色,L AM P 反应过程中生成大量的焦磷酸根,使得钙绿黄素分子不再结合锰离子,而与生成的焦磷酸根离子结合,生成绿色荧光,而且,钙绿黄素分子与镁离子结合,可以增强绿色荧光信号[７].然而,在２０１０年W a s t iＧl i i n g等人[２２]发现,与没有添加指示剂的反应相比,加入钙绿黄素的似乎降低了L AM P的敏感性.实际上,钙绿黄素的存在在一定程度上抑制了L AM P 反应[２２,２９],另一个原因是钙绿黄素和双链D N A之间的相互作用导致了反应灵敏度的降低[３０Ｇ３１].因此,具有相似作用方式的另一种染料H N B 进入了人们的视线,这种染料是在镁离子存在下形成紫色,在扩增反应过程中,伴随大量的焦磷酸镁的生成导致反应中的镁离子浓度下降,从而使得含有H N B的反应溶液从紫色变为蓝色[２９].W a s t l i i n g 等人[２２]研究表示,该试剂不会对L AM P反应产生抑制,比钙绿黄素更加适合作为指示剂,因而被广泛使用[１７,２１,２９,３２Ｇ３４].３．２㊀电化学检测法㊀由于电化学方法更快,成本更低,更简单,并且比光学的方法更容易以小型化的形式应用[３５],这些特点使得电化学可以作为分析D N A扩增结果的可靠且稳定的检测方法[３６].因此,现在一部分的焦点为利用电化学传感器/芯片和生物传感器等方法对L AM P反应进行检测.３．２．１㊀E n d p o i n t㊀电化学的活性物质与d s D N A的结合会导致检测电流的变化.比如,在溶液中的H o e c h s t３３２５８氧化还原分子可使得D N A在槽中聚集,导致电流反应明显下降.A h m e d[３７]和S a f aＧv i e h[３８]等人将分子用作电活性指示剂来检测L AM P反应产物,并用探针非固定化方法测得８ ６f g/μL D N A(２４C F U/m L)[３８],为减少交叉感染的分析,他们开发了一个平台,允许在单个设备中进行放大检测.使用该装置和H o e c h s t３３２５８指示器,一次可测得３００拷贝量[３９].３．２．２㊀R e a l t i m e㊀L AM P反应的实时监测可以通过原位电化学反应来实现,依赖于两种机制:亚甲蓝(M B)分子与工作电极之间的氧化还原电子转移以及M B与d s D N A的嵌入[４０Ｇ４１],随着反应的进行, M B与L AM P扩增子的嵌入降低了游离M B浓度,从而降低了这种氧化还原电流[４２Ｇ４４].使用M B作为指标,H s i e h[４２]和X i e[４４]等人得到的检测限度分别为１６拷贝(４f g/μL)和０．３p M.然而,M B的D N A结合亲和力为１０４~１０５M－１[４５],其与M B L与扩增子L AM P在溶液中的低效率相互作用[４６],表明可以通过其他指标来实现较低的检测限度.钌六胺缺乏插层配体并与阴离子d s D N A骨架静电结合[４７].A h m e d等[４６]人将其作为定量监测L AM P 扩增子的指标,在３０m i n内检测限为２０拷贝/μL.使用单个生物芯片在单个聚丙烯管中进行体外扩增和实时监测,这种方法可以避免在整个过程中潜在的交叉污染风险.在理想情况下,电活性指示剂应具有化学稳定性,应优先与d s D N A扩增子结合,不应在监测过程中抑制扩增[４６].然而,几乎所有的氧化还原探针都对D N A的扩增存在抑制作用[３８].例如,H o e c h s t３３２５８对聚合酶活性有明显的抑制作用,并且限制溶液中D N A的扩增和感测.为了克服这个问题,Z h a n g等人[２４]开发了一种伏安模式,用于通过测试游离的２Ｇ脱氧鸟苷５Ｇ三磷酸(d G T P)的氧化反应来监测D N A扩增的生物化学过程,这也是L AM P反应中的反应物之一.有了这个方法,２６４中国人兽共患病学报２０１８,３４(５)抑制问题不再是焦点,因为没有辅助指标可以使用.不幸的是,需要将电极置于反应中可能会发生交叉污染.３．３㊀生物化学传感器㊀电化学生物传感器与某种生物识别模式联合,应用于检测方法中.已经报道了几种用于监测L AM P反应的电化学生物传感器/基于生物芯片的方法.S u n等人[４８]通过将序列特异性s s D N A探针固定在离子液体改良的基底电极上来制造电化学D N A生物传感器.然后,他们使用生物传感器和亚甲基蓝电化学指示剂来监测杂交的L AM P扩增子.N a k a m u r a等[４９]人开发了一种电化学D N A生物芯片,用H o e c h s t３３２５８作为杂交指示剂同时监测六种L AM P产物.N a k a m u r a等人[５０]又通过组合L AM P和基于杂交的电化学D N A生物芯片成功获得了特定基因的拷贝数,其由G e n e l y z e系统,D N A扩增１h和D N A检测０．５h 组成.通常,生物传感器/生物芯片的方法用于直接检测特异性序列的目标基因片段,以及在L AM P反应后进行定性检测使用.虽然直接检测特异性高于间接测量的特异性,但是制备D N A生物传感器/芯片是昂贵且耗时的,特别是在L AM P反应时对其进行实时检测,并不容易实现.目前,通过简单且经济有效的伏安模式监测L AM P反应已经有了一些进展,但是还没有详细的解释能说明L AM P反应物会污染电极设备.A h m e d等人[４６]观察到即使在重复测量之后,电极面和相对面上也没有形成薄膜或污渍.４㊀L A M P的未来目前还没有足够稳定㊁简单以及经济的N A T 系统供发展中国家使用.综上所述,L AM P及其周边技术还在开发中,用于在发展中国家建立最简单的用于诊断的N A T系统.这种诊断方法可能对许多疾病流行的国家有很大帮助.检测L AM P反应的理想方法应具有高度的敏感性和快速反应性,应具有低成本和非高密度性,应易于使用和环保,实现理想L AM P检测的可行性取决于微型化检测组件的发展,微流控芯片[５１]作为下一代基因检测设备一直被关注.该装置是在平台上组装的微小通道构成,在基因测试时,可以在单个芯片上进行完整的分析,包括提取,扩增和检测[５２].这些器件称为μＧ总分析系统(μＧT A S)芯片,或称为 芯片上的实验室 .使用这些装置的优点包括防止基因扩增产物的污染,根据设备的设计可以进行多体系自动化反应,可以提高对微量样品的分析速度,以及进行简化及微型化现场测试.这种方法可以解决与现场基因测试相关的大量问题.H a t a o k a等人[５３]已经通过研究证明,L AM P扩增之后继续进行下一步的反应和分析,这些都可以在单个芯片上实现,也证明L AM P 反应在下一代的设备装置中依然适用.基于L AM P方法的简单通用的设备的开发和应用,对临床疾病的快速㊁准确的检测将具有重要意义.参考文献:[１]S a i k i R K,S c h a r f S,F a l o o n a F,e t a l．E n z y m a t i c a m p l i f i c a t i o n o f b e t aＧg l o b i n g e n o m i cs e q u e n c e sa n dr e s t r i c t i o ns i t ea n a l y s i sf o r d i a g n o s i so f s i c k l ec e l l a n e m i a[J]．S c i e n c e,１９８５,２３０(４７３２):１３５０．[２]C o m p t o nJ．N u c l e i ca c i ds e q u e n c eＧb a s e da m p l i f i c a t i o n[J]．N aＧt u r e,１９９１,３５０(６３１３):９１．[３]W a l k e rG T,L i t t l e M C,N a d e a uJ G,e t a l．I s o t h e r m a l i nv i t r o a m p l i f i c a t i o no fD N Ab y a r e s t r i c t i o ne n z y m e/D N A p o l y m e r a s e s y s t e 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tP r o t o c o l s,２００８,３(５):８７７．[８]M o r iY,N a g a m i n eK,T o m i t aN,e t a l．D e t e c t i o n o f l o o pＧm e d iＧa t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o nr e a c t i o nb y t u r b i d i t y d e r i v e d f r o m m a g n e s i u m p y r o p h o s p h a t ef o r m a t i o n[J]．B i o c h e m B i o p h R e s C o,２００１,２８９(１):１５０Ｇ１５４．[９]N a g a m i n eK,H a s eT,N o t o m iT．A c c e l e r a t e d r e a c t i o nb y l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o nu s i n g l o o pp r i m e r s[J]．M o l C e l l u l a rP r o b e,２００２,１６(３):２２３．[１０]Y o n e y a m aT,K i y o h a r aT,S h i m a s a k i N,e t a l．R a p i d a n d r e a lＧt i m ed e t e c t i o n o fh e p a t i t i s A v i r u s b y r e v e r s et r a n s c r i p t i o n l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n a s s a y[J]．JV i r o lM e t hＧo d s,２００７,１４５(２):１６２Ｇ１６８．[１１]N a g a m i n eK,K u z u h a r aY,N o t o m i T．I s o l a t i o n o f s i n g l eＧs t r a nＧd e d D N A f r o m l o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n p r o dＧu c t s．[J]．B i o c h e m B i o p hR e s,２００２,２９０(４):１１９５Ｇ１１９８．[１２]E n o m o t oY,Y o s h i k a w aT,I h i r a M,e t a l．R a p i dd i a g n o s i so fh e r p e ss i m p l e xv i r u s i n f e c t i o nb y al o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o nm e t h o d[J]．JC l i n M i c r ob i o l,２００５,４３(２):９５１Ｇ９５５．[１３]H i r a y a m aH,K a g e y a m aS,T a k a h a s h iY,e t a l．R a p i ds e x i n g o fw a t e r b u f f a l o(B u b a l u s b u b a l i s)e m b r y o su s i n g l o o pＧm e d i aＧt e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n[J]．T h e r i o g e n o l o g y,２００６,６６３６４５期刘亚东等:环介导等温扩增技术检测方法的研究进展(５):１２４９Ｇ１２５６．[１４]P o o nL L,W o n g B W,M aE H,e t a l．S e n s i t i v e a n d i n e x p e n s i v e m o l e c u l a r t e s tf o rf a l c i p a r u m m a l a r i a:d e t e c t i n g P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m D N Ad i r e c t l y f r o mh e a tＧt r e a t e db l o o d b y l o o pＧm e d iＧa t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n[J]．C l i n C h e m,２００６,５２(２):３０３．[１５]K a n e k oH,K a w a n aT,F u k u s h i m aE,e t a l．T o l e r a n c e o f l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n t o a c u l t u r em e d i u ma n d b i oＧl o g i c a l s u b s t a n c e s[J]．JB i o c h eB i o p h M e t h o d s,２００７,７０(３):４９９．[１６]L eT H,N g u y e nN T,T r u o n g N H,e t a l．D e v e l o p m e n t o fm iＧt o c h o n d r i a l l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n f o r d e t e c t i o n o f t h es m a l l l i v e rf l u k e O p i s t h o r c h i sv i v e r r i n i(O p i s t h o r c h iＧi d a e;T r e m a t o d a;P l a t y h e l m i n t h e s)[J]．J C l i n M i c r o b i o l,２０１２,５０(４):１１７８Ｇ１１８４．[１７]A l m a s iA,M o r a d iA,D e h a b a d i S MH,e t a l．D e v e l o p m e n t a n d a p p l i c a t i o no f l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o na s s a y f o r r a p i dd e t e c t i o no f f u s a r i u m o x y s p o r u mf．s p．l y c o p e r s i c i[J]．J P l a n tP a t h o l M i c r o b i o l,２０１３,４:１７７．D O I:１０．４１７２/２１５７Ｇ７４７１．１０００１７７[１８]I w a m o t oT,S o n o b eT,H a y a s h iK．L o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n f o r d i r e c t d e t e c t i o n o f M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s c o m p l e x,M．a v i u m,a n d M．i n t r a c e l l u l a r e i nS p u t u m S a mＧp l e s[J]．JC l i n M i c r o b i o l,２００３,４１(６):２６１６．[１９]L eT H,N g u y e nN T,T r u o n g N H,e t a l．D e v e l o p m e n t o fm i t oＧc h o n d r i a l l o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o nf o rd e t e c t i o n o f t h es m a l l l i v e rf l u k e O p i s t h o r c h i sv i v e r r i n i(O p i s t h o r c h iＧi d a e;T r e m a t o d a;P l a t y h e l m i n t h e s)[J]．J C l i n M i c r o b i o l,２０１２,５０(４):１１７８Ｇ１１８４．[２０]Z h a n g Y H,Y a n g T,S h a n g HW,e t a l．I n f l u e n c eo f s u b s t i t uＧt i n g l aw i t h p r o n e l e c t r o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o fR EＧM gＧN iＧb a s e dA２B７Ｇt y p e a l l o y s p r e p a r e d b y m e l t s p i n n i n g[J]．A d vM aＧt e rR e s,２０１２,５６０Ｇ５６１:１０１１Ｇ１０１５．[２１]H o n g M,Z h aL,F uW,e t a l．A m o d i f i e d v i s u a l l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n m e t h o df o rd i a g n o s i sa n dd i f f e r e n t i aＧt i o no fm a i n p a t h o g e n s f r o m M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s c o mＧp l e x[J]．W o r l d JM i c r o b i o l B i o t e c h n o l,２０１２,２８(２):５２３Ｇ５３１．[２２]W a s t l i n g S L,P i c o z z i K,K a k e m b oA S,e t a l．L AM P f o r h u m a n a f r i c a nt r y p a n o s o m i a s i s:ac o m p a r a t i v e s t u d y o f d e t e c t i o n f o rＧm a t s[J]．P l o sN e g l e c tT r o p D,２０１０,４(１１):e８６５．[２３]Z h a n g Q L,S h i C Y,H u a n g J,e t a l．R a p i dd i a g n o s i so f t u r b o t r e d d i s hb o d y i r i d o v i r u s i nt u r b o tu s i n g l o o pＧm e d i a t e di s o t h e rＧm a l a m p l i f i c a t i o n m e t h o d[J]．JV i r o l o g M e t h o d s,２００９,１５８(２):１８Ｇ２３．[２４]Z h a n g X,Q uK,L iQ,e t a l．R e c o r d i n g t h e r e a c t i o n p r o c e s s o f l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n(L AM P)b y m o n i t o r i n g t h e v o l t a mm e t r i c r e s p o n s e o f２ᶄＧd e o x y g u a n o s i n e５ᶄＧt r i p h o sＧp h a t e[J]．E l e c t r o a n a l y s i s,２０１１,２３(１０):２４３８Ｇ２４４５．[２５]Y a s u y o s h i M,T s u y o s h iH,T s u g u n o r iN．S e q u e n c es p e c i f i c v i s u a l d e t e c t i o n o f L AM P r e a c t i o n s b y a d d i t i o n o f c a t i o n i c p o l yＧm e r s[J]．B m cB i o t e c h n o l o g y,２００６,６(１):３．[２６]L i a n g C,C h e n g S,C h u Y,e ta l．Ac l o s e dＧt u b ed e t e c t i o no f l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n(L AM P)p r o d u c t su s i n g a w a xＧs e a l e d f l u o r e s c e n ti n t e r c a l a t o r．[J]．J N a n o s c i N a n o t e c h n o l,２０１３,１３(６):３９９９．[２７]J i a n g Z M,X u e p i n g MA,Y i nZ J,e t a l．Ac l o s e dＧt u b e i s o t h e rＧm a l a m p l i f i c a t i o nm e t h o d f o r h i g h l y s e n s i t i v e a n d v i s u a l i z e d d eＧt e c t i o no f P l a s m o d i u mF a l c i p a r u m[J]．P r o g r e s s i nM o d e r nB iＧo m e d i c i n e,２０１４．[２８]P a r i d a M,S a n n a r a n g a i a hS,D a s hP K,e ta l．L o o p m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n(L AM P):a n e w g e n e r a t i o n o f i n n o v aＧt i v e g e n e a m p l i f i c a t i o nt e c h n i q u e;p e r s p e c t i v e s i nc l i n i c a l d i a gＧn o s i s o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s[J]．R e v M e dV i r o l,２００８,１８(６):４０７Ｇ４２１．[２９]G o t oM,H o n d aE,O g u r aA,e t a l．C o l o r i m e t r i cd e t e c t i o no f l o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o nr e a c t i o n b y u s i n g h yＧd r o x y n a p h t h o l b l u e．[J]．B i o t e c h n i q u e s,２００９,４６(３):１６７Ｇ１７２．[３０]Y uF,D i n g Y,G a oY,e t a l．F l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n t e f f e c t f o r t h e d e t e r m i n a t i o no fD N A w i t hc a l c e i nＧc e t y l t r i m e t h y l a mＧm o n i u mb r o m i d es y s t e m[J]．A n a l y t i c aC h i m i c a A c t a,２００８,６２５(２):１９５．[３１]Z h a n g X,L iM,C u iY,e t a l．E l e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o r o f c a lＧc e i na n d t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n c a l c e i n a n dD N A[J]．E l e c t r o aＧn a l y s i s,２０１２,２４(９):１８７８Ｇ１８８６．[３２]M aX J,S h uY L,N i eK,e t a l．V i s u a l d e t e c t i o n o f p a n d e m i c i nＧf l u e n z aA H１N１V i r u s２００９b y r e v e r s eＧt r a n s c r i p t i o n l o o pＧm eＧd i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o nw i t hh y d r o x y n a p h t h o l b l u ed y e[J]．JV i r o lM e t h o d s,２０１０,１６７(２):２１４Ｇ２１７．[３３]L u oL,N i eK,Y a n g M J,e t a l．V i s u a l d e t e c t i o no fh i g hＧr i s k h u m a n p a p i l l o m a v i r u s g e n o t y p e s１６,１８,４５,５２,a n d５８b y l o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n w i t h h y d r o x y n a p h t h o l b l u e d y e[J]．JC l i n M i c r o b i o l,２０１１,４９(１０):３５４５．[３４]S a f a v i e h M,A h m e d MU,S o k u l l uE,e t a l．As i m p l e c a s s e t t ea s p o i n tＧo fＧc a r e d i a g n o s t i c d e v i c ef o r n a k e dＧe y ec o l o r i m e t r i cb ac t e r i ade t e c t i o n．[J]．A n a l y s t,２０１３,１３９(２):４８２Ｇ４８７．[３５]F e r g u s o nB S,B u c h s b a u m S F,S w e n s e nJ S,e ta l．I n t e g r a t e d m i c r of l u i d i c e l e c t r o c h e m i c a l D N As e n s o r[J]．A n a l y t i c a l C h e m,２００９,８１(１５):６５０３Ｇ６５０８．[３６]D e fév e rT,D r u e tM,E v r a r dD,e t a l．R e a lＧt i m e e l e c t r o c h e m iＧc a l P C R w i t haD N Ai n t e r c a l a t i n g r e d o x p r o b e[J]．A n a l y t i c a lC h e m,２０１１,８３(５):１８１５．[３７]A h m e dMU,H a s a nQ,H o s s a i nMM,e t a l．M e a t s p e c i e s i d e nＧt i f i c a t i o nb a s e do nt h e l o o p m e d i a t e di s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n a n d e l e c t r o c h e m i c a lD N As e n s o r．[J]．F o o dC o n t r o l,２０１０,２１(５):５９９Ｇ６０５．[３８]S a f a v i e hM,A h m e dMU,T o l b aM,e t a l．M i c r o f l u i d i c e l e c t r oＧc h e m i c a l a s s a y f o r r a p i dd e t e c t i o na n d q u a n t i f i c a t i o no fE s c h eＧr i c h i a c o l i[J]．B i o s e nB i o e l e c t r o n,２０１２,３１(１):５２３Ｇ５２８．[３９]A h m e d MU,S a i t o M,H o s s a i n MM,e ta l．E l e c t r o c h e m i c a l g e n o s e n s o r f o r t h e r a p i d d e t e c t i o no fGMOu s i n g l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n[J]．A n a l y s t,２００９,１３４(５):９６６Ｇ９７２．[４０]K e r m a nK,O z k a nD,K a r aP,e t a l．V o l t a mm e t r i c d e t e r m i n aＧt i o no fD N A h y b r i d i z a t i o nu s i n g m e t h y l e n eb l u ea n ds e l fＧa sＧs e m b l e da l k a n e t h i o l m o n o l a y e ro n g o l de l e c t r o d e s[J]．A n a lC h i m A c t a,２００２,４６２(１):３９Ｇ４７．[４１]Y a n g W,O z s o zM,H i b b e r t D,e t a l．E v i d e n c e f o r t h e d i r e c t i nＧ４６４中国人兽共患病学报２０１８,３４(５)t e r a c t i o n b e t w e e n m e t h y l e n e b l u e a n d g u a n i n e b a s e s u s i n gD N AＧm o d i f i e dc a r b o n p a s t e e l e c t r o d e s[J]．E l e c t r o a n a l y s i s,２０１５,１４(１８):１２９９Ｇ１３０２．[４２]H s i e hK,P a t t e r s o nA S,F e r g u s o nB S,e t a l．R a p i d,s e n s i t i v e, a n d q u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no f p a t h o g e n i cD N A a tt h e p o i n to f c a r ev i a m i c r o f l u i d i ce l e c t r o c h e m i c a l q u a n t i t a t i v eL o o pＧM e d i aＧt e d i s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n(M E QＧL AM P)[J]．A n g e w a n d t eC h e m i e,２０１２,５１(２０):４８９６Ｇ９００．[４３]N a g a t a n i N,Y a m a n a k aK,S a i t oM,e t a l．S e m iＧr e a l t i m e e l e cＧt r o c h e m i c a l m o n i t o r i n g f o ri n f l u e n z a v i r u s R N A b y r e v e r s e t r a n s c r i p t i o nl o o pＧm e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n u s i n g a U S B p o w e r e d p o r t a b l e p o t e n t i o s t a t[J]．A n a l y s t,２０１１,１３６(２４):５１４３Ｇ５１５０．[４４]X i e S,C h a i Y,Y u a nY,e t a l．D e v e l o p m e n t o f a n e l e c t r o c h e m iＧc a lm e t h o df o rO c h r a t o x i n A d e t e c t i o nb a s e do na p t a m e ra n d l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n[J]．B i o s e nB i o e l e c t r o n,２０１４,５５(９):３２４Ｇ３２９．[４５]B a r a n o v s k i i S F,B o l o t i nP A,E v s t i g n e e v M P,e t a l．C o m p l e xＧa t i o no f h e t e r o c y c l i c l i g a n d sw i t hD N Ai na q u e o u s s o l u t i o n[J]．JA p p l i e dS p e c t r o s c,２００８,７５(２):２５１Ｇ２６０．[４６]A h m e d MU,N a h a rS,S a f a v i e h M,e ta l．R e a lＧt i m ee l e c t r oＧc h e m i c a l d e t e c t i o n o f p a t h o g e nD N Au s i n g e l e c t r o s t a t i c i n t e r a cＧt i o no f a r e d o x p r o b e[J]．A n a l y s t,２０１３,１３８(３):９０７Ｇ９１５．[４７]S t e e l A B,H e r n eT M,T a r l o vM J．E l e c t r o c h e m i c a l q u a n t i t a t i o n o fD N Ai mm o b i l i z e do n g o l d[J]．A n a l y t i c a lC h e m,１９９８,７０(２２):４６７０．[４８]S u n W,Q i nP,G a oH,e t a l．E l e c t r o c h e m i c a lD N Ab i o s e n s o r b a s e do nc h i t o s a n/n a n oＧV２O５/MW C N T sc o m p o s i t ef i l mm o d i f i e d c a r b o n i o n i c l i q u i d e l e c t r o d e a n d i t s a p p l i c a t i o n t o t h e L AM P p r o d u c to fY e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a,g e n es e q u e n c e[J]．B i o s e nB i o e l e c t r o n,２０１０,２５(６):１２６４Ｇ１２７０．[４９]N a k a m u r aN,I t oK,T a k a h a s h iM,e t a l．D e t e c t i o no f s i x s i nＧg l eＧn u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m sa s s o c i a t e d w i t hr h e u m a t o i da rＧt h r i t i s b y a l o o pＧm e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o nm e t h o da n d a ne l e c t r o c h e m i c a lD N Ac h i p[J]．A n a lC h e m,２００７,７９(２４):９４８４Ｇ９４９３．[５０]N a k a m u r aN,F u k u d aT,N o n e nS．S i m p l e a n d a c c u r a t e d e t e rＧm i n a t i o no fC Y P２D６g e n e c o p y n u m b e r b y a l o o pＧm e d i a t e d i s oＧt h e r m a l a m p l i f i c a t i o nm e t h o d a n d a n e l e c t r o c h e m i c a l D N Ac h i p [J]．C l i nC h i m A c t a,２０１０,４１１(７):５６８Ｇ５７３．[５１]W h i t e s i d e sGM．T h e o r i g i n s a n d t h e f u t u r e o fm i c r o f l u i d i c s[J]．N a t u r e,２００６,４４２(７１０１):３６８．[５２]K o p p MU,M e l l oA J,M a n zA．C h e m i c a l a m p l i f i c a t i o n:c o n t i nＧu o u sＧf l o wP C Ro na c h i p[J]．S c i e n c e,１９９８,２８０(５３６６):１０４６．[５３]H a t a o k aY,Z h a n g L,M o r iY,e t a l．A n a l y s i s o f s p e c i f i c g e n e b y i n t e g r a t i o no f i s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o na n de l e c t r o p h o r e s i s o n p o l y(m e t h y l m e t h a c r y l a t e)m i c r o c h i p s[J]．A n a lC h e m,２００４,７６(１３):３６８９Ｇ３６９３．收稿日期:２０１７Ｇ１０Ｇ１３㊀编辑:张智芳(上接第４５９页)[５５]Y uH B,R a oP S,L e eH C,e t a l．At y p e I I I s e c r e t i o n s y s t e mi s r e q u i r e d f o r A e r o m o n a s h y d r o p h i l a A HＧ１p a t h o g e n e s i s[J]．I nＧf e c t I mm u n,２００４,７２(３):１２４８Ｇ１２５６．D O I:１０．１１２８/I A I．７２．３．１２４８Ｇ１２５６．２００４[５６]V i l c h e s S,J i m e n e zN,T o m a s J M,e t a l．A e r o m o n a s h y d r o p h iＧl a A HＧ３t y p eI I Is e c r e t i o ns y s t e m e x p r e s s i o na n dr e g u l a t o r y n e t w o r k[J]．A p p l E n v i r o nM i c r o b i o l,２００９,７５(１９):６３８２Ｇ６３９２．D O I:１０．１１２８/AE M．００２２２Ｇ０９[５７]S u a r e zG,S i e r r a J C,K i r t l e y M L,e t a l．R o l e o fH c p,a t y p e６s e c r e t i o ns y s t e me f f e c t o r,o f A e r o m o n a s h y d r o p h i l a i nm o d uＧl a t i n g a c t i v a t i o no fh o s t i mm u n ec e l l s[J]．M i c r o b i o l o g y,２０１０,１５６(１２):３６７８Ｇ３６８８．D O I:１０．１０９９/m i c．０．０４１２７７Ｇ０[５８]S h aJ,R o s e n z w e i g J A,K o z l o v aE V,e t a l．E v a l u a t i o no f t h e r o l e s p l a y e d b y H c p a n dV g r G t y p e６s e c r e t i o n s y s t e me f f e c t o r s i n A e r o m o n a s h y d r o p h i l a S S U p a t h o g e n e s i s[J]．M i c r o b i o l o g y,２０１３,１５９(６):１１２０Ｇ１１３５．D O I:１０．１０９９/m i c．０．０６３４９５Ｇ０[５９]B r a u nV．B a c t e r i a l i r o n t r a n s p o r t r e l a t e d t o v i r u l e n c e[J]．C o n tＧr i b M i c r o b i o l,２００５,１２(１２):２１０．D O I:１０．１１５９/００００８１６９７[６０]N a j i m iM,L e m o sM L,O s o r i oC R．I d e n t i f i c a t i o no f i r o n r e g uＧl a t e d g e n e s i n t h e f i s h p a t h o g e n A e r o m o n a s s a l m o n i c i d a s u b s p．s a l m o n i c i d a:g e n e t i cd i v e r s i t y a n de v i d e n c eo f c o n s e r v e d i r o n u p t a k es y s t e m s[J]．V e t M i c r o b i o l,２００９,１３３(４):３７７Ｇ３８２．D O I:１０．１０１６/j．v e t m i c．２００８．０７．００８[６１]S t i n t z iA,R a y m o n dK N．A m o n a b a c t i nＧm e d i a t e d i r o na c q u i s iＧt i o n f r o mt r a n s f e r r i na n d l a c t o f e r r i nb y A e r o m o n a sh y d r o p h iＧl a:d i r e c tm e a s u r e m e n t o f i n d i v i d u a lm i c r o s c o p i c r a t e c o n s t a n t s [J]．JB i o lI n o r g C h e m,２０００,５(１):５７Ｇ６６．D O I:１０．１００７/ P L０００１０６５５[６２]H a n H J,T a k iT,K o n d o H,e ta l．P a t h o g e n i c p o t e n t i a lo f a c o l l a g e n a s e g e n e f r o m A e r o m o n a s v e r o n i i[J]．C a n JM i c r o b i o l,２００８,５４(１):１Ｇ１０．D O I:１０．１１３９/w０７Ｇ１０９[６３]L y n c hM J,S w i f t S,K i r k eD F,e t a l．T h e r e g u l a t i o no f b i o f i l m d e v e l o p m e n t b yq u o r u ms e n s i n g i n A e r o m o n a s h y d r o p h i l a[J]．E n v i r o n M i c r o b i o l,２００２,４(１):１８Ｇ２８．D O I:１０．１０４６/j．１４６２Ｇ２９２０．２００２．００２６４．x[６４]J a n d a J M,G u t h e r t zL S,K o k k aR P,e t a l．A e r o m o n a s s p e c i e s i ns e p t i c e m i a:l a b o r a t o r y c h a r a c t e r i s t i c sa n dc l i n i c a lo b s e r v aＧt i o n s[J]．C l i nI n f e c tD i s,１９９４,１９(１):７７Ｇ８３．D O I:１０．１０９３/ c l i n i d s/１９．１．７７[６５]K r z y m i n s k aS,K a z n o w s k iA,P u k M．I n t e r a c t i o no f A e r oＧm o n a s s p p．h u m a n i s o l a t e sw i t hm u r i n em a c r o p h a g e s[J]．N e w M i c r o b i o l,２００８,３１(４):４８１Ｇ４８８．D O I:１０．１０５３/j．a j k d．２００７．０２．１１８收稿日期:２０１７Ｇ０８Ｇ１８㊀编辑:王晓欢５６４５期刘亚东等:环介导等温扩增技术检测方法的研究进展。
