pLVX-ZsGreen1-C1慢病毒载体使用说明

慢病毒包装实验步骤及注意事项当下，基因编辑技术越来越火热，带动慢病毒包装实验越发普遍，但是大家通常在潜意识会觉得病毒载体包装过程太复杂而不敢尝试，确实，除去实验过程本身繁杂之外，做慢病毒包装实还经常容易出现各种状况，比如稳定性很差、滴度低，或者就是根本不出毒等等。

但是，热点可不等人，该来的迟早还是会来的，下面小编就为大家详细介绍一下慢病毒包装实验的基本步骤以及注意事项，希望大家能自己学会，掌握“核心”技术!慢病毒(Lentivirus)是一种逆转录病毒。

慢病毒在感染细胞时，首先会将宿主RNA逆转录为DNA，并将逆转录基因插入到宿主基因中表达。

慢病毒的基因表达系统是目前广泛使用的基因编辑操作工具。

以最常做的质粒共转染293T细胞为例，为了得到高滴度的慢病毒，慢病毒包装方法是利用表达载体与包装质粒共同转染细胞，在细胞中进行包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。

实验流程示意实验材料1)含有目的基因的病毒载体：一个包装质粒混合物(Mix=pMDL:VSVG:REV=5:3:2)和一个慢病毒载体质粒(LentiviralVector)组成;2)指数生长的293T细胞;(培养条件：DMEM+10%PBS，37℃，5%CO2)3) 试剂：胎牛血清、Opti-MEM、转染试剂实验步骤第一步：细胞分盘转染前一天,通过胰消化传代于35mm培养皿上,使细胞贴壁后所古面积达到培养皿总面积的80%以上)。

将细胞置于含5%CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。

第二步：病毒转染1) 转染前1h换液(用1.5mL完全培养基换掉旧的培养基)。

2) 制备包装质粒和目的质粒与转染试剂的混合物：取无菌1.5mL EP管，加入400µl 无血清Opti-MEM，加入1.5µg 核心质粒和1.5µg 病毒包装质粒，及6µl 转染试剂 (转染试剂：质粒=2:1)，充分混匀，静置15-20min。

慢病毒避雷指南病毒⼀直是基因转导研究中的⼀⼤利器，尤其慢病毒更是实验室的常客。

然⽽，慢病毒的存储不当或⽤量不合适，可能会导致转染效率低，细胞状态差等情况。

为了让慢病毒更好地为我们的实验服务，先来看看慢病毒使⽤过程中我们要注意哪些问题吧。

⾸先是慢病毒的安全和存储慢病毒相关实验需要在⽣物安全柜（BL-2级别）内进⾏操作，如果不⼩⼼溅出也不要惊慌，⽴即⽤ 70% ⼄醇加 1% 的 SDS 溶液擦拭⼲净即可。

接触过病毒的枪头，离⼼管，培养板等要⽤84 消毒液浸泡后统⼀处理。

病毒相关的废弃物也需要特殊收集再统⼀经⾼温灭菌处理哦。

慢病毒是存储在 -80 ℃的，如果您在收到慢病毒的⼀周内就会使⽤，也可放在 4 °C 保存，避免反复冻融，有必要可以先进⾏分装。

接下来就是慢病毒的使⽤了，⾸先需要摸索病毒感染的 MOIMOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常 MOI 越⾼，病毒整合到染⾊体的数量以及⽬的蛋⽩的表达量越⾼。

⽤ 96 孔板摸索梯度值：实验前⼀天，以每毫升 3~5 X 10^6 个⽬的细胞接种 96 孔培养板中的 12 个孔。

体积为 90 µL。

感染预实验共分为四组，每组三个不同梯度的 MOI。

实验开始，配备 1 X 10^8 TU/mL、1 X 10^7 TU/mL、1 X 10^6 TU/mL 病毒液。

将10 µL 三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。

加⼊的病毒量分别为 1 X 10^6 TU，1 X10^5 TU，1 X 10^4 TU，⽽细胞经过⽣长，此时细胞的数⽬⼤约为 1 X 10^4 个，所以三个孔的MOI 分别为 100、10、1。

感染 3~4 天后，观察荧光表达情况，通过细胞感染效果，确认⽬的细胞的感染条件和感染参数。

※每孔加病毒量（µL）=MOI X 细胞数/滴度（TU/mL） X 1,000确定了细胞的 MOI 值，下⾯就要开始进⾏细胞的感染我们推荐 1/2 ⼩体积感染法，即在正常培养液的⼀半量的情况下加⼊慢病毒，感染４ｈ后补⾜培养液⾄正常体积，感染 24 ｈ后换液。

慢病毒转染
1、实验前一天，以每毫升3-5×10 4个目的细胞接种96孔培养板中的12孔，体积为90ul。

（不使用边上的孔，保持细胞状态良好）
2、感染预实验共分为四组，每组三个不同的MOI：1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml
3、实验开始，配备1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml，如病毒滴度为1×108TU/ml，取5ul病毒液稀释到45ul的ENi.S.中，在进行一次10被稀释即可。

4、取2ul10mg/mlpolybrene稀释到400ul，备用。

5、将10ul三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。

6、再设定需要添加polybrene的孔中加入10ulpolybrene稀释液。

7、混匀后继续培养，8-12小时候观察细胞生长状态，并更换为新鲜培养基。

8、感染3-4天后，观察荧光表达情况。

9、通过细胞感染效果，确认目的细胞的感染条件和感染参数。

选取效果最优的一组实验条件按相同的实验方法进行正式转染实验。

慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。

转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%—90%，保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。

⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti—mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。

2.收毒(36—48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可.⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。

⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可）中。

4000rpm离心至所需体积。

⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装，-80℃冻存。

由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。

3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40％—50%，务必使用生长状态良好的细胞。

将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%—70%时可以再接毒一次。

4.检测及培养细胞系（48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。

如需培养成细胞系,可继续培养。

如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。