生物小分子巯基化合物荧光探针研究进展祝新月;王建西;张海霞【摘要】细胞内的小分子巯基化合物在诸多生理过程中扮演重要角色.分子荧光探针具有灵敏度高、选择性好、生物相容性好、实时原位监测等优点.因此,构建可以选择性检测巯基化合物的荧光探针具有重要的生物学和医学意义.根据荧光探针与巯基化合物的反应类型总结了近几年来小分子巯基化合物荧光探针的设计策略和研究进展.【期刊名称】《分析测试技术与仪器》【年(卷),期】2017(023)003【总页数】16页(P143-158)【关键词】分子荧光探针;巯基化合物;设计策略;研究进展【作者】祝新月;王建西;张海霞【作者单位】兰州大学化学化工学院,甘肃兰州 730000;兰州大学化学化工学院,甘肃兰州 730000;兰州大学化学化工学院,甘肃兰州 730000【正文语种】中文【中图分类】O657.3Abstract: Intramolecular small molecular thiols play key roles in biological processes. Fluorescent probes have the advantages of high sensitivity, good selectivity and biocompatibility, real-time monitoring in situ, etc. As a consequence, it is of great biological and medical significance to designand synthesize probes for selective detection of thiols. The review summarizes the various design strategies of fluorescent probes for the selective detection of biothiols in recent years according to the reaction types between probes and thiols.Key words: fluorescent probes; biothiols; design strategies; research progresses荧光分析法的最大优点是灵敏度高，其检出限通常比紫外分光光度法低2～4个数量级. 由于荧光分析法的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质，使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究等各个领域具有重要意义. 由荧光团和识别基团构建而成的荧光探针除了具有高灵敏度外，还具有高选择性、实时性、原位检测等特点，目前已被广泛应用于工农业、考古学、环境监测等方面. 随着生物技术的不断发展，传统的标记方法在蛋白质、核酸、细胞活体检测等方面已经不能完全满足需求，荧光探针在生物应用方面显示出了巨大的潜力. 研究开发高灵敏度、高选择性、生物相容性好的新型荧光探针成为化学领域的一个研究热点.细胞内的小分子巯基化合物主要包括谷胱甘肽、半胱氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸、高半胱氨酸和辅酶A等小分子. 其中谷胱甘肽是细胞内含量最高的巯基化合物. 巯基化合物在生物体新陈代谢过程中扮演着重要角色，它们通过在还原态和氧化态之间的平衡而维持着生命体系的氧化还原动态平衡[1]. 体内巯基化合物的含量异常与许多疾病密切相关，如癌症、心血管病、老年痴呆症、艾滋病等[2-6]. 因此设计合成能够选择性检测巯基化合物的荧光探针具有十分重要的生物学和医学意义.本文的综述重点集中于半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH),其结构如图1所示. 下面对用于识别这三种巯基化合物的荧光探针设计原理进行归纳.1.1 断裂磺酸酯2005年，Maeda等[7]利用亲核芳香取代反应合成的荧光turn-on探针1用于检测巯基化合物(如图2所示)，这是较早的断裂磺酸酯识别巯基化合物的报道. 探针1在4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)(10 mmol/L, pH 7.4)/乙醇 (体积比为200∶1)溶剂体系中与GSH在10 min内反应达到平衡，进而被用于测定胆碱酯酶的抑制活性.此后其他小组又陆续报道了断裂磺酸酯的巯基探针2-4(如图3所示)[8-10]. 探针2可在含有1 mmol/L溴化十六烷基三甲铵的磷酸缓冲液(pH = 7.4)中对巯基化合物进行检测，其中对GSH的识别最迅速，在100 min可以达到平衡，对其他含有巯基的化合物则需要250 min. 探针3在二甲基亚砜(DMSO)/磷酸缓冲液(PBS, 10 mmol/L, pH = 7.4),其体积比为50∶50的反应体系中与GSH作用5 mim,即可达到反应平衡. 探针4则可以在1 h内在仅含有1% 乙醇的磷酸缓冲液中实现对巯基化合物的检测.我们课题组合成了断裂磺酸酯的近红外硫醇探针5[11]和6[12]. 探针5在HEPES /DMSO(体积比为19∶1，10 mmol/L HEPES，pH 7.4)的体系中与硫醇作用后断开O-S键，继而发生分子内1，6-消除，释放出荧光团，实现荧光的off-on过程，10 min达到平衡. 该探针被成功地应用于活细胞，活体和不同组织中巯基化合物的成像(如图4所示).探针6在DMSO/PBS(10 mmol/L)，其体积比为9∶1的反应体系下与巯基化合物反应，在pH 5.5时对Cys、Hcy和GSH均有响应，对Cys的响应优于Hcy和GSH. 而当pH 3.5时，探针6可以选择性识别Cys，探针的细胞毒性很低，被成功地应用于活细胞内巯基化合物的成像.Malwal等[13]也应用该机理设计了硫醇探针7，并将其应用于人结肠癌细胞(DLD-1)细胞中巯基化合物的成像. 探针7与巯基在PBS中反应断开亚磺酸酯键，继而发生分子内1，6-消除释放出荧光分子，达到荧光turn-on效果(如图5所示).1.2 断裂磺酰胺2007年，Bouffard等[14]合成了一个选择性识别巯基化合物的荧光turn-on探针8(如图6所示)，并将其应用于细胞中的硫醇成像. 在HEPES (10 mmol/L, pH 7.4)中,硫醇和探针8的反应断开了2，4-二硝基苯磺酰胺，释放出苯胺供体，增强了荧光团的推拉电子效应，导致荧光量子产率的提高和吸收发射光谱的红移(158 nm).应用磺酰胺的断裂的原理，人们之后又开发了用于巯基化合物识别的探针9-11(如图7所示)[15-17].我们课题组也合成了断裂磺酰胺的双光子硫醇探针12[18]. 探针以N-丁基-萘酰亚胺为荧光团，以2，4-二硝基苯磺酰基为识别基团，哌嗪为连接基团. 探针12的双光子吸收截面为110 GM，具有良好的生物相容性和pH稳定性，被成功地应用于活细胞和组织(深度50～250 μm)内巯基化合物的成像(如图8所示).1.3 断裂Se-N键较早的关于Se-N键断裂识别硫醇的荧光探针工作是Tang等[19]2007年报道的. 巯基与探针13发生亲核取代反应，断开Se-N键，使荧光增强(如图9所示).文献报道在磷酸缓冲液(pH 7.4, 20 mmol/L) 中，探针对GSH的检测限为1.4 nmol/L，其灵敏度在当时是很高的. 该探针也与含巯基的蛋白质响应，包括硫氧还蛋白、谷胱甘肽还原酶和金属硫蛋白. 探针对它们的检测限比GSH高2～3倍. 探针13被应用于肝脏细胞(HL-7702)和肝癌细胞(HepG2)中巯基化合物的成像. 该课题组[20]在2009年又发表了一篇断裂Se-N键的硫醇探针14(如图10所示)，其在PBS (pH 7.4, 15 mmol/L)中对GSH的检测限更低：144 pmol/L.2012年，Wang等[21]报道了断裂Se-N键的硫醇近红外荧光探针15和探针16(如图10所示)，并将其应用于活细胞和组织成像.1.4 断裂S-S键早在1961年,Ellman等[22]就报道了用5, 5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(即二硫二硝基苯甲酸，Ellman试剂)来检测乙酰胆碱酯酶活性. 事实上大部分含巯基的化合物都可以断开二硫二硝基苯甲酸中的S-S键，二硫二硝基苯甲酸成为了应用最广泛的检测含巯基物质的试剂. 近年来人们开始利用断裂S-S键设计合成硫醇荧光探针.2008年，Pires等[23]合成了罗丹明110的荧光探针17(如图11所示). 它和硫醇反应后荧光明显增强，被成功地测定海拉(HeLa)细胞中GSH的含量变化. 巯基不仅断开了探针中的S-S键，而且由于巯基的亲核性，使邻近的氨基甲酸酯键断裂，释放出罗丹明110荧光团.此后，双硫键-氨基甲酸酯基团常被用来构建硫醇荧光探针. Lee [24]课题组利用此机理报道了硫醇的双光子荧光探针18(如图12所示). 探针在和硫醇反应后荧光强度增加10倍，在生理pH范围内很稳定，被用于HeLa细胞和鼠海马组织的成像(组织成像深度：90～180 μm).2015年，Wang等[25]合成了断裂S-S键的双模荧光探针19，通过S-S键和硫醚两个独立的相应的反应位点，实现对谷胱甘肽的选择性识别. 探针半胱氨酸/同型半胱氨酸作用时，其二硫键被切断，发生分子内环化，脱除临位的碳酸酯，释放出羟基. 同时，半胱氨酸/同型半胱氨酸对硫醇位点进行亲和取代，发生分子内重排，形成氨基取代的氟硼吡咯，发射黄色荧光. 而由于谷胱甘肽的空间位阻较大，不发生分子内重排，形成亚磺酰取代的氟硼吡咯，发射紫色荧光，从而实现选择性识别谷胱甘肽(如图12所示).Cao等[26]合成了断裂S-S键的比率荧光探针20(如图12所示). 它将卟啉和香豆素两个荧光团结合在一起，和硫醇反应后断开S-S键，改变了两个荧光团之间的FRET效应，实现了对硫醇的比率荧光响应，可以用于活细胞中巯基化合物的比率成像.1.5 断裂Se-Se键有文献报道称硫醇断裂Se-Se键的反应速率比断裂S-S键快得多[27]. 2013年Lou等[28]报道了断裂Se-Se键的硫醇荧光探针21(如图13所示). 它可以快速地检测硫醇和监测活细胞内硫醇和活性氧的氧化还原变化.由于巯基具有亲核性，所以含巯基化合物可以和α，β-不饱和羰基发生亲核加成反应. 常见的迈克尔受体有马来酰亚胺、方酸等[29].马来酰亚胺作用于荧光团后，由于n，π*电子转移效应使探针的荧光量子产率降低，当巯基和双键加成饱和后消除了该效应，使荧光团荧光恢复(如图2所示). Matsumoto等[30]合成了一个氟硼吡咯(BODIPY)的探针22(如图14所示). 荧光团的荧光被马来酰亚胺的光致电子转移(photo induced electron transfer, PET)效应猝灭，和硫醇反应后荧光恢复. 有趣的是，马来酰亚胺对BODIPY有效的PET 取代位点在邻位，间位和对位的取代物荧光很强. 邻、间、对位取代物的荧光量子产率分别为0.002、0.37和0.54. 因此，邻位取代探针和硫醇响应后荧光增强350倍.我们课题组也得到了相似的结论[31]. 该工作通过理论计算研究了位置异构对光致电子转移效率的影响. 试验结果表明取代基顺丁烯二酰亚胺基团与萘酰亚胺荧光团之间的相对位置对探针的荧光性能有非常重要的影响，邻位取代的异构体探针相对于间、对位取代的异构体展示出了更优越的荧光开关性能. 探针23具有优良的光学稳定性，pH稳定性，良好的细胞穿透性，低细胞毒性和对含巯基分析物的特异性，被成功地应用于血浆中巯基含量的定性定量检测，及对细胞中的内源性和外源性巯基进行快速的成像.Sreejith等[32]报道了一个方酸染料的近红外荧光探针24. 一般方酸在长波(620～670 nm)处有强烈的吸收(消光系数≥ 105 cm-1 M-1). 在该近红外探针中，将方酸用吡咯扩展π共轭体系后，吸收和发射进一步红移至近红外区(λabs=730 nm,λem=800 nm). 探针和硫醇响应后光谱从近红外区蓝移到可见光区(λabs=440 nm, λem=592 nm). 该探针被应用于评估人血浆中硫醇的浓度，并确认了抽烟会引起血液中硫醇含量的增高(如图15所示).上述原理构建的探针对Cys、Hcy和GSH都可以响应，但是却不能区分识别这三种巯基化合物. 由于这三种巯基化合物在生物体内的生理功能各有不同，所以区分识别这三种巯基化合物具有重要的生物化学意义. 鉴于这样的重要性，人们开发了一些区分识别这三种巯基化合物的荧光探针设计合成的方法.近年来，人们报道了不少基于醛基的环化反应设计合成的荧光探针来识别巯基化合物. 这种类型的探针基本上都用于Cys和Hcy的检测. 因为Cys和Hcy分别为1，2-或1，3-氨基硫醇，与醛基作用后可以形成五元或六元环. 而其他的硫醇如GSH 则不能发生这类环化反应. 这类探针的作用机理如图16所示.2008年，Lin等[33]报道了一个醛基环化的比率荧光探针选择性响应Cys/Hcy(如图17所示). 探针25自身在519 nm处有一个发射峰，是因为富电子的菲并咪唑(供体)和缺电子的醛基(受体)之间的分子内电荷转移(ICT)效应所致. 它和Cys/Hcy反应后，由于消除了ICT效应，产生很大的发射位移(125 nm). 大部分基于醛基的荧光探针对Cys和Hcy有着相似的响应情况. 然而，在2005年Wang小组[34]用商用的肉桂醛衍生物证明了α，β-不饱和醛可以选择性检测Cys而对Hcy没有响应. 2011年，Yuan等[35]又报道了一个香豆素的α，β-不饱和醛探针26，对Strongin小组的发现做了进一步的阐明.Cys和丙烯酸酯的加成环化反应早在1966就被应用于有机合成. 如图18所示，硫醇先和探针中的烯键发生加成反应生成硫醚. Cys和Hcy可以进一步环化释放出荧光团，而GSH产生的硫醚很稳定，不能进一步环化. Cys的环化过程生成七元环，而Hcy则生成八元环. 八元环的张力比七元环要大的多，需要的活化熵也更高，所以七元环的形成速率比八元环要快得多，从而达到探针对Cys的选择性识别. 从2011年开始，常见荧光团(如荧光素、羟基化的香豆素、萘酰亚胺和花菁类等)的丙烯酸酯类荧光探针不断被报道[29].2015年，我们课题组合成了丙烯酸酯的半花菁类可视化近红外荧光探针27[36] . 该工作测定了探针与Cys、Hcy和GSH的响应动力学，很好地验证了探针对Cys 的选择性响应机理，并将探针应用于检测人血清中的Cys含量和活细胞成像(如图19所示).自然化学连接(NCL)反应广泛应用于多肽和蛋白质合成. 如图20所示，NCL有两个过程：第一个过程是一个带有硫酯末端的多肽和一个带有硫醇末端的多肽发生硫酯化传递过程，得到一个新的硫酯化中间体，这是一个可逆过程. 紧接着中间体发生不可逆的分子内S，N-重排过程，在连接位点得到酰胺化产物.2014年，Yang等[37]报道了一个利用NCL反应的分子内质子转移(excited—state intramolecular proton transfer, ESIPT)和光致电子转移机理的双发射荧光探针28(如图21所示). 该探针可以同时区分检测GSH和Cys/Hcy，传感后的发射峰相互分离(>130 nm). 这种现象是因为探针与GSH和Cys/Hcy作用后得到的硫酯中间体发生S，N-重排的速率不同. 该探针被应用于MDA-MB-231细胞和人血清中Cys和GSH的同时检测以及肝癌细胞成像.芳香取代重排机理的探针和Cys/Hcy发生亲核取代作用后，可以紧接着发生分子内的重排过程通过五元或六元过渡态形成氨基化产物，而和GSH则只能发生亲核取代反应，不能再发生分子内的重排，从而实现对三种巯基化合物中某一或两种的选择性识别，如图22所示. 构建这类探针有两点要求：(1)必须带有亲电位点能和巯基发生反应；(2)探针与巯基反应前后光学性质应有明显区别.2015年，Xu等[38]合成了可视化比率荧光探针29(如图23所示)，探针可以选择性地检测和成像细胞内的GSH. 探针和GSH作用后发射红移，而和Cys/Hcy作用后发射蓝移，从而实现了同时区分识别GSH和Cys/Hcy.超分子化学作用如氢键，静电作用也可以被用来构建荧光探针而且可以在一定程度上提高对某种硫醇的选择性.Zhou等[39]利用迈克尔加成和静电作用结合起来设计的荧光探针30(如图24所示)，该探针对Cys具有高选择性. 由于二乙胺基(供体)和吡啶(受体)之间的ICT过程，探针自身荧光很弱，和Cys反应后在500 nm处的荧光增强148倍. 而与Hcy和GSH反应后荧光强度分别只有13和9倍的增强. 动力学分析得到探针和Cys的反应速率比Hcy快115倍，比GSH快36倍. 由此证明了探针对Cys的高选择性是由于带正电的探针和负电的Cys之间的静电作用.2014年，Ik等[40]报道了超分子氢键作用来选择性识别GSH的荧光探针31(如图25所示). 探针以硝基烯键为巯基的反应位点，以18-冠醚基团为超分子氢键作用位点. 在pH 6.0下，探针与GSH作用后荧光发射明显增强，而与等浓度的Cys和Hcy作用变化不大. Cys/Hcy与探针反应后的加合物中，硫醚和氨基之间的连接基较短，不能和冠醚之间产生氢键作用，所以无法消除PET的荧光猝灭作用.还原叠氮基团的机理通常用来构建识别H2S的荧光探针[41]. 而Peng等[42]利用还原叠氮的机理构建了一个丹磺酰叠氮的探针32(如图26所示)，实现了对Hcy的选择性检测. 巯基进攻探针的叠氮基团形成中间体，中间体经过质子转移中和N 上的负电荷，通过分子内环化过程失去一分子N2得到磺胺荧光产物. Hcy的环化产生五元环产物，可以再和一分子硫醇反应生成二硫化物. 而Cys的环化只能产生四元环产物，四元环的张力较大，不稳定所以产生四元环产物的过程很不容易发生. 从而实现了探针对Hcy的选择性识别.2015年，Liu等[43]报道了双迈克尔加成/逆羟醛缩合串联反应的探针33(如图27所示)，实现了对Cys的选择性识别，并被应用于检测人血清中的Cys含量和活细胞中的Cys成像. 由于氟硼吡咯部分的吸电子作用，探针中的炔基具有很好的亲电反应活性. 探针与Cys的巯基和氨基发生两次的迈克尔加成得到一个具有五元环的中间体，接着发生逆羟醛缩合反应得到强荧光的氟硼吡咯. Hcy、GSH如果发生双迈克尔加成则分别生成具有六元环和十元环的中间体，然而这样的过程从动力学上看是很难进行的. 作者通过试验证明了探针与Hcy和GSH的反应产物为一次迈克尔加成的加合物，并不能发生类似于Cys那样的串联反应过程，从而实现了探针对Cys的选择性识别.点击化学反应也被应用于巯基化合物探针的设计合成，但报道的文献较少. Yin课题组[44-45]分别在2013年和2016年设计了两个巯基-色烯点击化学的荧光探针34和35，探针与硫醇的作用产物可以和Cu2+、Cd2+、Hg2+作用再生为34.该探针被应用于人血浆中巯基化合物的检测和HepG2细胞成像. 探针35和Cys的荧光响应较Hcy和GSH强得多，可以选择性地检测Cys并被应用于HepG2细胞成像(如图28所示).从上述研究进展来看，近十年来关于小分子巯基化合物的荧光探针已经报道了很多. 它们大多是基于巯基的亲核性设计而成. 将一些化学反应联合使用以及将化学反应和超分子作用结合也提高了探针的选择性. 然而，能够在复杂生物环境中选择性检测小分子巯基化合物的探针的设计合成工作仍然存在很多挑战. 比如，探针在含巯基化合物的实际生物样品检测中可能受很多物质(如含巯基的蛋白、内生的H2S)的干扰. 未来小分子巯基化合物荧光探针的研究方向可以集中在以下4个方面：(1)由于近红外光的生物应用优势，要设计更多近红外荧光探针；(2)将具有高基质选择性和特异性的酶应用于高选择性探针的设计合成工作中；(3)设计更多具有细胞器、组织、器官特异性靶向的探针；(4)设计可以原位指示组织器官病变(如肿瘤)过程的探针以达到治疗诊断目的.【相关文献】[1] Finkelstein J D, Martin J J. Homocysteine [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2000, 32:385-389.[2] Jones D P, Carlson J L, Mody Jr V C, et al. Redox state of glutathione in human plasma[J]. Free Radical Biol Med, 2000, 28: 625-635.[3] Kemp M, Go Y M, Jones D P. Nonequilibrium thermodynamics of thiol/disulfide redox systems: A perspective on redox systems biology[J]. Free Radical Biol Med, 2008, 44: 921-937.[4] Finkel T, Holbrook N J. 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