ELISA操作原理、步骤及注意事项
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。
1 标本的采取和保存
可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液、分泌物和排泄物）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂（见3.2.4）。
2 试剂的准备
按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
3 加样
在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
(完整word版)ELISA实验前的注意事项
ELISA实验前的注意事项
为了帮助您更好地解决在实验中可能碰到的各种问题，我们设计了这些问题指导,配以试剂
盒内的说明书一起供您参考使用.很多因素都将导致免疫测定实验的失败,而大多数技术
失误是可以通过全面阅读和准确理解说明书以及实验步骤来避免的。若对试剂盒内的说明书有任
何意见和建议,欢迎反馈。我们期待听到您的声音，从而完善我们的产品，更好
地为您服务。
◆ 仔细阅读说明书
◆ 检查试剂盒标签上的有效期。如果超过有效期，请勿使用。
◆ 按说明书确定所有试剂齐全(数量、体积）
◆ 标本制备要规范，每份标本体积要按2—3个复孔以上的量制备（贮存)，尽量分装做备份。
短期内无法实验者,注意低温保存
◆ 准备好所有实验额外所需物品, （比如移液器，试管，清洗器， 酶标仪）
◆ 按说明书将所用试剂平衡至室温,根据检测标本数量确定所需试剂的量
◆ 检查试剂盒内每种试剂的贮存条件,保证所有试剂均按照试剂盒内说明书推荐的条件存储。
◆ 检查不稳定或者变质的试剂溶液(比如沉淀或变色）.有些试剂，比如标准品稀释液或者检
测稀释液,可能在设计时就含有沉淀物。所有试剂在滴入酶标板之前，必需充分混匀。而由 (完整word版)ELISA实验前的注意事项
于沉淀物的特性,在加入酶标板之前,必需不停搅拌。
◆ 保证充分的孵育时间和温度。
◆ 切勿使用不同生产批号的试剂取代现有试剂或混合现有试剂。
◆ 在混合或溶解蛋白溶液时，避免泡沫产生。
◆ 在实验开始之前，安排好实验流程。
◆ 在实验开始之前，清洁工作台.
◆ 若有问题，应与我公司或代理商的技术支持联系
洗板方法( Washing Techniques)
任何一个成功的ELISA检测，正确的洗板方法是非常关键和重要的一方面.连贯的洗板也是
很有必要的。在稀释浓缩洗涤液时，请使用去离子水或者蒸馏水。
◆ 洗涤瓶或多通道移液器
1. 蛋白包板：选择合适的蛋白包被浓度梯度，计算上样体积并用包被液稀释（50 μl/孔）。
2. 4 ℃过夜或者37 ℃ 孵育2 h。
3. 用PBST洗涤2～3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
4. 封闭：
（1）新配1～2% BSA或 5% 脱脂奶粉（都用PBS配制）
（2）上样量 100μl/孔
（3）37 ℃ 孵育1～2 h
（4）作用：封闭未被蛋白结合上的位点，防止待测抗体与板上空白位点的结合，减少
非特异性反应。
5．用PBST洗涤2～3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
6. 封闭期间完成一抗的浓度梯度选择和稀释:
（1）用新配1% BSA 对一抗进行稀释（BSA可以中和一抗中可能存在的抗BSA的抗
体，降低非特异性反应），计算所需稀释液体积后配制。
（2）上样量 50μl/孔
（3）空白对照和阴性对照孔加等体积PBS
（4）37 ℃ 孵育1 h
7．用PBST洗涤3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
8. 一抗孵育期间配制酶标二抗稀释液
（1）用新配1% BSA进行稀释，计算所需稀释液体积后配制（一般1:5000）
（2）上样量 50μl/孔
（3）阴性对照孔也加等体积二抗稀释液
（4）37 ℃ 孵育45min～1 h(同一批次二抗孵育时间必须固定，如1h)
9. 用PBST洗涤3～4次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
10.显色：
（1）A液和B液等体积混合，在使用前需在室温下放置30 min。
（2）上样量 100μl/孔，计算用量：96孔×100 μl/孔= 10 ml/板（A：B= 5ml: 5ml）
（3）空白对照孔和阴性对照孔也加等体积显色液
（4）显色液上样速度一定要快速并保持匀速
（5）37 ℃ 孵育10 min或者室温避光15 min(从加完第一块板即开始计时)
利用ELISA法检测乙肝五项操作过程中的几点注意事项
【中图分类号】R512.6+2 【文献标识码】B 【文章编号】1672-5085(2009)13-0236-02
目前，临床乙肝五项检测一般采用ELISA法，因为ELISA法是当前灵敏度较高，特异性较好的方法，被临床广泛认可，而且操作非常简单。但在操作过程中各个环节对检测结果影响较大。望广大检验工作者引起高度重视，要严格遵守操作规程。一般涉及标本的采集和保存、试剂的选择和准备、加样、浴温、冲板、显色、比色各步骤。
下面将操作过程中各个环节的注意事项做以下简介：
1 标本的采集及保存
采血管，优点是既可以预防血液中的气溶胶粒子在空气中传播，对工作人员造成危害，又可以防止标本被污染。采血过程一定按无菌操作，保证采血顺畅,不要进行剧烈震荡，避免产生溶血现象，因溶血标本或长菌标本会造成假阳性结果。血液标本采集后要使其充分凝固再分离血清，最好放置1小时，然后再用3000rmp离心15分钟，若当天检测可以放在室温，如果在次日或几天内检测，可分离血清后，放在2-8℃冰箱内保存，用时提前取出，恢复至室温温度时方可检测，如果长时间保存，必须分离血清后置于-20℃低温冰箱内密封保存，用时先置于2-8℃冰箱中使之溶解，然后在室温下使之全溶，方可使用。
2 试剂的选择及准备
选择质量优质的试剂盒，严格阅读使用说明书，操作前将试剂在室温平衡30分钟，目的主要是为了保证试剂及反应微孔在后面浴温过程中能够较快达到所要求的温度，稀释洗板液所用蒸馏水或去离子水一定要保证质量，而且要当天用当天配制。
3 加入样本及反应试剂
血清或血浆标本一定要分离好，决不能将纤维蛋白原或血球带入反应微孔中，避免出现假阳性或假阴性。加样器必须经过校准；加样速度不可以太快，加样太快无法保证微量加样器的准确性和均一性；避免加在孔壁上部，加在孔壁上部的非包被区易导致非特异性吸附；避免样本溅出或产生气泡，溅出会对邻近孔造成污染，出现气泡则反应液界面有差异。在手工操作中，如果标本过多要分批检测，因为加样过多会造成放入浴箱前等待时间过长，特别是室内温度较高时。在滴加试剂时一定注意滴加的角度和速度，滴加太快容易出现重复滴加或加在两孔之间，这样会在孔内非包被区出现非特异吸附，而引起非特异显色。加样完毕后及时封板、震荡、放入浴箱。注意震荡的速度不易过快，避免样本溅到封条上影响反应效果，而且在揭封时容易把封条上的溅滴污染到邻孔。
