分子生物学综合试验报告综合实验Ⅰ.Southern杂交（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、地高辛标记的Southern杂交）一.实验目的1.学习Southern杂交的原理及操作方法。
2.学习碱裂解法提取质粒的原理。
3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。
4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。
二.实验原理利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。
PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。
DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。
最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。
对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。
一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。
通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。
分子生物学实验室的常规仪器设备及有关操作一、验室的常规仪器、设备(一) 温度控制系统：1. 冰箱: 根据药品、试剂及多种生物制剂保存的需要，必须具备不同控温级别的冰箱,最常使用的有:4℃、-20℃、—80℃冰箱。
4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等。
—20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等.—80℃适合某些长期低温保存的样品、纯化的样品、特殊的低温处理消化液等的保存。
0-10℃的冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。
2．液氮罐：有些实验材料、某些器官组织、细胞株、菌株及纯化的样品等，要求速冻和长期保存在超低温环境下,就需要一个液氮罐(—196℃）具有经济、省力和较好地保持细胞生物学特性的优点.3．培养箱：37℃恒温箱用于细菌的固体培养和细胞培养。
CO2培养箱适用于培养各种细胞,可恒定地提供一定量的CO2（通常5%），用来维持培养液的酸度（pH值）。
37℃恒温空气摇床可进行液体细菌的培养。
4。
水浴锅：用于保温.25-100℃水浴摇床可用于分子杂交试验，各种生物化学酶反应等试验的保温。
25—100℃水浴箱用于常规试验.5. 烘箱：主用于烘干实验器皿，有些需要温度高些,有些需要温度低些。
用于RNA方面的实验用具，需要在250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在42—45℃的烤箱中进行烘干。
(二）水的净化装置：随着分子生物学的飞速发展，许多实验对水纯度的要求越来越高。
1。
蒸馏水皿：单蒸水常难以满足实验要求。
双蒸水、三蒸水配液，许多实验要去离子水。
多次蒸馏水可除去水中挥发性杂质,不能完全除去水中溶解的气体杂质(Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Mo(Ⅵ)）。
2. 离子交换器：去离子水—用离子交换法制取的水，称去离子水。
去离子效果好，但不能除去水中的非离子型杂质，其中常含有微量的有机物（树脂等）。
3．超纯水：用蒸馏水、离子交换水、反渗透纯水做为供水，磁铁耦合齿轮泵作用使水循环.用于PCR、PCR氨基酸分析、DNA测序、酶反应、组织和细胞培养等。
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
实验一分子生物学实验室常用仪器设备简介一、实验目的熟悉分子生物学实验室常用仪器并熟练使用二、实验原理1、恒温气浴摇床：用于对温度和振荡频率有较高要求的细菌培养，发酵，杂交，生化反应及酶和组织研究等。
2、超净工作台：用于分子生物学无菌操作。
3、低温台式高速离心机：用于分离纯化DNA和蛋白质等，如基因片段的分离，蛋白酶的沉淀和回收等。
4、微量移液管：是连续可调的，计量和转移液体的专用仪器，其装有直接读数容量计。
有多种规格：①0.5-10μL②10-100μL③20-200μL④100-1000μL。
5、电泳仪：用于确定大分子物质的分子量以及鉴定物种亲缘关系的仪器。
6、PCR仪：用于目的基因的扩增，是一对寡糖核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列DNA片段。
主要用于基础研究和应用研究等领域。
7、灭菌锅：用于细菌和细胞培养及核酸等有关实验使用的试剂，器皿及实验用具的严格灭菌。
三、实验仪器恒温气浴摇床、超净工作台、低温台式高速离心机、微量移液管、灭菌锅、PCR仪、电泳仪。
四、实验步骤（一）、恒温气浴要穿的使用：1、样品瓶牢固放入弹簧夹中2、接通电源开关，仪器进入准备状态3、参数设定，（设定温度、时间、转速等参数）4、按启动键仪器开始工作，按暂停键可暂停托盘的旋转；5、按电源键，显示屏显示消失，关闭电源总开关（二）、超净工作台的使用1、使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。
2、接通电源，提前30分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的微生物，15分钟后，关闭紫外灯，开启送风机。
3、工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰。
4、操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。
5、最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。
（三）、低温台式高速离心机的使用1、把离心机放置于平面桌或平面台上，目测使之平衡，用手轻摇一下离心机，检查离心机是否放置平衡。
