免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞及向神经细胞定向分化

骨髓间充质干细胞向神经细胞诱导分化的研究进展
苗壮;孙晓玲;庞希宁
【期刊名称】《解剖科学进展》
【年(卷),期】2003(9)3
【摘要】骨髓间充质干细胞的研究近年来已取得了很大突破 ,由于其广泛的分化潜能及转基因的简便易行 ,已成为细胞治疗中最具发展潜力的细胞来源之一 ,具有很
大的应用价值。

骨髓间充质干细胞除能被诱导产生多种间充质细胞类型外 ,最近还发现它几乎不受胚层起源的限制,在实验动物模型或体外培养中使用特定的培养基、诱导剂 ,在一定条件下 ,即可向神经细胞和神经胶质细胞分化。

未来将可能应用自
体骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞 ,临床治疗各种神经细胞损伤性疾病。

【总页数】4页(P258-261)
【关键词】骨髓间充质干细胞;神经细胞;细胞分化;研究进展;神经元
【作者】苗壮;孙晓玲;庞希宁
【作者单位】中国医科大学卫生部细胞生物学重点实验室;沈阳东方医疗服务集团
辅助生殖研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】Q813
【相关文献】
1.骨髓间充质干细胞向神经细胞体外诱导分化的研究进展 [J], 张海垠;冯继;周益民
2.体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究进展 [J], 项正兵;吴晓牧
3.体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究进展 [J], 王荣桃;余资江
4.体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究进展 [J], 郑蕊;廖承德;丁莹莹
5.骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展 [J], 熊怀林;杨朝鲜;范光碧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。

原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。

本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。

一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。

2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。

3.胎牛血清：用于细胞培养。

4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。

5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。

6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。

二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。

2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。

离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。

3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。

4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。

5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。

2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。

传代后的细胞继续培养至所需细胞量。

3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。

4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。

四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。

2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。

3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。

免疫磁珠分离法分选提纯骨髓造血干细胞CD117【摘要】目的：探讨用免疫磁珠分离法从小鼠股骨、胫骨分离纯化骨髓造血干细胞CD117的方法。

方法：收集小鼠骨髓细胞, 台盼蓝染色观察其活力，用免疫磁珠分离法分选CD117细胞,流式细胞仪检测荧光标记CD117表达阳性率。

结果；未分选前CD117细胞纯度为(±)%，MACS分选CD117细胞纯度(±)%，纯化前后有明显差异。

结论： MACS阳性选择法分选系统能有效分选骨髓造血干细胞CD117。

【关键词】造血干细胞 CD117+细胞免疫磁珠分离法小鼠近交BALBC造血干细胞研究面临的首要问题是获得大量纯化的造血干细胞,并去除杂质细胞对实验的干扰[1，2]，近年在纯化技术方面的研究不多，尤其是对小鼠的研究较少。

C Kit 或干细胞因子受体SCFR是小鼠HSCs的主要标志，2006年采用免疫磁珠分离法(MACS)分选骨髓造血干细胞亚群CD117，并用流式细胞仪进行计数，希望为造血干细胞的纯化和大量制备提供实验方法和理论支持。

1 材料和方法实验动物BALB/C小鼠,(20±1)g,雌雄随机,10只/组，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。

试剂和仪器BSA购自杭州四季青生物工程材料研究所,荧光标记小鼠抗体CD117PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱，均购自Miltenyi Biotec公司,流式细胞仪(FACS Calibur)购自BD公司。

实验方法小鼠骨髓细胞收集颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠股骨、胫骨，放在盛有缓冲液的平皿中，去除骨上的肌肉组织及骨膜，切除骨的两末端，用1 ml注射器插入股骨膝盖端、胫骨骨端，用缓冲液反复冲洗骨腔，直至骨发白，所得细胞过200目滤网，1 500 r/min离心10 min，小心去除上清液，加入5 ml缓冲液混匀，进行细胞计数。

MACs分离CD117细胞小鼠系别细胞去除用缓冲液按40μl/107个细胞重悬小鼠骨髓细胞。

骨髓间充质干细胞体内定向分化为神经元样细胞的研究张运克;张丹
【期刊名称】《河南中医》
【年(卷),期】2009(29)9
【摘要】虽然骨髓MSC具有广阔的应用前景,但是还有许多问题没有解决。

进一步探索决定其分化的关键基因,发现影响其向其他谱系细胞分化的细胞、免疫、分子学机制,找到调控移植细胞迁移和整和的方法等。

【总页数】4页(P932-935)
【关键词】骨髓间充质干细胞;神经元样细胞;中药诱导
【作者】张运克;张丹
【作者单位】河南中医学院第一附属医院;开封市中医院
【正文语种】中文
【中图分类】R322.81
【相关文献】
1.体外定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞 [J], 孙伟;胡亮;赵兴;李官成;付炳方;潘颂华
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4.定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞及神经元样细胞的研究 [J], 汪
浩文;何志旭;王志华;刘俊峰
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世界最新医学信息文摘 2019年 第19卷 第101期73投稿邮箱：zuixinyixue@·临床研究·人骨髓间充质干细胞原代提取及成神经诱导分化杨华1，吴雷2，孙赛男3，孙博谦1，王玲玲1，3（1.北华大学附属医院 神经内科，吉林 吉林 132013；2.吉林市中心医院 心胸乳甲外科，吉林 吉林132602；3.北华大学附属医院 精准医学中心，吉林 吉林 132013）0　引言运动神经元病为神经系统死亡率、致残率均较高的疾病，患者在病程中可表现为脊髓前角细胞受损、脑干运动神经元缺失以及皮质锥体细胞和锥体束等单一损伤或累加症状。

目前尚无有效药品能阻止运动神经元病的进展，患者多在5年内死亡，为此国内外学者将治疗方案寄希望于神经细胞移植以及神经细胞的自体修复，研究结果提示间充质干细胞可以在受损的脑组织及脊髓中生存、增殖、迁移及分化成神经样细胞。

本研究旨在探讨间充质干细胞原代提取的方法及细胞诱导分化能力，为自体细胞移植奠定基础。

1　资料和方法1.1　主要试剂。

DMEM/F12培养液（Gibco ），胎牛血清（Hyclone ），抗CD14、CD19、CD45、HLA-DR 及CD73、CD90、CD105单克隆抗体，碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子购自中国碧云天生物技术公司。

《骨髓、脐带血细胞处理试剂盒》来源于加拿大威尔森公司。

其他试剂均由北华大学附属医院脑血管病研究所提供。

1.2　间充质干细胞的分离和培养。

日间手术室取患者髂前上棘5 mL 骨髓液注入15 mL 无菌离心管培养液内。

按加拿大威尔森公司研制的《骨髓、脐带血细胞处理试剂盒》说明书进行骨髓有核细胞混悬液的制备及细胞计数。

所获得的细胞沉淀使用含10%胎牛血清的 DMEM/F12（100 u/mL 青霉素和100 u/mL 链霉素）培养液重新制成单细胞悬液，接种于培养瓶中，在5%CO 2，37℃，饱和湿度的培养箱中培养，培养3 天后进行首次换液，弃去未贴壁细胞，后续2-3天换液1次，待细胞融合达80%以上使用0.25%胰蛋白酶进行消化并传代培养。

磁珠分离技术摘要：磁珠分离技术是一种分子生物学分离技术, 它利用其表面修饰的磁性颗粒对生物分子或细胞的亲和结合而进行分离，能对待分离或待检测的靶标进行高效富集, 是一种方便、快速、回收率高、选择性强的方法。

磁珠分离技术在生物学方面的应用始于20世纪70年代后期, 目前已经在分子生物学、细胞学、免疫学、微生物学、生物化学等领域取得一些令人瞩目的研究成果。

基本概念磁珠磁珠是一种通过一定方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的体积在几纳米到几十微米之间的载体微球。

载体微球的核心为金属小颗粒，常为铁的氧化物或铁的硫化物, 核心外包裹一层高分子材料, 最外层是功能基团,载体微球表面可根据需要赋予不同的功能基团(如－OH、－COOH、－CHO、－NH2,-SH、—CONO2、—CONH2、—SO3H、—SiH3、—环氧基、-CHCl等),使其表现具有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不同物理性质.同时具有磁响应性，在外磁场作用下具有磁导向性。

由于载体微球表现的物理性质不同, 可结合不同的免疫配基，如抗体、抗原、DNA、RNA 等。

应用于磁分离技术的磁性载体微球应具备以下特点：粒径比较小，比表面积较大，具有较大的吸附容量；物理和化学性能稳定，具有较高的机械强度，使用寿命长；具有可活化的反应基团, 以用于亲和配基的固定化; 粒径均一, 能形成单分散体系; 悬浮性好, 便于反应的有效进行。

载体微球有纳米级、微粒级的，纳米级的载体微球与微粒级的载体微球相比具有以下优点: 尺寸小, 扩散速度快，悬浮稳定性好; 比表面积大，偶联容量大；超顺磁性, 能快速实现磁性粒子的分散与回收。

磁珠的制备方法:共沉淀法、悬浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋法及原子转移自由基聚合法等。

免疫磁珠免疫磁珠(Immunomagnetic bead, IMB) 简称磁珠，免疫磁珠由载体微球和免疫配基结合而成。

干细胞分选磁珠一、引言干细胞研究作为现代医学的热点领域，对于疾病治疗、再生医学等方面具有重要意义。

在干细胞研究中，干细胞分选是关键技术之一，而磁珠分选法则是其中应用广泛且效果显著的一种方法。

本文将详细介绍干细胞分选磁珠的原理、应用及优势，以期为相关领域的研究者提供有价值的参考。

二、干细胞分选磁珠的原理干细胞分选磁珠是一种基于免疫磁珠技术的分选方法。

其原理是利用磁珠表面包被的特异性抗体与干细胞表面的抗原结合，形成磁珠-干细胞复合物。

在外加磁场的作用下，磁珠-干细胞复合物发生定向移动，从而实现干细胞的分离和纯化。

磁珠分选法具有操作简便、分离纯度高、对细胞活性影响小等优点，因此在干细胞研究中得到了广泛应用。

三、干细胞分选磁珠的应用1. 干细胞基础研究：在干细胞基础研究中，干细胞分选磁珠可用于从复杂的细胞群体中分离出目标干细胞，以便于后续的实验操作和分析。

例如，研究者可以利用磁珠分选法从胚胎干细胞、成体干细胞等不同类型的干细胞中分离出具有特定表面标志物的细胞亚群，进而研究这些细胞亚群的生物学特性和功能。

2. 疾病治疗：干细胞治疗作为一种新兴的治疗手段，在许多疾病的治疗中显示出巨大的潜力。

干细胞分选磁珠在治疗过程中发挥着重要作用。

通过磁珠分选法，研究者可以从患者体内或捐赠者体内分离出具有治疗作用的干细胞，经过体外扩增和修饰后，再回输给患者，从而达到治疗疾病的目的。

3. 药物筛选：在药物研发过程中，干细胞分选磁珠可用于构建体外药物筛选模型。

研究者可以利用磁珠分选法从干细胞库中筛选出具有特定药物反应性的干细胞，进而在体外模拟药物对干细胞的作用，从而评估药物的疗效和安全性。

这种方法可以大大提高药物筛选的效率和准确性，为新药研发提供有力支持。

四、干细胞分选磁珠的优势1. 高分离纯度：干细胞分选磁珠利用特异性抗体与干细胞表面抗原的结合原理，可以实现干细胞的高纯度分离。

这有助于减少后续实验中的干扰因素，提高研究结果的准确性。