体外分析技术 讲义- 中国医科大学

第五章体外分析技术第一节放射免疫分析的基本原理放射免疫分析的基础是抗原和相应的抗体能进行特异性结合。

放免分析体系中有两种抗原，即未标记抗原（Ag)和标记抗原（*Ag),两者都与抗体（Ab）有相同的结合能力，且两者的总和大于抗体的量，两种抗原与抗体的结合将彼此竞争，互相抑制。

反应体系中每管所加*Ag和Ab量相同，而Ag量不同，随着Ag量的增加，*Ag与Ab的结合（B）将减少，经实验和理论证明，B与Ag量成函数关系。

在实际的反应体系中有两种Ag，即已知成梯度浓度的一系列标准品和未知浓度的待测样品，两者在严格相同的条件下与*Ag及Ab反应，反应结束后，以标准品的浓度为横坐标，结合率为纵坐标，绘制出标准曲线。

再以待测样品的结合率从标准曲线上查出其含量来。

第二节放射免疫分析法的建立和基本试剂（一）抗体衡量抗体的指标有（1）抗体的亲和力，（2）抗体的特异性，（3）抗体的滴度。

（二）标记抗原对标记抗原的要求是（1）标记后保持抗原的生物特性；（2）有效期较长；（3）比活度和放化纯度要高。

（三）标准品对标准品的要求是（1）含量要准确，（2）与待测样品的抗原特性相同,(3)不含干扰反应的物质。

（四）基本操作过程1.在试管内加入Ag（包括标准品和待测样品）*Ag和Ab。

2.温育。

3.分离游离抗原和抗原抗体复合物。

4.测抗原抗体复合物的放射性。

5.数据处理。

第三节分离方法和数据处理一、分离方法1.中止反应后收集抗原抗体复合物测放射性(B) 常用方法有以下几种:(1)聚乙二醇(PEG)沉淀法。

（2）双抗体沉淀法。

（3）葡萄球菌A蛋白沉淀法。

（4）其它。

2.收集游离抗原测放射性(F) 常用活性炭吸附法.3.固相法将抗体吸附于固相支持物上,当反应达到平衡后,抗原抗体复合物就留在支持物上,倒去上清液,再洗涤数次,测定固体支持物上的放射性B。

（二）数据处理1.手工作图法根据标准管测得的数据算出结合率，以标准品浓度为横坐标，结合率为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

体外分析技术体外分析技术是指在试管内进行反应从而测定某生物活性物质的超微量分析技术。

该类技术的特点是高灵敏度和高特异性，广泛用于临床和科学研究的很多领域。

应用最多的是：放射免疫分析、免疫放射分析、受体的放射配基结合分析及非放射性免疫分析。

第一节放射免疫分析一、原理放射免疫分析法 (radioimmunoassay,RIA) 的基本原理是，限量标记抗原[*Ag]和可变量的非标记待测抗原[Ag]与定量的特异抗体[Ab]发生竞争结合反应，通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的量。

这一过程可用下式表示：*Ag + Ag + Ab [AgAb]* + [AgAb]上述式中，Ab的分子数少于*Ag，因此即使系统中没有Ag，仅有*Ag，当反应达到平衡时，绝大部分 (因为是可逆反应，不会是100%) Ab将形成*AgAb复合物。

如果系统中加入Ag，则Ag与*Ag竞争结合Ab，形成AgAb，*AgAb将减少。

Ag越多则*AgAb越少。

实践和理论推导都证明，*AgAb和Ag呈二次方程的函数关系，如以Ag为横坐标，*AgAb (B)或*AgAb 占加入总*Ag的% (B%)为纵坐标，是一条斜率逐步由大变小的下降曲线。

如以游离的*Ag (F)或游离*Ag占加入总*Ag的% (F%)为纵坐标，则是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。

也可以*AgAb/*Ag的比值 (R)为纵坐标，也是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。

分析中，首先以不同量的已知标准品Ag和定量*Ag及限量Ab进行竞争结合反应，得到以B或B%、F或F%、或R为纵坐标的剂量效应曲线 (也称标准曲线)，然后以未知样品测得的B或B%、F或F%、或R从曲线上查出相应的剂量。

二、试剂盒基本试剂试剂盒由国家批准的生产单位提供，提供RIA的主要试剂、操作方法、保存条件及保存期限。

使用者应按说明书的要求合理使用。

如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步骤等进行适当修改，但应当对改变了的方案进行精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。