体外分析技术

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体外分析技术

Ag
25
50
100
200
400
800
*Ag
Ab
分离B、F
B1%
B2%
B3%
B4%
B5%
B6%
1
2
3
4
5
6
B%
？
B%
F%
B/F
Calibration Curve
优缺点比较
1、放射免疫分析技术
放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合的一类免疫测定技术。放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）——以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）——以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。
不同的肿瘤标记物可能出现在相同的粘蛋白上在肿瘤细胞株中CA199,CA50和CA242共同表达于 MUC-1和诞腺蛋白中。（Baeckstrom et al, 1992）
肿瘤的发展及诊断期
肿瘤标志物在全球的应用情况
肿瘤标志物的分类（化学特性）
癌胚抗原类标志物糖类抗原标记物酶类标志物激素类标志物癌基因其他
肿瘤与肿瘤标记物
相同的肿瘤可能检测出多种不同的肿瘤标记物相同的肿瘤标记物可能出现在不同的粘蛋白上 CA19-9和CA50已经在不同的粘蛋白核心上得到鉴定: MUC-1,MUC-3。（Baeckstrom et al, 1992和1995）涎腺蛋白。（Baeckstrom et al,1995）颌下腺粘蛋白支气管肺泡粘蛋白
1、放射免疫分析技术
优点：超微量分析技术，具有很高的精密度、灵敏度和准确度缺点：反应条件要求一般，但该技术所用试剂具有放射性，对人体有一定的危害，实验人员应加强防护。同时试剂存在半衰期，试剂必须在半衰期内用完，否则试剂会作废，这需要科学地做好试剂计划。另外反应过程中抗原的含量低到一定程度时会出现不确定因素，使灵敏度受到限制。

核医学体外放射分析技术课件

有效地排除非特异性物质对结合反应的干扰。
二、结合反应动力学规律
• 遵守质量作用定律 • [L]+[B] 适当的实验条件 [LB]
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（competitive binding) • 过量的配体与有限量的结合剂发生竞争性
结合反应。 • 2、非竞争结合（non-competitive binding) • 过量的结合剂与有限量的配体，在非竞争
的条件下发生结合反应。
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（主要应用：放射免疫分析）
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 慢性淋巴细胞性甲状腺炎： • 早期：T3,T4升高，然后降低，
TSH,TGAB,TPOAB升高。 • 甲状腺肿瘤：TG升高。 • 全身性疾病：心血管疾病、肿瘤等： • T3下降，rT3、TSH升高。
（二）肾上腺疾病
• 皮质醇增多症： • ACTH\COR正常情况下有节律分泌，检测
可以与单纯性肥胖区分。 • 原发性醛固酮增多症：尿游离皮质醇
• 反应误差关系 • 精密度图
• 2、准确度：测的值与其标称值之间的相符程度。
• 3、灵敏度（sensitivity): • 4、特异性(specificity) • 5、稳定性(stability)
（三）质量评价
• 内部质量控制 • 外部质量控制
三、以配体与受体间结合反应为基础的分析系统

第8章体外放射分析技术新版

抗体包被分离法
‭ 特点：试管包被第二抗体 ‭ 原理：SP－Ab2－Ab1－*Ag
Ab2
‭ ‭ 优点：固相包被具有简便、快速、稳定、不需离心等， ‭ 有逐渐取代液相法的趋势。
固相吸附分离法
⁮
吸附分离剂是固相颗粒，它可以从反应液中吸附游离抗原。活性炭是常用的吸附剂，多用于小分子游离抗原和抗原－抗体复合物的分离。具体应用时在活怀炭颗粒的表面涂上一层右旋糖酐或蛋白类化合物，这样在活性炭的表面形成一定大小的孔洞，在反应液中加入这种特殊颗粒时，小分子的游离抗原就会被活性炭吸附，从而达到分离B 与F的目的。
逐个代入上式，即可求得各样品的含量 X。优点：操作简单，用计算器也可拟合。
缺点：①由于Log 0无解，拟合时丢掉0剂量点，降低了灵敏度②
如有突出值，整条拟合线会偏离；③在顺序加样法中不是直线不可用。
2. 四参数Logistic模型本法从Logit-Log法演化而来，其函数式如下： Y=（a-d）/「1+（X/C）b」+d 式中Y是标记抗原在各实验点的结合率（包括NSB），X 是各点的剂量。a、b、c、d是四个参数。a代表0剂量时
⁮ 1、系统误差（systematic error）这种误差常表现为检测结果呈倾向性的偏高或偏低，是一些可以确定的因素导致的。（1）方法误差，如标准品稀释体积不正确；抗体过浓或过稀，分离效果不好；不适当的曲线拟合模型等。（2）仪器和试剂误差，如仪器状
态不佳；量器不准；试剂不纯等。（3）操作误差，如不正确的操
作习惯、错加样品等。系统误差是可以通过努力消除的。 ⁮ 2、随机误差（random error）这种误差是由难以确定且无法控
制的原因（偶然因素）引起，误差的出现是随机的，与真值的偏

实验核医学-体外分析技术

实验核医学
Experimental nuclear medicine
体外分析技术
In Vitro Radioassay
主讲人/制作人：
体外分析技术
In Vitro Radioassay
一、体外放射分析技术二、非放射免疫分析技术三、临床应用
结束
体外放射分析
一、体外放射分析的概念和分类
二、放射免疫分析（RIA) 1、基本原理 2、必备条件 3、质量控制
放射免疫分析Radioimmunoassay（RIA)
一、基本原理：
放射免疫分析是竞争性体外放射分析原理的代表。在体外，以放射性核素标记抗原和非标记抗原，同时与适量的特异性抗体发生的竞争性免疫结合抑制反应。
*Ag + Ab + Ag
*Ag-Ab + *Ag
Ag-Ab十Ag
RIA操作步骤：
1、加样 2、温浴反应 3、分离B/F 4、放射性测量 5、绘制标准曲线，查找待测物浓度
b值稳定，r＞0.99。
4．ED25、ED50及ED75 指标准曲线的结合率在25％、50％及75％时对应的抗原浓度值，
它反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。
5．反应误差关系(RER) 是评价RIA整批误差的综合指标，RER应＜0.04。
6．质控图
WHO要求在一次实验中，有下列情况之一者，其结果应予舍弃：
质量控制包括监测各重要环节的质量、测定误差和结果的可靠性。
（一）、质量控制
1．最高结合率(B0％) 指不加非标记抗原时标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30～50％。
2．非特异性结合率(NSB％) 指不加抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率，一般要求＜5～10％。

体外放射分析

RIA的基本条件
Specific binding reagent
• 特异性结合剂抗体特异性(specificity)：交叉反应的程度越小越好 • 亲和力(affinity)：配体与结合剂相互结合的程度，是反映结合剂质量的主要指标。可用亲和力常数表示。 • 滴度(titer)：在RIA时，结合50%的标记配体的结合剂稀释度；IRMA分析要求较高滴度（过量）。
Competive inhibition curve
• Binding rate（％）
• Concentration of antigen(mol/L)
抗体的工作浓度
• Ag*与Ag的免疫化学性质相同； • Ag*与Ag之和大于Ab，Ag*与Ab的量保持恒定。 Binding rate(%) 50%
体外放射分析
内容提要
• Part one: 体外放射分析技术 •Part two: 非放射免疫分析技术 • Part three: 临床应用
历史
• 1960年美国的Berson和Yalow 将核技术与免疫学技术相结合建立了放射免疫分析法，并首先用于测定血浆胰岛素浓度，由于该法对医学的巨大贡献，1977 年Yalow获得了Nobel奖。
Definition
• 在体外条件下 In vitro 以放射性核素标记的配体为示踪剂Tracer 以结合反应为基础 Base 以放射性测量为定量手段 Means 对微量物质进行定量分析Quantitative analysis 一类分析方法的总称。 General name
Main methods
• 半对数坐标系制图法制图方法简便，但易导致主观误差。 B/F (%) Log X
• 特异性抗体：亲和力大，滴度高，特异性强 • 标记抗原：纯度高；较高的比活度；放化纯度 >95%;保持免疫活性;标记稳定性好,无核素脱落 • 标准品:与被测物属同一种物质,具有相等的活性,高度纯化;定量要精确(国家标准;药盒标准; 质控标准) • B与F分离技术:完全又快速,非特异性结合低;不易受外界因素的干扰;价廉,操作简便,重复性好 (双抗法,沉淀法,双抗+PEG法,固相分离法,SPA 法,微孔滤膜法) • 放射性测量仪器: 计数器

核医学课件：体外分析技术

标准曲线
目前已普遍采用计算机进行数据处理，自动绘制标准曲线，自动换算样品中被测物质的浓度
实验操作基本步骤
1.加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。
2.孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是37℃。
3.分离：选择好的分离方法分离游离抗原和抗原－抗体复合物。 4.测量：测量游离或结合物部分的放射性。 5.数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算
* Ag
基本反应式
Ag-Ab
*Ag:标记抗原，Ag 非标记抗原 Ab：抗体 *Ag- Ab 标记抗原抗体复合物 Ag- Ab 非标记抗原抗体复合物
Ag-Ab+Ag
条件：1.*Ag与Ag 免疫活性相同
2. *Ag与Ab 恒量
*Ag-Ab+*Ag
理
*Ag与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争性与Ab结合，当*Ag和Ab的量保持恒定， *Ag与Ag之和大于Ab时，则*Ag-Ab复合物的形成受Ag含量的制约，二者之间存在函数关系，即 Ag 量越大， *Ag-Ab 量越小； Ag 量越小，*Ag-Ab量越大；测定*Ag-Ab或*Ag量即可推算出被测Ag量
量B、F的cpm
*Ag
B%=B/(B+F)
Ag 1
2
3
4
5 6？
25 50 100 200 400 800
B%
B% 标准曲线
常用的反应参数有 B%，B/F，F/B、 F%等这些反应变量都可以用作纵坐标来对应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗原浓度变化而变化的函数关系。

《内分泌与代谢系统疾病核医学诊断和治疗》- 体外分析技术

四碘甲腺原氨酸
两个3，5-二碘酪氨酸分子偶联而成的一种碘化的酪氨酸衍生物
5
体外分析技术的特点（2）
3、精密度高反映出来的是随机误差小（统计及实验误差）。(批内误差、批间误差)
4、应用广泛以放射免疫分析法为例目前至少有300 多种生物活性物质的检测建立了该方法。如：激素、蛋白质、抗体、免疫球蛋白、维生素及一些药物的分析。体外分析技术已成为现代医学临床诊断、治疗监测及评估、科学研究的重要手段。
• 逻辑分布(Logistic distribution)公式 P(Y=1│X=x)=exp(x'β)/1+exp(x'β)
12
Log-Logist作图法
13
分析曲线
a 以B/B0%为纵坐标的标准曲线
b 以B0% Logit为纵坐标的标准曲线
14
15
RIA实际应用中的参数（一）
1．最大结合管（B0）：标准抗原的量为0，只有标记抗原和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测得的B的放射性为B0。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原和抗体的结合达最大值。
• 化学发光免疫分析法 (chemical luminescent immunoassay，CLIA)
• 酶标记的免疫分析法 (enzyme immunoassay, EIA)
4
体外分析技术的特点（1）
1、灵敏度高可测水平10-9～10-20 g/l。一般化学分析法检出极限为10-3～10-6g 。
1.RIA的必备条件包括由国家批准的生产单位提供的试剂、分离技术、测量仪器。
2.主要试剂的组成是：特异性抗体(specific antibody)、标记抗原（radionuclide labeled antigen）、标准品（standard）（非标记抗原）。

第五章体外分析技术

的疗效判断,评价胰岛素产品质量.
骨钙素解甲状
腺\甲状旁腺功能
肝脏
急性黄疸型肝炎\慢性活动性肝炎\肝硬化
胆酸放免<300μg/dl 肝癌\胆汁淤积时明显升高,慢性迁延性肝
炎及胆囊炎轻度升高。妊娠胆淤明显升高。
透明质酸放免 <120μg/l 肝硬化\肝纤维化\慢性肝炎时升高,肝硬
同上
甲状腺球放免〈30%
甲状腺自身免疫疾病特异指
蛋白抗体
标，桥本氏甲状腺炎
甲状腺微放免〈20%
甲状腺自身免疫疾病特异指
粒体抗体
标，桥本氏甲状腺炎
TSH 免放 0.4-3.1μIU/ml 鉴别原发与继发甲低,评价下
丘脑-垂体-甲状腺轴功能,垂体瘤,库欣综合征
甲状腺放免4-14.5μg/ml 诊断甲癌\慢性淋巴细胞性
三、质量控制
Quality Control , QC
（一）定义：质量控制就是控制误差，即对分析工作中的误差进行经常性的检查，遇有质量异常则及时采取对策，以保证分析误差控制在可接受的范围内。
放射免疫分析是一类高灵敏度的超微量分析技术，极易受各种因素的影响而使检测结果失真，因此必须有严格的质量控制体系。
CA-153 放免<30U/ml 乳癌诊断特异,乳癌肝及骨转移\卵巢癌\
子宫内膜癌一定程度增高
肾上腺及肾脏
尿免疫球蛋白放免<8mg/l 早期诊断肾脏受损\受损部位及程度判断
尿白蛋白放免<10mg/l
同上
尿β2微球蛋白放免<230mg/l
同上
上午8时: 50~280μg/l 综合征,肾上腺肿瘤、肿瘤、应激
糖类抗原放免<20mg/l 肿瘤诊断\预后, 放化疗及手术后的疗

核医学体外分析技术

资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
抗CGMP抗体的交叉反应图
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（3）高滴度的抗体：
抗体滴度(Titer)指抗体实际应用时的稀释倍数。
稀释倍数越大，抗体的滴度越高，滴度一般要求在1/1000以上为好。
滴度曲线的目的：确定抗体稀释度；找出抗原和抗体的最适比例（B/T为50%时的抗体稀释度）。
1Bq=1/S
1Ci=3.7
10¹ºBq
2)保持标记抗原的免疫活性：
每个蛋白质分子上标记1-2个碘原子。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
3)便于放射性测量：
125I标记的抗原有r射线能直接测量
4)放射化学纯度高：放射化学纯度: 是指具有免疫活性的标记抗原占总放射性的百分数。放化纯度要求大于90%以上
❖ 诺贝尔医学奖获得者－ Yalow博士。
❖ 1959年 Yalow和 Berson两位博士在研究胰岛素的抗体时发展起来的。最早建立的是INS的RIA法。
❖ RIA法是一种高特异性、
❖ 高灵敏度的微量检测技术。
American physicist and medical researcher Rosalyn Yalow, corecipient of the 1977 Nobel Prize in physiology or medicine, "for the development of radioimmunoassays of peptide hormones."
❖ 目的：利用标准曲线来推算出病人样品（Ag）的含量。
❖ 配制一系列的标准品浓度：（0、20、40、80、160和320ng/L）
1B。 2

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基本原理
*Ag + Ab
+
Ag
？
*Ag-Ab + *Ag
(B)
(F)
Ag-Ab + Ag
Ag= * Ag , AgAb=*AgAb Ag > *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)
*Ag与Ag 免疫活性相同 *Ag＋Ag > Ab
B1% B2% B3% B4% B5% B6%
放射性竞争结合分析
放射免疫分析 (RIA)
体外放射分析
体
放射性非竞争免疫放射分析
外
结合分析
(IRMA)
分
析技术
体外非放射化学发光免疫分析 (CLIA)
荧光免疫分析 (FIA)
放射免疫分析法
Dr. Yalow
放射免疫分析法（Radioimmunoassay) 在体外条件下, 利用Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab的竞争抑制结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量的一种超微量分析技术
IRMA与RIA工作原理的主要区别
RIA
IRMA
竞争性抗原抗体结合反应
非竞争性抗原抗体结合反应
采用标记抗原
采用标记抗体
三种主要反应试剂
二种主要反应试剂
所用抗体是限量的
所用抗体是过量的
*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关 Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关
反应到达平衡慢低剂量区有不确定因素
反应到达平衡快低剂量区无不确定因素
Ab
分离B、F
*Ag
B%=B/(B+F)
F%=F/(B+F)
R=B/F
Ag 1 2 3 4 5 6
浓度 25 50 100 200 400 800
B%
标准曲线
B1% B2% B3% B4% B5% B6% B%
Ab
分离B、F
*Ag
Ag 1 2 3 4 5 6 ？
25 50 100 200 400 800
体外分析中心
标本保存间
放免室
放射性药品试剂盒
电化学发光分析
电化学发光分析
体外放射分析技术
定义
•是指在试管内进行反应从而测定某些生物活性物质（如激素、蛋白质、抗原、抗体、肿瘤标志物、维生素、药物浓度）的超微量分析技术的总称
体外放射分析技术优点
灵敏度高特异性强精密度好准确度高应用面广方法简便
RIA
+
+
或
IRMA +
0
1
1
IRMA和RIA低剂量区的不确定因素示意图
60
RIA的基本条件
• 特异性抗体 • 标记抗原 • 标准品 • 分离技术 • 放射性测量仪器
第二节免疫放射分析法
（immunoradiometric assay,IRMA）
Ag + *Ab
Ag-*Ab + *Ab
（B）（F）
在体外, 利用 Ag与过量的*Ab的非竞争性结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出 Ag 量。标记抗体，抗体是过量的

体外分析技术

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