第五章体外分析技术
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第五章体外分析技术
第五章
体外分析技术
体外分析技术主要是利用放射分析方法或其派生的相 关技术在体外进行肌体内物质种类和含量的分析测定。
体外分析技术的典型代表 ——放射免疫分析（RIA）
竞争性体外放射分析法： 标记抗原和未标记抗原对抗体都有相同的结合能力， 但是当抗体的量有限时，这种结合就出现相互竞争，彼此 抑制。 非竞争性体外放射分析法：
双抗体＋沉淀法(测量B)： 将双抗体和沉淀法两者结合进行分离。 本法具有两种方法的优点，并克服了双抗体分离时间长 和沉淀法非特异性结合高的缺点。
活性炭吸附法(测量F)： 活性炭吸附小分子游离抗原，离心分离后，复合物留 在上清液中，游离抗原在沉淀物中，测量沉淀物中的放射 性 F。 优点：本法操作简便，分离速度快，价格低廉。 缺点：易于解离，分离效果时间和温度的影响较大，非特 异性结合较高。
三、时间分辨荧光分析法（time resolved fluorescence, TRF） 以稀土元素，常用的是能发射离子荧光的铕（Eu）、铽 （Tb）、钐（Sm）和镝（Dy）四种元素，标记蛋白质、多肽、 激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，稀土元素在紫外光的 激发下，可产生持续一定时间、一定光峰的荧光。当体系反应 发生后，用特别的TRF仪测定最后产物中荧光强度，根据荧光 强度或相对荧光强度比值来判断反应体系中被分析物质的浓度， 达到定量分析的目的。 时间分辨荧光分析法具有灵敏度高、稳定性高等优点。
基本操作过程：
放免测定一般包括加样、温育、分离B与F、测量与数 据处理五个步骤
放射免疫分析法的必备条件和基本步骤
三、质量控制
质量控制（quality control，QC）包括实验室内质量控 制（internal quality control）与实验室间质量控制， 实验室内质量控制又包括批内质控与批间质控。
体外分析技术
体外分析技术主要是利用放射分析方法或其派生的相 关技术在体外进行肌体内物质种类和含量的分析测定。
体外分析技术的典型代表 ——放射免疫分析（RIA）
竞争性体外放射分析法： 标记抗原和未标记抗原对抗体都有相同的结合能力， 但是当抗体的量有限时，这种结合就出现相互竞争，彼此 抑制。 非竞争性体外放射分析法：
双抗体＋沉淀法(测量B)： 将双抗体和沉淀法两者结合进行分离。 本法具有两种方法的优点，并克服了双抗体分离时间长 和沉淀法非特异性结合高的缺点。
活性炭吸附法(测量F)： 活性炭吸附小分子游离抗原，离心分离后，复合物留 在上清液中，游离抗原在沉淀物中，测量沉淀物中的放射 性 F。 优点：本法操作简便，分离速度快，价格低廉。 缺点：易于解离，分离效果时间和温度的影响较大，非特 异性结合较高。
三、时间分辨荧光分析法（time resolved fluorescence, TRF） 以稀土元素，常用的是能发射离子荧光的铕（Eu）、铽 （Tb）、钐（Sm）和镝（Dy）四种元素，标记蛋白质、多肽、 激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，稀土元素在紫外光的 激发下，可产生持续一定时间、一定光峰的荧光。当体系反应 发生后，用特别的TRF仪测定最后产物中荧光强度，根据荧光 强度或相对荧光强度比值来判断反应体系中被分析物质的浓度， 达到定量分析的目的。 时间分辨荧光分析法具有灵敏度高、稳定性高等优点。
基本操作过程：
放免测定一般包括加样、温育、分离B与F、测量与数 据处理五个步骤
放射免疫分析法的必备条件和基本步骤
三、质量控制
质量控制（quality control，QC）包括实验室内质量控 制（internal quality control）与实验室间质量控制， 实验室内质量控制又包括批内质控与批间质控。
体外分析技术
基本原理
*Ag + Ab
+
Ag
？
*Ag-Ab + *Ag
(B)
(F)
Ag-Ab + Ag
Ag= * Ag , AgAb=*AgAb Ag > *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)
*Ag与Ag 免疫活性相同 *Ag＋Ag > Ab
B1% B2% B3% B4% B5% B6%
放射性竞争结 合分析
放射免疫分析 (RIA)
体外放射分析
体
放射性非竞争 免疫放射分析
外
结合分析
(IRMA)
分
析 技 术
体外非放射化学发光免疫分析 (CLIA)
荧光免疫分析 (FIA)
放射免疫分析法
Dr. Yalow
放射免疫分析法 （Radioimmunoassay) 在体外条件下, 利用Ag与定量 的*Ag对限量的特异性Ab的竞 争抑制结合反应，通过测定放 射性复合物的量来计算出Ag 量的一种超微量分析技术
IRMA与RIA工作原理的主要区别
RIA
IRMA
竞争性抗原抗体结合反应
非竞争性抗原抗体结合反应
采用标记抗原
采用标记抗体
三种主要反应试剂
二种主要反应试剂
所用抗体是限量的
所用抗体是过量的
*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关 Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关
反应到达平衡慢 低剂量区有不确定因素
反应到达平衡快 低剂量区无不确定因素
Ab
分离B、F
*Ag
B%=B/(B+F)
F%=F/(B+F)
实验核医学-体外分析技术
实验核医学
Experimental nuclear medicine
体外分析技术
In Vitro Radioassay
主讲人/制作人：
体外分析技术
In Vitro Radioassay
一、体外放射分析技术 二、非放射免疫分析技术 三、临床应用
结束
体外放射分析
一、体外放射分析的概念和分类
二、放射免疫分析（RIA) 1、基本原理 2、必备条件 3、质量控制
放射免疫分析Radioimmunoassay（RIA)
一、基本原理：
放射免疫分析是竞争性体外放射分析原理的代表。 在体外，以放射性核素标记抗原和非标记抗原，同时 与适量的特异性抗体发生的竞争性免疫结合抑制反应。
*Ag + Ab + Ag
*Ag-Ab + *Ag
Ag-Ab十Ag
RIA操作步骤：
1、加样 2、温浴反应 3、分离B/F 4、放射性测量 5、绘制标准曲 线，查找待测物 浓度
b值稳定，r＞0.99。
4．ED25、ED50及ED75 指标准曲线的结合率在25％、50％及75％时对应的抗原浓度值，
它反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。
5．反应误差关系(RER) 是评价RIA整批误差的综合指标，RER应＜0.04。
6．质控图
WHO要求在一次实验中，有下列情 况之一者，其结果应予舍弃：
质量控制包括监测各重要环节的质量、测定误差和结果的 可靠性。
（一）、质量控制
1．最高结合率(B0％) 指不加非标记抗原时标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30～50％。
2．非特异性结合率(NSB％) 指不加抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率，一般要求＜5～10％。
Experimental nuclear medicine
体外分析技术
In Vitro Radioassay
主讲人/制作人：
体外分析技术
In Vitro Radioassay
一、体外放射分析技术 二、非放射免疫分析技术 三、临床应用
结束
体外放射分析
一、体外放射分析的概念和分类
二、放射免疫分析（RIA) 1、基本原理 2、必备条件 3、质量控制
放射免疫分析Radioimmunoassay（RIA)
一、基本原理：
放射免疫分析是竞争性体外放射分析原理的代表。 在体外，以放射性核素标记抗原和非标记抗原，同时 与适量的特异性抗体发生的竞争性免疫结合抑制反应。
*Ag + Ab + Ag
*Ag-Ab + *Ag
Ag-Ab十Ag
RIA操作步骤：
1、加样 2、温浴反应 3、分离B/F 4、放射性测量 5、绘制标准曲 线，查找待测物 浓度
b值稳定，r＞0.99。
4．ED25、ED50及ED75 指标准曲线的结合率在25％、50％及75％时对应的抗原浓度值，
它反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。
5．反应误差关系(RER) 是评价RIA整批误差的综合指标，RER应＜0.04。
6．质控图
WHO要求在一次实验中，有下列情 况之一者，其结果应予舍弃：
质量控制包括监测各重要环节的质量、测定误差和结果的 可靠性。
（一）、质量控制
1．最高结合率(B0％) 指不加非标记抗原时标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30～50％。
2．非特异性结合率(NSB％) 指不加抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率，一般要求＜5～10％。
体外分析技术核医学
通过核医学技术可以检测和定位肿瘤，为早期诊断和治疗提供准确信息。
2
心脏疾病评估
核心医学可以评估心脏功能、血液供应情况以及冠状动脉梗塞的程度。
3
神经精神疾病研究
利用核医学技术，研究人类的脑部功能，了解神经精神疾病的病理生理机制。
未来展望
随着科技的不断进步，体外分析技术核医学将继续发展，并在疾病诊断、治疗和疗效评估方面发挥越来越重要 的作用。
PET显像技术
正电子发射计算机断层显像（PET）利用放射性同位素的正电子发射特性，提供高分辨率、高敏感度的全身代 谢和功能成像。
SPECT显像技术
单光子发射计算机断层显像（SPECT）使用放射性同位素的单光子发射特性，提供三维的功能和代谢成像，广 泛用于心脏和脑部疾病诊断。
临床应用实例
1
癌症筛查
结束语
体外分析技术核医学为医学研究和临床实践带来了革命性的进展，将为人类 健康的未来带来更多希望和机遇。
Байду номын сангаас
体外分析技术核医学
体外分析技术核医学是一门研究放射性同位素用于医学诊断和治疗的技术。 本次演讲将带您了解该领域的原理、技术和应用实例，并展望未来发展。
原理介绍
体外分析技术核医学利用放射性同位素的特性，通过探测其发出的放射线来 获取有关人体内部结构和功能的信息。
体外标记法
体外标记法是使用放射性同位素标记生物分子，如蛋白质和抗体，以便在体 内观察特定细胞、器官或病变的存在和活动。
第五章_体外分析技术
所用抗体是限量的
所用抗体是过量的
*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关 Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关
反应到达平衡慢
反应到达平衡快
非特异结合主要影响高剂量区
非特异结合主要影响低剂量区
低剂量区有不确定因素
低剂量区无不确定因素
B% B%
拟合的标准曲线
拟合的NSB
RIA的标准曲线及 非特异结合曲线
IRMA的标准曲线及 非特异结合曲线
90%~110%
A
B
4、特异性（specificity） 交叉反应率
5、可靠性（validity） 平行性试验
C
3、灵敏度 （sensitivity） 方法的最小可测量
6、稳定性（stability） B0%，NSB，ED25，ED50，ED75
质量控制就是使用合适的方法以检查、 表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差， 并使这种误差降低到某一允许水平。
铕：激发光340nm，发射光613nm 荧光素的Stokes位移为273nm 3. 狭窄的发射峰 4. 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍
时间分辨荧光免疫分析技术
（time-resolved fluoroimmunoassay）
一、基本原
镧系元素（15）：铕（Eu），钐 （Sm），镝（Dy），鋱（Te）
4．标准管（B1~Bn）：放有不同浓度的 标准抗原，再加入相同量的标记抗原和特异 抗体。一般在反应后分离出沉淀，测定沉淀 的放射性作为B。
5．样品管（Bx）：用同剂量的样品代 替标准管中的标准抗原，在相同条件下反应 和分离，同样取沉淀测得其放射性，就可以 在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。
常用的有 B%，B/F，B/Bo，F/B，Bo/B 等 这 些反应变量都可以用作纵坐标来对应标准抗原 的浓度作标准曲线，选用的反应变量不同，标 准曲线的形状也不同。但是这些标准曲线都是 反映的反应变量对应标准抗原浓度变化而变化 的函数关系。
核医学课件：体外分析技术
标准曲线
目前已普遍采用计算机进行数据处 理，自动绘制标准曲线，自动换算 样品中被测物质的浓度
实验操作基本步骤
1.加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境 也要一致。
2.孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间 不同，一般是37℃。
3.分离：选择好的分离方法分离游离抗原和 抗原－抗体复合物。 4.测量：测量游离或结合物部分的放射性。 5.数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算
* Ag
基本反应式
Ag-Ab
*Ag:标记抗原，Ag 非标记抗原 Ab：抗体 *Ag- Ab 标记抗原抗体复合物 Ag- Ab 非标记抗原抗体复合物
Ag-Ab+Ag
条件：1.*Ag与Ag 免疫活性相同
2. *Ag与Ab 恒量
*Ag-Ab+*Ag
理
*Ag与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争 性与Ab结合，当*Ag和Ab的量保持恒定， *Ag与Ag之和大于Ab时，则*Ag-Ab复合物的 形成受Ag含量的制约，二者之间存在函数关 系 ， 即 Ag 量 越 大 ， *Ag-Ab 量 越 小 ； Ag 量 越 小，*Ag-Ab量越大；测定*Ag-Ab或*Ag量即 可推算出被测Ag量
量B、F的cpm
*Ag
B%=B/(B+F)
Ag 1
2
3
4
5 6？
25 50 100 200 400 800
B%
B% 标准曲线
常 用 的 反 应 参 数 有 B%，B/F，F/B、 F%等这些反应变量都可以用作纵坐标来对 应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应 变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这 些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗 原浓度变化而变化的函数关系。
检验核医学放射免疫分析和免疫放射分析
3 标记Ag 常用125I和3H标记化合物 要求： (1)适当高的放射性比活度 影响方法的灵敏度和 精密度，标记Ag化学量≤被测Ag的最小量 (2)放射化学纯度>95% 影响方法的灵敏度 (3)免疫活性与未标记Ag基本保持一致 (4)稳定性好，在一定条件下，稳定期1-3月
标记Ag与Ab的用量对 测定的影响
实验室内部质量控制方法
1对实验数据进行审核剔除“坏点” 2剂量反应曲线拟合及质量审核 3精密度评价 (1)反应误差关系RER
从多批实验资料求出直线方程式 SDR = a + bR
a反映分离误差 b反映加样误差
(2)精密度图(P-P图) (用剂量反应曲线)
通过RER将SDR转换SDD(CVD%) 作SDD (CVD%) - lgD曲线 CVD%≤10%
[Q0]
1
[Q0]
B2 – B (1 + ——— + ——— ) + ——— = 0 (4)
[P0] K [P0]
[P0]
将B = 1 - F代入(3)
[Q0]
1
1
F2 – F (1 - ——— - ——— ) + ——— = 0 (5)
[P0]
K [P0] K [P0]
定义R = B / F，由B + F = 1得B = R / (1+R)代入(3)
偏差分析 2实验室外部质量控制(1)对某种分析方法的试剂
或试剂盒进行综合评价 (2)对不同实验室的分析工作
质量进行比较
质量控制样品 质控的“标准系统”－质控血清(QC) 要求：1 QC样品与待测样品性质相同
2 QC样品与待测样品中待测物相同，免疫活性一致 3 QC样品中待测物量已知，分高、中、低三档浓度 4足量制备，分装，低温存放，分批使用 制备方法：1按三档浓度收集多余病人血清，测定标示值
《内分泌与代谢系统疾病核医学诊断和治疗》- 体外分析技术
四碘甲腺原氨酸
两个3，5-二碘酪氨酸分子偶联而成的一种碘化的酪氨酸衍生物
5
体外分析技术的特点（2）
3、精密度高 反映出来的是随机误差小（统计及实 验误差）。(批内误差、批间误差)
4、应用广泛 以放射免疫分析法为例目前至少有300 多种生物活性物质的检测建立了该方法。如：激素、 蛋白质、抗体、免疫球蛋白、维生素及一些药物的分 析。体外分析技术已成为现代医学临床诊断、治疗监 测及评估、科学研究的重要手段。
• 逻辑分布(Logistic distribution)公式 P(Y=1│X=x)=exp(x'β)/1+exp(x'β)
12
Log-Logist作图法
13
分析曲线
a 以B/B0%为纵坐标的标准曲线
b 以B0% Logit为纵坐标的标准曲线
14
15
RIA实际应用中的参数（一）
1．最大结合管（B0）：标准抗原的量为0，只有标记抗原 和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测 得的B的放射性为B0。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原 和抗体的结合达最大值。
• 化学发光免疫分析法 (chemical luminescent immunoassay，CLIA)
• 酶标记的免疫分析法 (enzyme immunoassay, EIA)
4
体外分析技术的特点（1）
1、灵敏度高 可测水平10-9～10-20 g/l。 一般化学分析法检出极限为10-3～10-6g 。
1.RIA的必备条件包括由国家批准的生产单位提 供的试剂、分离技术、测量仪器。
2.主要试剂的组成是：特异性抗体(specific antibody)、标记抗原（radionuclide labeled antigen）、标准品（standard）（非标记抗原）。
5-体外分析技术
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科
非放射性标记免疫分析技术
提高灵敏度、减少放射性废物、 提高灵敏度、减少放射性废物、提高自动化程度
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科
非放射性标记免疫分析方法
• • • • 酶标记免疫分析技术 化学发光免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析技术 蛋白芯片与基因芯片技术
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科Βιβλιοθήκη IRMA的主要特点 的主要特点
• 属于非竞争性抗原抗体结合反应 • 抗原抗体复合物的量与所加非标记抗原的量呈 正相关 • 在低剂量下不会有不确定因素 • IRMA的非特异性结合对低剂量区影响大，对 的非特异性结合对低剂量区影响大， 的非特异性结合对低剂量区影响大 分离条件的要求严格。对于RIA来讲，低剂量 来讲， 分离条件的要求严格。对于 来讲 区放射性高，非特异结合主要影响高剂量区。 区放射性高，非特异结合主要影响高剂量区。
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科
质量控制
• 质量控制的目的：对分析工作的误差进行经常性的检 质量控制的目的： 遇有质量异常则及时采取对策， 查，遇有质量异常则及时采取对策，以保证分析误差 控制在可接受的范围内， 控制在可接受的范围内，包括实验室内部和实验室间 质控两方面。 质控两方面。 • 放射免疫分析误差 随机误差和系统误差 放射免疫分析误差: • 质量控制指标 稳定性、灵敏度、准确度 质量控制指标: 稳定性、灵敏度、
体外分析技术
上海交通大学 上海市第六人民医院 核医学科
体外分析技术分类
• 放射免疫分析法 • 免疫放射分析法 • 非放射性标记免疫分析技术
(核医学课件)02.RIA体外分析技术
RIA体外分析技术的优势与局限
1 优势
高灵敏度：能够检测极低浓度的物质
2
高特异性：能够准确区分类似结构的分 子
3
4 局限
广泛应用：适用于多种生物样品和分析 物质
放射性污染风险，需要严格的实验室操 作控制
常见的RIA体外分析技术方法
RIA技术在医学诊断和研究中有多种变种：
• 双抗体RIA • 竞争性RIA • 免疫放射分析（IRMA） • 固相RIA • 辐射免疫沉淀法（RIP）
放射性示踪技术
免疫学
RIA利用放射性示踪技术标记 分析物质，使其具备辨识性， 进而实现可靠的浓度测定。
RIA基于抗原抗体反应原理， 利用特异性抗体对待测物质 进行检测，确保高特异性和 高敏感性。
实验室应用
RIA广泛应用于医学诊断、生 物医学研究和临床实验，可 检测和分析激素、肿瘤标志 物、免疫功能指标等生物分 子的含量。
激素诊断
RIA可用于测定病。
肿瘤标志物检测
RIA可以精确测定血液或组织中的肿瘤标 志物，用于早期诊断、治疗监测和预后评 估。
免疫功能检测
RIA在评估免疫功能指标，如免疫球蛋白、 细胞因子等方面发挥重要作用。
药物浓度测定
RIA可测定药物在体内的浓度，用于调整 和监测药物治疗的效果。
(核医学课件)02.RIA体外 分析技术
为了有效地进行医学诊断，了解RIA体外分析技术的原理和应用至关重要。本 节将介绍RIA体外分析技术的基本知识和发展前景。
RIA体外分析技术的概述
RIA体外分析技术是一种高灵敏度、高特异性的实验室分析方法，用于测量微量物质在体内或体外 的浓度。通过结合放射性示踪技术和免疫学，RIA可以检测和定量分析各种生物分子。
第五章体外分析技术
的疗效判断,评价胰岛素产品质量.
骨钙素解甲状
腺\甲状旁腺功能
肝脏
急性黄疸型肝炎\慢性活动性肝炎\肝硬化
胆酸 放免<300μg/dl 肝癌\胆汁淤积时明显升高,慢性迁延性肝
炎及胆囊炎轻度升高。妊娠胆淤明显升高。
透明质酸 放免 <120μg/l 肝硬化\肝纤维化\慢性肝炎时升高,肝硬
同上
甲状腺球 放免〈30%
甲状腺自身免疫疾病特异指
蛋白抗体
标，桥本氏甲状腺炎
甲状腺微 放免〈20%
甲状腺自身免疫疾病特异指
粒体抗体
标，桥本氏甲状腺炎
TSH 免放 0.4-3.1μIU/ml 鉴别原发与继发甲低,评价下
丘脑-垂体-甲状腺轴功能,垂体瘤,库欣综合征
甲状腺 放免4-14.5μg/ml 诊断甲癌\慢性淋巴细胞性
三、质量控制
Quality Control , QC
（一）定义：质量控制 就是控制误差， 即对分析工作中的误差进行经常性的 检查，遇有质量异常则及时采取对策， 以保证分析误差控制在可接受的范围 内。
放射免疫分析是一类高灵敏度的超微 量分析技术，极易受各种因素的影响 而使检测结果失真，因此必须有严格 的质量控制体系。
CA-153 放免<30U/ml 乳癌诊断特异,乳癌肝及骨转移\卵巢癌\
子宫内膜癌一定程度增高
肾上腺及肾脏
尿免疫球蛋白 放免<8mg/l 早期诊断肾脏受损\受损部位及程度判断
尿白蛋白 放免<10mg/l
同上
尿β2微球蛋白 放免<230mg/l
同上
上午8时: 50~280μg/l 综合征,肾上腺肿瘤、肿瘤、应激
糖类抗原 放免<20mg/l 肿瘤诊断\预后, 放化疗及手术后的疗
体外分析技术
s=SQRT((s12+s22+s32+s42)/4) CV=s/X 要求：批内CV<5% 批间<10%
反应误差关系（RER）: 整批误差指标 要求： RER<0.04
∑(A-B)
双管计数误差之和
RER=
=
√2 2
双管计数均值之和 ∑(A+B)/2
cv
2.评价RIA试剂盒质量－精密度
精密度图 由于测定值的精密度随剂量水平而变化，要求
2.评价RIA试剂盒质量－特异性
反映分析方法中所用抗体对被测物质的专一性。 常用交叉反应来表示。
2.评价RIA试剂盒质量－准确度
回收率：测定值/真值×100% 要求90%~110% 平行性反应（了解）
标准品与样品的剂量
2.评价RIA试剂盒质量－稳定性
试剂盒在合理保存条件下，分析试剂在有效期内的 性状稳定性。
（竞争性）体外放射免疫分析基本原理*
c
c
Ag*
Ag
Ab
v
Ag*-Ab Ag-Ab
（竞争性）体外放射免疫分析基本原理*
反应可用下式表达
* Ag + Ab
Ag
* Ag—Ab Ag—Ab
（竞争性）体外放射免疫分析基本原理*
其基本原理是竞争免疫性结合（competitive binding）。
其基础是标记抗原(*Ag )和未标记抗原(Ag[被 测抗原、标准物])，与特异性抗体具有相同的 结合能力；且特异性抗体的量不足。
RIA的基本步骤
加
孵
分
测
数
放
据
射
处
样
育
离
性
理
质量控制 （Quality Control，QC）
反应误差关系（RER）: 整批误差指标 要求： RER<0.04
∑(A-B)
双管计数误差之和
RER=
=
√2 2
双管计数均值之和 ∑(A+B)/2
cv
2.评价RIA试剂盒质量－精密度
精密度图 由于测定值的精密度随剂量水平而变化，要求
2.评价RIA试剂盒质量－特异性
反映分析方法中所用抗体对被测物质的专一性。 常用交叉反应来表示。
2.评价RIA试剂盒质量－准确度
回收率：测定值/真值×100% 要求90%~110% 平行性反应（了解）
标准品与样品的剂量
2.评价RIA试剂盒质量－稳定性
试剂盒在合理保存条件下，分析试剂在有效期内的 性状稳定性。
（竞争性）体外放射免疫分析基本原理*
c
c
Ag*
Ag
Ab
v
Ag*-Ab Ag-Ab
（竞争性）体外放射免疫分析基本原理*
反应可用下式表达
* Ag + Ab
Ag
* Ag—Ab Ag—Ab
（竞争性）体外放射免疫分析基本原理*
其基本原理是竞争免疫性结合（competitive binding）。
其基础是标记抗原(*Ag )和未标记抗原(Ag[被 测抗原、标准物])，与特异性抗体具有相同的 结合能力；且特异性抗体的量不足。
RIA的基本步骤
加
孵
分
测
数
放
据
射
处
样
育
离
性
理
质量控制 （Quality Control，QC）
核医学体外分析技术
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
抗CGMP抗体的交叉反应图
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（3）高滴度的抗体：
抗体滴度(Titer)指抗体实际应用时的稀释倍数。
稀释倍数越大，抗体的滴度越高，滴度一般要求在1/1000以 上为好。
滴度曲线的目的：确定抗体稀释度；找出抗原和抗体 的最适比例（B/T为50%时的抗体稀释度）。
1Bq=1/S
1Ci=3.7
10¹ºBq
2)保持标记抗原的免疫活性：
每个蛋白质分子上标记1-2个碘原子。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
3)便于放射性测量：
125I标记的抗原有r射线能直接测量
4)放射化学纯度高： 放射化学纯度: 是指具有免疫活性的标记抗原占总 放射性的百分数。 放化纯度要求大于90%以上
❖ 诺贝尔医学奖获得者－ Yalow博士。
❖ 1959年 Yalow和 Berson两位博士在研究胰岛素的抗 体时发展起来的。最早建立的是INS的RIA法。
❖ RIA法是一种高特异性、
❖ 高灵敏度的微量检测技术。
American physicist and medical researcher Rosalyn Yalow, corecipient of the 1977 Nobel Prize in physiology or medicine, "for the development of radioimmunoassays of peptide hormones."
❖ 目的：利用标准曲线来推算出病人样品（Ag）的含量。
❖ 配制一系列的标准品浓度：（0、20、40、80、160和320ng/L）
1B。 2
体外分析技术
体外分析技术体外分析技术是指在试管内进行反应从而测定某生物活性物质的超微量分析技术。
该类技术的特点是高灵敏度和高特异性，广泛用于临床和科学研究的很多领域。
应用最多的是：放射免疫分析、免疫放射分析、受体的放射配基结合分析及非放射性免疫分析。
第一节放射免疫分析一、原理放射免疫分析法 (radioimmunoassay,RIA) 的基本原理是，限量标记抗原[*Ag]和可变量的非标记待测抗原[Ag]与定量的特异抗体[Ab]发生竞争结合反应，通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的量。
这一过程可用下式表示：*Ag + Ag + Ab [AgAb]* + [AgAb]上述式中，Ab的分子数少于*Ag，因此即使系统中没有Ag，仅有*Ag，当反应达到平衡时，绝大部分 (因为是可逆反应，不会是100%) Ab将形成*AgAb复合物。
如果系统中加入Ag，则Ag与*Ag竞争结合Ab，形成AgAb，*AgAb将减少。
Ag越多则*AgAb越少。
实践和理论推导都证明，*AgAb和Ag呈二次方程的函数关系，如以Ag为横坐标，*AgAb (B)或*AgAb 占加入总*Ag的% (B%)为纵坐标，是一条斜率逐步由大变小的下降曲线。
如以游离的*Ag (F)或游离*Ag占加入总*Ag的% (F%)为纵坐标，则是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
也可以*AgAb/*Ag的比值 (R)为纵坐标，也是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
分析中，首先以不同量的已知标准品Ag和定量*Ag及限量Ab进行竞争结合反应，得到以B或B%、F或F%、或R为纵坐标的剂量效应曲线 (也称标准曲线)，然后以未知样品测得的B或B%、F或F%、或R从曲线上查出相应的剂量。
二、试剂盒基本试剂试剂盒由国家批准的生产单位提供，提供RIA的主要试剂、操作方法、保存条件及保存期限。
使用者应按说明书的要求合理使用。
如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步骤等进行适当修改，但应当对改变了的方案进行精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。
核医学体外分析技术(68页).doc
核医学--体外分析技术
（四）分离方法的5个种类要熟记 分离的目的是放射免疫反应达到平衡 后，使抗原抗体复合物和游离抗体抗原分 开，分别测量其放射性。分离技术直接影 响分析结果的准确性，理想的分离技术应 具备既安全又迅速，不受其他因素干扰， 操作简便，重复性好等优点。
核医学--体外分析技术
1.双抗体法 是用抗原免疫动物产生相应的抗体作为第一 抗体，再以第一抗体为抗原免疫另一种动物，所 产生的抗体为第二抗体。第二抗体与第一抗体形 成的抗原抗体复合物结合后形成第二抗体复合物， 其分子量比第一抗体复合物大，可离心分离出来， 这种方法称为双抗体法（double antibody method）。 优点是：易分离、特异性强、使用方便。 不 足：易受其他因素干扰、成本高、操作时 间长。
核医学--体外分析技术
二、基 本 试 剂 放射免疫分析的反应中主要包括3种剂； 1、抗体（ Ab） 2、标记抗原（*Ag） 3、标准抗原（标准品）及试剂盒提 供分离试剂或材料，缓冲液及质量控制 （高、中、低值）用品等。
核医学--体外分析技术
(一) 抗体有3个条件必须满足 需要选择亲和力大、特异性强、滴度高的抗体。 1、抗原和抗体之间的结合能力和其牢固性称亲和力 （affinity），亲和力大者反应结合速度快，解离度小。 2、指抗体分别与相应抗原和抗原结构类似物结合能力 的比较，交叉反应越小，特异性（specificity）越强。 3、稀释倍数简称滴度，滴度（titer）越高，所需的抗 血清量越少，杂质干扰也越少。
90年代时间分辨技术 70年代酶(荧光)免疫技术 （EIA...FEIA）
50年代放免分析技术 （RIA）
（TRFIA）
核医学--体外分析技术
放射免疫分析技术（ra d ioimmunoassay,RIA）
第五章 体外分析技术
1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用标 记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其 灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标准曲线的测 量范围也明显扩大。
放射免疫分析
RADIOIMMUNOASSAY,RIA
Definition
是以抗原抗体的免疫反应 为基础，利用待测抗原与 定量的标记抗原同有限量 的特异性抗体竞争性结合， 以放射性测量为微量定量 手段，获得待测生物样品 中抗原浓度的技术。
Main methods
Ag + Ab + * Ag AgAb + Ag
*Ag + *AgAb
Main methods
放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原） 与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争结合，形成抗原抗 体复合物。 反应体系中同时存在*Ag、Ag和Ab，而*Ag的量一定、Ab的 量固定，而且Ag+*Ag＞＞Ab时，随着Ag的增加，*AgAb的 量相应减少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的量呈 负相关。当反应达到平衡后，将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的标记抗原分离，测定其放射性。以标 准抗原的浓度为横坐标，以标记抗原-抗体复合物的结合 率（B/T、B/F、或F/T）为纵坐标，绘制剂量反应曲线， 也称剂量效应曲线（calibration curve）。
Radiolabeled compounds
标记物
合适的核素标记（半衰期、射线类型、能量 等）,常用核素有125I和3H 标记物的用量要小，应等于或低于待测物的 最小量 足够的比活度 放化纯度高 免疫活性 稳定性好，贮存不易脱标
Specific binding reagent
体外分析技术讲义
B%=B/(B+F) F%=F/(B+F) R=B/F
RIA的基本原理示意图，原理是竞争性结合抑制反应
• 核医学（第9版）
2. 放射免疫分析加样流程
RIA加样程序（体积：µl）
试剂 标准品
NSB管 100（零标准品）
S0-S5标准管 100
样品管 —
质控管 —
质控血清
—
—
—
50
待测样本
—
—
100
—
• 核医学（第9版）
1. 酶标记免疫分析
酶标记免疫分析技术（EIA）中以酶联免疫吸附 法（ELISA）应用最广泛。
ELISA是用聚苯乙烯作微量反应板，酶标记抗 原或抗体，反应模式与RIA/IRMA相同，用酶替代了 125I，检测仪器是酶标仪。
常用的酶有：辣根过氧化物酶、碱化磷酸酶、 葡萄糖氧化酶。
20世纪50年代，放射免疫分析法的建立与临床应用，开创了微量物质检 测的新纪元。
• 核医学（第9版） 1. RIA的基本原理
特异性 抗体Ab
*Ag与Ag 免疫活性相同； 在一定的反应条件下； *Ag、Ab为恒定量； *Ag＋Ag > Ab。
Ag =* Ag , AgAb =*AgAb Ag > *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)
125I-Ag
100
100
100
100
蒸馏水
100
—
—
—
抗体
—
ห้องสมุดไป่ตู้100
100
100
混匀，37℃温育1小时
分离试剂
500
500
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第二节 免疫放射分析
immunoradiometric assay , IRMA
免疫放射分析技术是1968年由 Miles和Hales创立的，IRMA是 非竞争性体外放射分析技术的代 表。
一、基本原理
用放射性核素标记抗体作示踪剂， 在反应系统中加入过量的标记抗 体，抗原与标记抗体进行全量反 应，多余的抗体用一定的手段除 去，测定复合物的放射性，其活 度与待测抗原量正相关。
甲状腺 放免4-14.5μg/ml 诊断甲癌\慢性淋巴细胞性
球蛋白
甲状腺炎/甲亢,尤其监测甲癌
复发
反T3 放免 0.5-1.2nmol/l 诊断甲状腺疾病,对非甲状腺
疾病严重程度的判断\预后\疗效观察均有重要意
义,甲减替代治疗观察
TSH受体 放射受体<9U/l 甲亢\甲亢预后,甲亢ATD停
抗体
药指标.判断甲亢有无复发.
3）高度纯化，不含有影响分析的杂质；
4）对标准品的定量一定要精确
2、标记抗原
标记抗原是样品测量的基础 对标记抗原的要求是：
1）比活度和放射化学纯度必须足够 高——以保证分析的灵敏度
标记抗原的放化纯必须不小于95%
2）放射性核素的半衰期合适 3）标记抗原的生理活性未改变 4）标记抗原的应有较高的稳定性
升高，肿瘤骨髓、肝、脾转移时显著增加
前列腺特 放免，<2.6μg/l 前列腺癌\前列腺肥大\前列腺炎诊
异抗原
断及疗效观察.前列腺癌时显著升高,肥大时轻度升高.
CEA 放免，<20μg/l
结肠\直肠\胃\肺\乳腺恶性肿瘤时动态
升高,对肿瘤诊断\复发\预后判断\疗效观察有意义.
AFP 放免，<25μg/l
促甲状腺素 放免法43±25pg/ml 释放激素
鉴别原发和继发性 甲低
甲状旁腺素 放免 <70.5pmol/l
甲状旁腺病,判断骨代谢.
慢性肾衰\甲旁亢\甲旁腺瘤时增高,
甲旁减\高钙尿症时减低
肿瘤标志物
铁蛋白
放免 ,男25~264μg/l 女25~264μg/l
缺铁性贫血,辅助诊断再障\急 慢性白血病\恶性淋巴瘤\多发 性骨髓瘤。原发性肝癌部分
免疫分析技术（酶、化学发光、时间分辨荧光 分析）
第一节 放射免疫分析法 radioimmunoபைடு நூலகம்ssay， RIA
1959年，美国的两位科学家Berson和 Yalow首次将示踪技术的高度灵敏性和免 疫学抗原-抗体结合的高度特异性结合起 来，创立了放射免疫分析技术，开创了 生物活性物质微量测定技术的新时代。 RIA 的特点：灵敏度高、特异性强、准 确度高、稳定性好。经不断改进，现在 广泛应用于临床检测和科学研究的很多 领域。
CA-125 放免<35U/ml 妇科肿瘤的诊断与鉴别诊断有重要价值
CA-153 放免<30U/ml 乳癌诊断特异,乳癌肝及骨转移\卵巢癌\
子宫内膜癌一定程度增高
肾上腺及肾脏
尿免疫球蛋白 放免<8mg/l 早期诊断肾脏受损\受损部位及程度判断
尿白蛋白 放免<10mg/l
同上
尿β2微球蛋白 放免<230mg/l
3、抗体
在放射免疫分析中，抗体质量的好 坏是影响放射免疫分析的关键因素 之一。
高质量的抗体必须具备三个条件： 高亲和力、高特异性、高滴度
1）高亲和力
只有高亲和力的抗体才能得到斜率 高的标准曲线，而斜率高的标准曲 线是高灵敏度和高精密度的必备条 件。亲和力测定方法最常用的是 Scatchard作图法（P36） KA值越大（即直线斜率越大）， 抗体的亲和力越大方法的灵敏度和 精密度越高
胆酸 放免<300μg/dl 肝癌\胆汁淤积时明显升高,慢性迁延性肝
炎及胆囊炎轻度升高。妊娠胆淤明显升高。
透明质酸 放免 <120μg/l 肝硬化\肝纤维化\慢性肝炎时升高,肝硬
化恶变时显著升高,可鉴别慢性活动性与迁延性肝炎
层粘连蛋白 放免 <120μg/l 同上
III型胶原 放免 <120μg/l 同上
度不同的抗体进行反应，当*Ag的结合 率为50%时对应的抗体的稀释度即为 该抗体的滴度。这时的抗体浓度就是 实际使用时的浓度。
（二）分离技术
1、聚乙二醇（PEG）沉淀法 2、双抗体沉淀法 3、双抗体+PEG法 4、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法 5、活性炭吸附法：葡聚糖包被的活性炭 6、微孔滤膜过滤法：玻璃或醋酸纤维滤膜 7、磁化分离技术：氧化铁-活性炭（-抗体） 8、固相分离技术：
FT4 放免 8.2-26pmol/l 同上
甲状腺球 放免〈30%
甲状腺自身免疫疾病特异指
蛋白抗体
标，桥本氏甲状腺炎
甲状腺微 放免〈20%
甲状腺自身免疫疾病特异指
粒体抗体
标，桥本氏甲状腺炎
TSH 免放 0.4-3.1μIU/ml 鉴别原发与继发甲低,评价下
丘脑-垂体-甲状腺轴功能,垂体瘤,库欣综合征
RIA和IRMA的区别
体外分析常用检查项目
项目 方法及正常值
临床意义
T3 放免 1.0-3.2nmol/l 判断甲状腺功能及肾病\肝病\
糖尿病\肿瘤心肌梗死等引起的低T3T4综合征
T4 放免 70-180nmol/l 同上
FT3 放免 3.2-9.2pmol/l 同上，判断甲亢复发及妊娠
时甲状腺功能
标准曲线
得到的标准曲线之所以是曲线而不是直线， 这是可逆反应的质量作用定律决定的。函 数式见上图
根据放射免疫分析法的基本原理，建立放 射免疫分析必须具备以下技术条件：
1、可靠的标准品 2、高比活度的标记品 3、高亲和力的抗体 4、合适的分离技术 5、理想的曲线拟合方式
二、基本方法
RIA和IRMA低剂量区的不确定因素 示意图
IRMA的标准曲线
IRMA的特点
1、属于非竞争性抗原抗体结合反 应；
2、抗原抗体复合物的与抗原的量 正相关
3、在低剂量区不会有不确定因素 4、IRMA的非特异性结合对低剂量
区的影响大
二、基本方法
1、双抗体夹心法 2、标记第三抗体法 3、生物素-亲和素系统的应用
2）高特异性
抗体必须与反应系统中抗原以外的 物质尤其是抗原类似物结合得少， 以免影响分析结果
抗体特异性的测定： 方法：测抗体的交叉反应率 交叉反应率越小，抗体的特异性越 高
3）高滴度
滴度 是抗体实际应用时的稀释倍数 抗体的滴度越高，其中的干扰物质
的影响就越小。 滴度的测定：以一定浓度的*Ag与稀释
同上
血浆皮质醇 RIA
判断肾上腺皮质\垂体功能.Cushing
上午8时: 50~280μg/l 综合征,肾上腺肿瘤、肿瘤、应激
午夜: 20~ 80μg/l 妊娠、服用避孕药等增高，肾上腺
胰岛激素
皮质功能减退时减低
胰岛素 放免 4~16.8mU/l
升高时有利于糖尿病分型诊断
C肽
放免 0.8~4. 0μg/l 糖尿病分型\治疗\判断预后
一、基本原理
竞争性抑制 被测量的微量物质Ag（未标记抗原）
和标记有放射性核素的该种物质*Ag(标记抗原)对其抗 体Ab有相同的结合能力，反应时， Ag和 一定量的 *Ag竞争有限量的Ab。生成的*AgAb的量随Ag的增加 而减少，呈负相关关系。
反应达到平衡后，分离*AgAb （B）与*Ag（F），B 、F或B/F与Ag的量呈函数关系，利用这一函数关系 求出待测抗原的的浓度。
（二）误差的来源
1、系统误差：这种误差表现为检测结 果呈倾向性的偏高或偏低，常有一些可 以确定的因素导致，如：量器不准、试 剂不纯、标准品的定量不准、仪器状态 不佳、分离效果不好、不适当的曲线拟 合模型等等，系统误差是通过努力可以 消除的。
2、随机误差：这种误差多由难以确定 且无法控制的原因引起，误差的出现是 随机的，由各种偶然因素造成，符合正 态分布，如量取液体或分离时的误差。
反应式
具体方法
用一系列浓度已知的标准抗原（浓度递 增的标准品）在严格相同的条件下与一定量 的*Ag和有限量的Ab共同反应，反应达到平 衡后，分离B与F，测定B的放射性做为纵坐 标，以每一反应管的标准品浓度为横坐标， 绘成标准曲线。根据被测抗原试管中的B的 CPM值在标准曲线上求出该抗原的浓度
函数式
（三）实验室内部质量控制
实验室内部质量控制侧重对检测质量 的控制，它保证从收集样本开始到发 出报告为止的全过程中，能及时发现 检测过程中出现的各种误差，分析产 生的原因，找出纠正的办法，以确保 检测的质量。
常用以下指标对检测结果做可靠性评 价：精密度、准确度、特异性、灵敏 度、稳定性、有效性
1、精密度（precision）是指在相同条件 下对某一样品多次检测所得结果的符合 程度，即复管的重复性，它是最重要的 质量参数。 常用精密度图来评价实验室 内部的精密度水平。
诊断原发性肝癌.急慢性活动性肝炎\
胎儿畸形也可升高.可作肝癌手术和
化疗后预后观察.
NSE 放免，<15μg/l
小细胞未分化肺癌\脑神经母细胞瘤\神
经内分泌肿瘤\脑损伤
降钙素 放免，<29.3pmol/l 甲状腺隋样瘤,早期诊断小细胞肺癌,甲
亢时异常升高,判断肾功能\钙磷代谢.
前列腺酸性 放免，<4μg/l 前列腺癌时明显升高,肥大时轻度升高,
1）第一抗体与试管联接 2）第二抗体与试管联接
（三）数据处理
1、logit-log模型 2、四参数logistic模型： 3、四参数质量作用定律模型 U={（A-D）/[1+（X/C）B]}+D 其中U为各试验管结合率（含NSB） A、B、C、 D分别为0剂量时的结合率， logit-log函数的斜 率，各点实际结合率下降一半时X的量，NSB。