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氨基酸的分析方法及其应用进展2

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收稿日期:2003207210

作者简介:丁永胜,男,博士,E2mail:dingysh

—2000@

yahoo.com.

通讯联系人:牟世芬,女,研究员,博士生导师,Tel:(010)62849239,E2mail:shifenm@mail.rcees.ac.cn.

氨基酸的分析方法及其应用进展丁永胜1,　牟世芬2(1.北京大学药学院化学生物系,北京100083;2.中国科学院生态环境研究中心,北京100085)摘要:从衍生试剂角度,介绍了不同衍生化氨基酸的分析方法,包括离子交换色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法和毛细管电泳法,以及无需衍生化的直接分析法高效阴离子交换色谱2积分脉冲安培法,并总结了蛋白质、食品和生理体液样品中的氨基酸分析方法。关键词:氨基酸;分析;衍生化;应用;综述中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:100028713(2004)0320210206

DevelopmentofAnalyticalMethodsforAminoAcidsandTheirApplications

DINGYongsheng1,MOUShifen2(1.DepartmentofChemicalBiology,SchoolofPharmaceuticalSciences,PekingUniversity,

Beijing100083,China;2.ResearchCenterforEco2environmentalSciences,TheChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China)

Abstract:Differentanalyticalmethodsforaminoacids,includingionexchangechromatography(IEC),highperformanceliquidchromatography(HPLC),gaschromatography(GC)andcapillary

electrophoresis(CE)areintroducedinlightofderivatization.Highperformanceanionicexchangechromatographywithintegratedpulsedamperometricdetection(HPAEC2IPAD)methodfordirectaminoacidanalysiswasalsopresented.Theapplicationsofthemethodsforaminoacidanalysisinproteins,foods,physiologicalfluidsandchiralseparationaswellarealsoreviewed.Keywords:aminoacid;analysis;derivatization;application;review

1958年Spackman等[1]首次报道了氨基酸自动分析方法。经过40多年的发展,氨基酸分析方法得到不断的改进和完善,由最初的阳离子交换色谱分离2柱后茚三酮衍生化方法发展为多种分析方法并存,互相取长补短。这些方法可以归纳为两类:一、衍生化间接分析法,包括衍生化离子交换色谱法、衍生化高效液相色谱法、衍生化气相色谱法和衍生化毛细管电泳法;二、无需衍生化的直接分析法,主要指高效阴离子交换色谱2积分脉冲安培法(HPAEC2I2PAD)。1　衍生化间接分析法 衍生化间接法是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的化合物。大多数氨基酸不含有芳香环等生色团,无法直接用紫外法检测,需要先将氨基酸衍生为具有较强紫外或荧光吸收的衍生物。在气相色谱法中,由于氨基酸含有羟基、羧基和氨基等极性基团,不易挥发,因此需要将其衍生为易挥发的非极性化合物以便于分离。1.1　衍生化离子交换色谱法 氨基酸自动分析仪的分析原理是基于阳离子交换树脂分离2柱后茚三酮衍生化分光光度检测方法。该方法以阳离子交换树脂为固定相、酸性缓冲液为流动相,在柱后流出液中加入茚三酮使氨基酸生成具有可见光吸收的衍生物进行检测,具有重现性好、仪器稳定、结果可靠等优点,适合于大量常规样品的分析。另外,由于衍生化反应发生在氨基酸与其他物质分离之后,因而避免了其他物质的干扰,适合未知复杂样品中氨基酸的分析。其缺点是仪器复杂,

体积大,费用高。此外,由于脯氨酸的测定波长为440nm,而其他氨基酸的测定波长为570nm,

因此

脯氨酸不能和其他氨基酸同时测定。1.2　衍生化高效液相色谱法 柱前衍生化高效液相色谱法分析氨基酸具有分

2004年5月May2004色谱ChineseJournalofChromatographyVol.22No.3210～215析时间较短、方法灵活多样、灵敏度高的优点,已经逐渐取代衍生化离子交换色谱法在许多领域中的应用。柱前衍生化高效液相色谱法一般采用C18键合硅胶为固定相、极性溶剂/弱酸盐缓冲液为流动相。常用的衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)[2]、萘22,32二甲醛(NDA)[3]、92芴甲基氯甲酸酯(FMOC)[4]、异硫氰酸苯酯(PITC)[5]、丹酰氯(Dansyl2Cl)[6]、4,42二甲胺基偶氮苯24′2磺酰氯(DABS2Cl)[7]、62氨基奎啉2N2羟基琥珀酰亚胺碳酸盐(AQC)[8]和2,42二硝基氟苯(DNFB)[9]等。OPA衍生化方法具有样品制备简单、衍生化反应迅速、容易实现自动化操作和灵敏度高的优点,而且试剂本身不发荧光,不会干扰氨基酸的测定;缺点是OPA不能和仲氨酸反应,与胱氨酸的衍生物产生的荧光强度较低且不稳定。FMOC衍生化方法灵敏度高,反应快速,FMOC能与仲氨酸反应;缺点是衍生副产物干扰测定,需用戊烷将反应过程中剩余的衍生试剂萃取出以中止衍生反应并避免衍生物的水解。PITC衍生试剂可同时测定伯氨酸和仲氨酸,衍生副产物对测定无干扰,衍生物非常稳定(在干燥条件下可在冰箱中长期储存);缺点是流动相中的杂质和含硫氨基酸(半胱氨酸和高半胱氨酸)形成的二硫化合物会干扰亮氨酸的测定[10],不能同时测定胱氨酸和半胱氨酸,样品制备需较长时间(30min以上),衍生化反应过程中需真空蒸发装置,不利于衍生反应的自动进行。Dansyl2Cl方法具有衍生反应迅速、样品制备简单、灵敏度高和剩余衍生试剂不需除去等优点;缺点是流动相中的杂质和衍生副产物对测定有干扰[11]。DABS2Cl方法可同时测定伯氨酸和仲氨酸,衍生物在室温条件下稳定,检测波长在436～460nm处仍有较高的专属性和灵敏度;缺点是与一些氨基酸(精氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸)不能进行定量反应,而且产物成分复杂[12]。AQC方法适合于复杂样品中的氨基酸分析,具有灵敏度高、衍生物稳定等优点。DNFB方法的优点有衍生产物稳定、操作简便、成本低等。除了以上几种常见的衍生试剂外,还有几种新的改进试剂。以异硫氰酸苄酯(BzITC)[13]和异硫氰酸丁酯(BITC)[14]为衍生试剂,其衍生物稳定,能同时测定半胱氨酸和胱氨酸,试剂有挥发性容易除去。使用荧光衍生试剂N2羟基琥珀酰亚胺基2α2(92吖啶)2乙酸盐(HSAA)[15],反应后剩余试剂无需萃取,产物稳定,有较高的专属性和灵敏度。以二氢苊252磺酰氯(AcNSCl)为衍生试剂,其衍生物的荧光强度是Dansyl2Cl的10～25倍,而且衍生化反应速度比Dansyl2Cl的快115倍[16]。此外还有使用多种芳基碳氧酰氯[17],包括42苯基偶氮苄基碳氧酰氯(PAZ2Cl)、对硝基苄基碳氧酰氯(PNZ2Cl)、邻硝基苄基碳氧酰氯(ONZ2Cl)、22萘基碳氧酰氯(NOC2Cl)、22(萘甲基)碳氧酰氯(NMOC2Cl)等衍生试剂,对一些蛋白水解液进行分析,结果与FMOC方法一致。1.3　柱前衍生化气相色谱法 气相色谱法分析氨基酸具有分离时间短、柱效高、容易和质谱仪联用等优点。氨基酸含有羧基、羟基、氨基和硫基等极性基团,需要先对其衍生化。衍生化方法有两种:两步法和一步法。两步法是先将羧基用短碳链脂肪醇酯化,然后再用各种酸酐将N2(O,S)基团乙酰化。常用的衍生试剂有三氟乙酰(TFA)[18]、五氟丙酰(PFP)[19]、正丙醇[20]、七氟丁

酰(HFB)和异丙醇[21]等。一步法是用烃基氯甲酰酯在水、醇类和吡啶介质中将氨基酸一步衍生化生成烃基碳氧酰烃基酯[22]。这种方法的优点是可同时将极性基团衍生化,反应可以在水溶液中进行,反应速度快,仅需几秒,衍生试剂便宜;缺点是不能与胍基、吲哚基、咪唑基和羟基完全反应。1.4　衍生化毛细管电泳法 毛细管电泳(CE)具有微量、灵敏和柱效高的特点,适合于氨基酸手性分离和复杂样品中的氨基酸分析。用于氨基酸分析的毛细管电泳主要采用两种分离模式:毛细管区带电泳和胶束电动毛细管电泳。检测方式主要有紫外法和荧光法。由于检测池的体积小和光路短,紫外法的应用受到一定的限制。 用在衍生化高效液相色谱法中的多数衍生试剂也适用于衍生化毛细管电泳法。在CE中常用的衍生试剂有OPA[23]、NDA[24]、Dansyl2Cl[25]、FMOC[26]、(+)2和(-)212(92芴基)乙基氯甲酰酯(FLEC)[27]、

22(92蒽基)乙基氯甲酰酯(AEOC)

[28]、二氢荧光素异

硫氰酸酯(FITC)[29]、32(42羧基苯甲酰基)222喹啉羧基甲醛(CBQCA)[30]等。此外用于激光诱导荧光法的衍生试剂有四甲基罗丹明硫代氨基甲酰(TRTC)[31]、92氰基2N,N,N′2三乙基2N′2(琥珀酰亚

胺碳氧酰苯基)焦宁氯(CTSP)[32]、12甲基碳氧酰吲嗪23,52二醛(IDA)[33]、32(对2羧基苯基)喹啉222羧醛(CBQ)[34]、二羰菁琥珀酰亚胺酯(DCC)[35]等。

衍生化毛细管电泳法除了可以进行柱前衍生化外,还可以进行柱内和柱后衍生化。柱内衍生化要求反应速度快,一般采用串联或“夹心饼”两种形式进行,具有试剂和样品用量少的优点。Ewing研究小组[36,37]曾采用柱内衍生化方法测定了一个单细胞中的10～18mol水平的氨基酸。柱后衍生化可以避免柱前或柱内衍生化时其他化合物对衍生反应的干扰,缺点是柱后反应装置体积大,会引起色谱峰

・112・　第3期丁永胜等:氨基酸的分析方法及其应用进展

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氨基酸序列比对算法及其应用

氨基酸序列比对算法及其应用

氨基酸序列比对算法及其应用在生命科学领域中，分析和比对蛋白质序列是一项重要的工作。

而氨基酸序列比对算法就是这样一种能够比对蛋白质序列的算法。

本文将介绍氨基酸序列比对算法的原理、分类以及应用。

一、氨基酸序列比对算法的原理氨基酸序列比对算法是通过对序列进行比较，寻找其间的相似性和差异性。

首先，要进行氨基酸序列的比对，就需要将不同的氨基酸对齐。

这个过程中，将会出现三种情况，即完全匹配、部分匹配和不匹配。

在这个过程中，需要考虑一些因素，如突变、插入或缺失等，这些都会影响氨基酸序列比对的结果。

比对的结果通常表示为一个分数或得分矩阵。

得分矩阵分为两种：一种是相似性矩阵，它表示不同氨基酸之间的相似性得分；另一种是惩罚矩阵，它表示不同氨基酸之间的惩罚得分。

这些得分矩阵的选择将影响比对结果的准确性。

二、氨基酸序列比对算法的分类氨基酸序列比对算法通常被分类为全局比对和局部比对。

全局比对算法比对两个序列的全部长度，而局部比对算法则比对两个序列中的一部分。

全局比对算法的常见算法包括 Needleman-Wunsch 算法和Smith-Waterman 算法。

Needleman-Wunsch 算法假设序列中没有缺失或插入，即两个序列的长度相等。

然而，当序列大小相差较大时，这种算法就不太适用了。

而 Smith-Waterman 算法则是一种局部比对算法，它比 Needleman-Wunsch 算法更加敏感。

这种算法允许序列在某些位置出现插入或缺失，从而能够在某些情况下比对出相似性。

三、氨基酸序列比对算法的应用氨基酸序列比对算法在生物信息学和生物学研究中有广泛的应用。

比对结果可以用于了解分子进化、功能和结构的演化，并且还可以通过比对结果分析基因组的结构和性质。

此外，比对序列也可用于预测蛋白质结构、功能和表达的模式等。

总之，氨基酸序列比对算法是生命科学领域不可或缺的工具，可以帮助我们了解生命中复杂的进化和功能。

在以后的工作中，需要根据不同的需求选择不同的方法来进行氨基酸序列比对。

氨基酸的分离鉴定纸层析法

氨基酸的分离鉴定纸层析法

氨基酸的分离鉴定纸层析法引言：氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于生物体的正常生理功能至关重要。

因此，准确地分离鉴定氨基酸成分对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。

纸层析法是一种简单而有效的分离和鉴定氨基酸的方法。

本文将介绍氨基酸的分离鉴定纸层析法并探讨其应用。

一、纸层析法的原理纸层析法是利用气相平衡原理进行物质分离的一种方法，其原理是根据物质在纸上各组分的相对亲疏性，通过运动距离的差异来分离物质。

在氨基酸的分离鉴定中，纸层析法通过将待测氨基酸溶液滴于纸上，然后将纸立起来，将纸的下端浸入相应的溶剂中，使得溶剂上升，通过毛细作用将氨基酸上提，最终实现氨基酸的分离和鉴定。

二、纸层析法的步骤1. 准备工作：制备纸层析板和显色剂。

2. 样品处理：将待测氨基酸溶解于适量的溶剂中，使其浓度适宜，然后滴于纸层析板上。

3. 运行纸层析：将纸层析板立起，纸的下端浸入相应的溶剂中，待溶剂上升到一定高度后，取出纸层析板。

4. 显色：将纸层析板放置于显色剂中，通过氨基酸与显色剂的反应，使得氨基酸在纸上显色。

5. 结果鉴定：根据显色的位置、颜色和强度等特征，对氨基酸进行鉴定和定量分析。

三、纸层析法的应用1. 氨基酸组成分析：纸层析法可用于分析蛋白质中氨基酸的组成，从而揭示蛋白质的结构和功能。

2. 质量控制：纸层析法可用于对食品、药品等中氨基酸含量的快速检测，保证产品质量和安全性。

3. 生物体内氨基酸代谢研究：纸层析法可用于研究生物体内氨基酸的代谢途径和代谢产物。

四、纸层析法的优缺点纸层析法作为一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法，具有以下优点：1. 简单易行：操作简单，不需要复杂的仪器设备，成本低廉。

2. 分离效果好：对于氨基酸的分离效果较好，可以得到较为准确的结果。

3. 易于观察：通过显色剂的反应，可以直观地观察到氨基酸在纸上的分离和鉴定结果。

然而，纸层析法也存在一些缺点：1. 分离效果有限：对于某些结构相似的氨基酸，纸层析法的分离效果不佳，难以实现准确鉴定。

OPA-FMOC联用柱前衍生化法氨基酸类成分测定原理及其在药物分析中的应用

OPA-FMOC联用柱前衍生化法氨基酸类成分测定原理及其在药物分析中的应用


流动相梯度：
时间(min) 0.0 12.0 15.0 30.0 35.0 38.0 49.0 52.0
流动相B（%） 0 22 22 70 70
100 100
0
流速（ml·min-1） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.5 1.5 1.0
每次实验前 要根据实际 情况，对梯 度进行微调
样品配制
单位： mg/mL
试验注意事项
流动相PH值必须精确调节至7.20±0.05
PH值 ，这样才能保证试验的可重复性
试验开始前，各泵一定要用纯水过度，
泵
特别是B泵（有机相），避免流动相中盐
的析出而损坏泵
衍生 试剂
衍生试剂稳定性较差，长时间放置后会 氧化变质，色谱峰增多，干扰检测。一 般在4℃下可以保存1周左右
OPA-FMOC联用柱前衍生化法
1986年惠普/安捷伦将OPA和FMOC衍生反应依次 结合，实现了氨基酸的全自动衍生、色谱分离和 检测。
让样品先与OPA试剂充分反应，将一级氨基酸全部 反应完全，接着样品中剩余的二级氨基酸再与 FMOC反应。
由于FMOC、FMOC衍生物和反应副产物比任何 OPA衍生物的疏水性都强，所以它们不会干扰任何 一级氨基酸的检测。
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
柱前自动衍生过程
从1号瓶中吸取0uL水
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
柱前自动衍生过程
从4号瓶吸取1uLOPA试剂
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
柱前自动衍生过程
从1号瓶中吸取0uL水
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
柱前自动衍生过程
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
氨基酸测定方法

氨基酸测定方法

氨基酸测定方法一、引言氨基酸是构成蛋白质的基本单位，因此对于蛋白质的研究和分析，氨基酸的测定是非常重要的。

目前，常用的氨基酸测定方法主要有色氨酸法、二硫化物法、硫酸铜法、乙醇胺法、二甲基乙二胺法等。

本文将从样品处理、试剂配制、实验步骤和数据处理等方面详细介绍氨基酸测定方法。

二、样品处理1. 样品收集：选择适当的组织或液体样品进行采集，如血清、尿液等。

2. 样品预处理：根据不同样品特点进行预处理，如尿液中可加入少量硝酸使其变为无色透明状态。

3. 样品保存：在低温条件下保存样品以避免其蛋白质降解。

三、试剂配制1. 氢氧化钠溶液：取固体氢氧化钠加入去离子水中搅拌至完全溶解。

2. 硫代乙酰胺溶液：取固体硫代乙酰胺加入去离子水中搅拌至完全溶解。

3. 氨基酸标准溶液：将各种氨基酸按照一定比例加入去离子水中，调节pH值至7.0左右。

4. 还原剂：取固体羟肟酸钠加入去离子水中搅拌至完全溶解。

四、实验步骤1. 样品处理：取适量的样品加入硫代乙酰胺溶液中，混合均匀后放置于60℃恒温水浴中反应20分钟。

2. 加入还原剂：将还原剂加入反应体系中，混合均匀后再次放置于60℃恒温水浴中反应20分钟。

3. 加入氢氧化钠溶液：将氢氧化钠溶液加入反应体系中，混合均匀后放置于60℃恒温水浴中反应30分钟。

4. 加入试剂：取适量的氨基酸标准溶液和待测样品分别加入反应体系中，混合均匀后放置于室温下静置10分钟。

5. 测定吸光度：使用分光光度计在570nm波长下测定反应体系的吸光度值。

五、数据处理1. 绘制标准曲线：将不同浓度的氨基酸标准溶液分别测定吸光度值，绘制标准曲线。

2. 计算待测样品中氨基酸含量：根据待测样品的吸光度值和标准曲线计算其中氨基酸含量。

3. 数据统计分析：对实验数据进行统计分析，如平均值、方差等。

六、注意事项1. 实验过程中要注意卫生和安全，避免试剂进入眼睛和口腔。

2. 样品处理时要避免过度稀释或过度浓缩，以保证实验结果的准确性。