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转录组学和蛋白质组学的异同点
转录组学和蛋白质组学是生物信息学领域的两个重要分支。
它们都是研究生物分子的表达和功能，但是它们有着不同的研究对象和方法。
转录组学主要研究基因的转录过程，即DNA转录成RNA的过程。
蛋白质组学则研究蛋白质的表达和功能。
在实验方法上，转录组学主要采用高通量测序技术，如RNA-seq，微阵列芯片等，来获取RNA序列和表达谱数据。
而蛋白质组学则采用质谱技术，如液相色谱-质谱(LC-MS/MS)，来鉴定和定量蛋白质。
在数据分析上，转录组学主要涉及到数据的预处理、差异表达分析、功能注释等方面。
而蛋白质组学则需要进行蛋白质定量、鉴定、功能注释等方面的数据分析。
总的来说，转录组学和蛋白质组学虽然研究的对象不同，但它们都是从基因到蛋白质的生物分子表达和功能的角度，来探究生命的奥秘。
两者的结合可以更全面地理解生物系统的运作机理。
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基于蛋白质组学方法研究针灸在中西医结合治疗神经系统疾病中的作用及机制研究方案：基于蛋白质组学方法研究针灸在中西医结合治疗神经系统疾病中的作用及机制一、引言神经系统疾病严重影响人们的生活质量和健康，中医针灸作为一种传统疗法在治疗神经系统疾病中具有悠久的历史和广泛的应用。
然而，针灸的治疗机制尚未完全阐明。
随着蛋白质组学方法在生物医学研究中的广泛应用，研究针灸在中西医结合治疗神经系统疾病中的作用及机制成为项目的研究重点。
本研究的目标是运用蛋白质组学方法，探究针灸对中西医结合治疗神经系统疾病的作用机制，提出新的观点和方法，并为解决实际问题提供有价值的参考。
二、研究方案1. 研究目标与意义研究目标：探究针灸在中西医结合治疗神经系统疾病中的作用机制。
研究意义：深入了解针灸治疗神经系统疾病的作用机制，有助于优化针灸治疗方案，提高疗效，为临床实践提供科学依据。
2. 研究内容与方法研究内容：（1）神经系统疾病患者的临床信息收集与筛选。
（2）针灸治疗神经系统疾病的临床实验设计与实施。
（3）蛋白质组学方法在针灸治疗过程中的应用。
（4）数据采集与分析，结果解读。
研究方法：（1）收集神经系统疾病患者的临床信息，包括临床病例、疗效评估等。
（2）设计随机对照实验，选取一定数量的神经系统疾病患者，分为观察组和对照组，观察组采用针灸治疗，对照组采用传统治疗方法，如药物治疗。
（3）通过蛋白质组学方法，分析针灸治疗前后患者的脑蛋白质表达水平变化，采用质谱技术进行分析，如二维凝胶电泳、液相色谱质谱等。
（4）整理和分析采集到的蛋白质组学数据，通过信号通路分析、功能富集分析等方法，探究针灸对神经系统疾病的影响及其作用机制。
3. 方案实施（1）收集神经系统疾病患者的临床信息：通过医院医疗记录系统，收集符合研究要求的神经系统疾病患者的临床信息，包括基本信息、病史、临床症状及疗效评估等。
（2）临床实验设计与实施：根据研究目标，设计随机对照实验。
蛋白质组学复习资料一、名词解释1、蛋白质组学：蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
2、二维（双向）电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。
二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。
3、三步纯化策略：第一步:粗提。
纯化粗样快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶)最适用层析技术: 离子交换/疏水层析第二步：中度纯化。
去除大部分杂质最适用层析技术: 离子交换/疏水层析第三步：精细纯化。
达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物)最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析4、高效纯化策略：在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。
5、离子交换色谱：离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。
如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。
固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。
阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。
其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。
一、教学目标1. 知识与技能：（1）了解生物组织中糖类、脂肪、蛋白质的基本概念及生理功能。
（2）掌握检测生物组织中糖类、脂肪、蛋白质的实验原理及方法。
（3）能够独立完成生物组织中糖类、脂肪、蛋白质的检测实验。
2. 过程与方法：（1）通过实验观察生物组织中糖类、脂肪、蛋白质的特性。
（2）学会使用化学试剂进行生物组织中糖类、脂肪、蛋白质的检测。
（3）培养学生的实验操作能力和团队协作能力。
3. 情感态度与价值观：（1）培养学生对生物学实验的兴趣和好奇心。
（2）培养学生尊重科学、实事求是的态度。
（3）培养学生关注人类健康和生命科学的责任感。
二、教学内容1. 糖类的基本概念、分类及生理功能。
2. 脂肪的基本概念、分类及生理功能。
3. 蛋白质的基本概念、分类及生理功能。
4. 检测生物组织中糖类的实验方法及步骤。
5. 检测生物组织中脂肪的实验方法及步骤。
6. 检测生物组织中蛋白质的实验方法及步骤。
三、教学重点与难点1. 教学重点：（1）生物组织中糖类、脂肪、蛋白质的基本概念及生理功能。
（2）检测生物组织中糖类、脂肪、蛋白质的实验原理及方法。
2. 教学难点：（1）检测生物组织中糖类、脂肪、蛋白质的实验操作技巧。
（2）实验结果的分析和解释。
四、教学准备1. 实验材料：生物组织样本（如苹果、花生、鸡蛋等），化学试剂（如斐林试剂、苏丹Ⅲ染液、双缩脲试剂等）。
2. 实验仪器：显微镜、试管、滴定管、天平等。
3. 教学课件和教材。
五、教学过程1. 导入新课：通过展示生物组织样本，引导学生思考如何检测其中的糖类、脂肪、蛋白质。
2. 讲解糖类、脂肪、蛋白质的基本概念及生理功能。
3. 讲解检测生物组织中糖类、脂肪、蛋白质的实验原理及方法。
4. 分组讨论：让学生根据实验原理及方法，讨论如何进行实验操作。
5. 实验操作：学生分组进行实验，教师巡回指导，解答疑问。
6. 实验结果展示：学生将实验结果进行展示，分析并解释结果。
7. 总结与评价：教师对实验结果进行评价，总结生物组织中糖类、脂肪、蛋白质的检测方法及注意事项。
基因组学与蛋白质组学第一部分：基因组学及其研究内容基因组（GENOME）：1920年Winkles 从 GENes 和 chromosOEs 铸成的,用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念。
1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构,标志分子生物学的诞生,随着各学科的发展，当前生物学研究进入新的时代，在生物大分子水平上将不同的研究技术和手段有机的结合以攻克生物学难题。
基因组可以理解为:1、基因表达概况研究 ,即比较不同组织和不同发育阶段、正常状态与疾病状态,以及体外培养的细胞中基因表达模式的差异,技术包括传统的RT-PCR, RNase保护试验，RNA印迹杂交。
但是其不足是一次只能做一个,新的高通量表达分析方法包括微点阵(Microarrary),基因表达序列分析(serial analysis of gene expression, SAGE), DNA 芯片( DNA chip )等；2、基因产物—蛋白质功能研究，包括单个基因的蛋白质体外表达方法，主要是利用DNA重组技术，以及蛋白质组研究；3、蛋白质与蛋白质相互作用的研究，利用酵母双杂交系统、单杂交系统（one hybrid system），三杂交系统（three hybrid system）以及反向杂交系统（reverse hybrid system）。
基因组学(Genomics)：1986年美国科学家Thomas Roderick 提出了基因组学(Genomics), 指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱)，核苷酸序列分析,基因定位和基因功能分析的一门科学。
基因组研究应该包括两方面的内容:1）结构基因组学(structural genomics):以全基因组测序为目标2）功能基因组学(functional genomics):以基因功能鉴定为目标（又被称为后基因组(postgenome)研究）结构基因组学代表基因组分析的早期阶段, 以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。
蛋白质的提取方法选择材料及预处理以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。
在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。
蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。
对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。
植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。
对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。
另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
常⽤分⼦⽣物学实验技术--整理常⽤的分⼦⽣物学实验技术：离⼼技术： 是分离纯化蛋⽩质、酶、核酸（DNA、RNA）、细胞的最常⽤⽅法之⼀。
电泳（electrophoresis）：带电粒⼦在电场中向着与其所带电荷相反⽅向电极移动的现象。
可⽤于分离不同分⼦量的⽣物⼤分⼦。
1.蛋⽩质的电泳： ⽤途：蛋⽩质的定量。
2.核酸的电泳： ⽤途：⽤于核酸的分离、鉴定、纯化、回收。
⽐如：我只需要长度300bp左右的分⼦。
那么，电泳后，在切胶过程中，只切300bp处的分⼦即可。
蛋⽩质研究相关的技术： 1. 含量测定： 2. 结构的测定： （1）⼀级结构的测定：搞清楚蛋⽩质肽链的氨基酸排列顺序。
⽅法：Edman降解法、质谱法（MS, 将蛋⽩⽔解，多肽链分成⼩段。
检测肽段） （2）空间结构测定：蛋⽩空间结构分析⽐⼀级结构分析复杂得多。
⽅法：X射线衍射晶体分析法、核磁共振法等。
3. 功能的测定： （1）酵母双杂交（YTH）： 假设：欲检测蛋⽩X与蛋⽩Y是否相互作⽤。
检测⽅法： 将蛋⽩X与报告基因转录因⼦的BD融合； 将蛋⽩Y与AD融合； 确认蛋⽩X与蛋⽩Y形成的复合体能否激活报告基因的表达。
如果能激活报告基因的表达，说明：X与Y形成了复合体，则BD和AD靠近，激活了下游报告基因的表达；反之，报告基因不表达。
原理： 真核⽣物的转录因⼦（尤其是酵母转录因⼦GAL4），包括两个彼此分离、但功能必需的结构域：⼀个是与DNA结合的结构域-BD；⼀个是转录激活域-AD。
BD识别转录因⼦效应基因的上游序列并与之结合；AD通过与转录复合体的其他成分作⽤，启动下游的基因转录。
即使BD与AD分开，但如果在空间上较为接近时也能激活转录。
——利⽤转录因⼦的BD、AD这⼀特性，通过检测转录因⼦是否启动了其效应基因的表达，可研究蛋⽩质X与Y是否相互作⽤。
（2）蛋⽩质芯⽚技术：⼀种⾼通量、微型化、⾃动化的蛋⽩质分析技术。
⼀次试验中可同时检测⼏百甚⾄⼏千种⽬标蛋⽩或多肽。
4.1生物组织中糖类、脂肪、蛋白质的检测一、实验内容分析《生物组织中糖类、脂肪和蛋白质的检测》是人教版必修一第二章第1节的一个探究性实验，这是教材中第一个可以引导学生进行初步探究的实验，所以上好该实验不仅对培养学生的探究能力有重要作用，而且可以使学生体会探究思想，初步掌握科学探究的一般方法。
新课标教材把此实验安排在学习蛋白质、糖类和脂肪等知识内容之前，目的在于一方面为接下来学习各类有机物奠定感性认识基础，另一方面，由于实验内容的设置上注重学生对材料的选择，对检测结果的预期和实验方案的设计，因此有利于培养学生的实验探究能力，为以后各章节的探究性实验的顺利开展奠定了基础。
本实验是一个面向全体学生的探究实验，力求使每一个学生在原有的水平上都有所收获、有所提高。
二、学科核心素养与课程目标（一）生命观念在实验中不断探索与研究，在不断发现问题，解决问题的过程中，可以促进学生对生命科学知识来源的了解，培养学生的生命观念，同时也增强学生的思考力。
（二）理性思维通过实验原理的分析，让学生明确实验步骤的不同是实验原理的不同造成的，学会通过原理来进行实验步骤的设计，通过小组成员的协作，设计出合理的实验操作流程。
（三）科学探究选择合适的实验器具、试剂和材料，将本小组所设计的实验方案，加以实施；如实记录和分析实验结果，并运用科学术语展示和汇报实验结果。
（四）社会责任通过探究实验，联系生产、生活等实际，逐步使学生能够把理论应用于实际。
三、实验重点及难点重点：检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质的原理和方法。
难点：实验所用材料多，试剂种类和使用方法多，课堂容量大。
四、实验准备1.教师准备（1）实验材料、器具及试剂准备实验材料：梨匀浆、葡萄若干、冰糖雪梨饮料一瓶、牛奶、花生种子器具：烧杯，温度计，水浴缸，酒精灯，石棉网，三脚架，玻璃棒，胶头吸管，试管，试管架，量筒等。
试剂：斐林试剂（包括甲液：浓度为0.1g/mL NaOH溶液；乙液质量浓度为0.05g/ mL CuSO4溶液）、双缩脲试剂（包括A液：质量浓度为0.1g/mLNaOH溶液；B液：质量浓度为0.01g/mLCuSO4溶液）、（2）确认实验的关键和注意事项，做到心中有数，确保安全。
精品文档 精品文档 2、 蛋白质分离的双向电泳过程 2．1溶液配制 常用水化上样缓冲液 （Ⅰ） 尿素 8M 4.805g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水 定容至100ml （Ⅱ） 尿素 7M 4.2g 硫脲 2M 1.52g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水 定容至100ml (Ⅲ) 尿素 5M 3.0g 硫脲 2M 1.52g SB3-10 2% 0.2g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水 定容至100ml 分成10小管，每小管1ml,-80℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液母液 尿素 6M 36g SDS 2% 2g Tris-HCl 0.05M pH8.8 3.3ml(1.5M pH8.8 Tris-HCl) 甘油 20％ 20ml 精品文档 精品文档 MilliQ水 定容至100ml 分装成10管，-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液Ⅰ 胶条平衡缓冲液母液 10ml DTT 0.2g 充分混匀，用时现配。
胶条平衡缓冲液Ⅱ 胶条平衡缓冲液母液 10ml 碘乙酰胺 0.25g 充分混匀，用时现配。
低熔点琼脂糖封胶液 低熔点琼脂糖 0.5％ 0.5g Tris 25mM 0.303g 甘氨酸 192mM 1.44g SDS 0.1% 1ml(10%SDS) 溴酚蓝 0.001％ 100μl(1% 溴酚蓝) MilliQ水 定容至100ml 加热溶解至澄清，室温保存。
30％聚丙烯酰胺贮液 丙烯酰胺 150g 甲叉双丙稀酰胺 4g MilliQ水 500ml 滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。
1.5mol/L Tris碱pH8.8 Tris碱 90.75g MilliQ水 400ml 用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml, 4℃冰箱保存。
10% SDS SDS 10g 精品文档 精品文档 MilliQ水 100ml
10%过硫酸铵 过硫酸铵 0.1g MilliQ水 1ml 现用现配。 10×电泳缓冲液 （1×＝25mM Tris,192mM glycine,0.1% SDS,pH8.3） Tris碱 30g 甘氨酸 144g SDS 10g MilliQ水 1L 混匀后，室温保存。
2．2操作步骤 2.2.1 第一向等电聚焦 1.从冰箱中取水化上样缓冲液，室温溶解；在enpendoff管中，2.0mg蛋白干粉加入200μl水化上样缓冲液，室温下裂解3-4h；10000rpm常温离心10min,取上清液上样水化。具体的上样体积及蛋白质上样量如下表，
ReadyStripTMIPG胶条长度 上样体积 分析型的上样量 （银染） 制备型的上样量 （考马斯亮兰染色） 7cm 125-250μl 10-100ug 200-500ug 17cm 300-600μl 100-300ug 1-3mg
2.从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，于室温放置10min。 3.沿着聚焦盘的边缘由左至右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品一定要连贯，同时注意不要产生气泡。 4.用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层，分清胶条的正负极，轻轻地将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条得正极对应于聚焦盘得正极。确保胶条与电极紧密接触，同时不要使胶条下面的溶液产生气泡。 5.在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。 6.对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 7cm胶条 水化 12h（17-20℃） 主动水化 S1 250V 慢速 2 h 除盐 精品文档 精品文档 S2 500V 慢速 1 h 除盐 S3 1000V 快速 1 h 除盐 S4 4000V 线性 3 h 升压 S5 4000V 快速 25000 伏h 聚焦 S6 500V 快速 任意时间 保持 17cm胶条 水化 12h（17-20℃） 主动水化 S1 250V 慢速 2 h 除盐 S2 500V 慢速 1 h 除盐 S3 1000V 快速 1 h 除盐 S4 8000V 线性 5 h 升压 S5 8000V 快速 60,000 伏h 聚焦 S6 500V 快速 任意时间 保持 选择所放置的胶条数。 设置每根胶条的极限电流。 设置等电聚焦时的温度。 7.聚焦结束的胶条如不立即进行平衡、第二向SDS－PAGE电泳，可将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存1-2天。
2.2.2 第二向SDS－PAGE电泳 1.配制12％的丙稀酰胺凝胶，上部留0.5cm的空间，用MilliQ水封面，保持胶面平整。待凝胶凝固候，倒去分离胶表面的MilliQ水，再用MilliQ水冲洗。 2.从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10min，使其溶解。 3.在桌上先放置干得厚滤纸，聚焦好得胶条胶面朝上放在干得厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后置于胶条上，轻轻吸干胶条上得矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现得纵条纹。 4.将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在槽中加入平衡缓冲液Ⅰ。将样品水化盘放在摇床上缓慢摇晃10-15min。 5.第一次平衡结束后，彻底倒掉平衡缓冲液Ⅰ，将胶条竖在滤纸上，吸去多余得平衡液。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续在摇床上缓慢摇晃10-15min。 6.用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余得液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板再下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。 7.第二次平衡结束后，用滤纸吸去胶条上多余的平衡液。用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。 精品文档 精品文档 8.将放有胶条的SDS－PAGE凝胶转移到灌胶架上，短板一面对着自己，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。 9.用镊子或平头的针头轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡，同时操作时注意不要碰到胶面。 10.放置5min，低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。 11.电泳起始时用低电流（7cm胶条：5-10mA/gel；17cm胶条：10mA/gel）或低电压(7cm胶条：50-75V/gel；17cm胶条75-100V/gel)，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，在加大电流(7cm胶条：10-15mA/gel；17cm胶条：20-30mA/gel)或电压(7cm胶条：150-200V/gel；17cm胶条：300-400V/gel)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 12.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以做记号。然后进行染色。
2．3染色方法 2.3.1考马斯亮蓝G-250染色 固定液：45％（V/V）甲醇，1％（V/V）乙酸 G-250染色液：17％（W/V）硫酸铵，34％（V/V）甲醇，0.5％（V/V）乙酸，0.1％（W/V）G-250. 步骤：1.固定液固定20min或过夜（无需固定液可）。 2.倒出固定液 3.加入G-250染色液，18-24h。 4.倒出染色液 5.用水洗（20min一次，45～55℃温水有助于水洗） 6.可用塑料包裹，4℃贮于密封盆里。
2.3.2胶体考染法 1.用去离子水清洗凝胶两次，每次10min，以去除SDS。 2.固定：50％乙醇/10％冰醋酸/的水溶液，至少30min,可过夜。 3.染色：染色液为45％甲醇/10％冰醋酸/0.25％G-250溶液过滤所得，将凝胶浸泡后染色至少2h。 4.脱色：多次更换脱色液（25％乙醇/8％冰醋酸溶液）直至背景脱净。 5.保存：用保险膜包裹，可存一个月。
2.3.3银染法 步骤 试剂 体积（ml） 不同类型胶所需时间(min) 1mm 1.5mm 1.固定 10％乙酸 / 40％乙醇 / 水 2×250 2×15 2×60 精品文档 精品文档 2.敏化 75ml乙醇 / 17g乙酸钠 / 10ml 5% Na2S2O3 / 250 30 60 1.25ml戊二醛 / 加水至 3.水洗 去离子水 3～5×250 3×15 5×8 4.银染 25ml AgNO3 (2.5%) / 100μl 甲醛/ 加水至 250 20 60 5.水洗 去离子水 2～4×250 2×1 4×1 6.显色 6.25g Na2CO3 / 100μl 甲醛 7μl Na2S2O3(5%) 250 4 6 7.停止 3.65g EDTA 加水至 250 10 40 8.水洗 去离子水 2～3×250 3×5 2×30
3、 等电聚焦蛋白样品的浓度检测 3．1 Bio-Rad RC DC Protein Assay 微离心管检测方法 （1）将5μl DC试剂S与250μl DC试剂A混合（试剂A’），每份样品或标准溶液需要127μl 试剂A’。 （2）将标准蛋白稀释为3-5份蛋白浓度在0.2-1.5mg/ml范围内的标准溶液，在每次测未知蛋白浓度前绘制标准曲线。（为得到最佳结果，标准蛋白应与样品使用同样的缓冲液） （3）从每份样品或标准蛋白中取出25μl，分别加至清洁、干燥的微离心管中。 （4）向每管中加入125μl RC试剂Ⅰ，混旋后室温放置1min。 （5）向每管中加入125μl RC试剂Ⅱ并混旋，之后在15，000×g速度下离心3-5min。 （6）吸去上清，然后将管子倒置在干净吸水纸上，使溶液彻底被吸干。 （7）向每个微离心管中加入 127μl 试剂A’并混旋，在室温下放置5min或直至沉淀彻底溶解。在进行下一步之前再次混旋。 （8）在每个管中加入1ml DC试剂B，立即混旋，室温下放置15min。 （9）在750nm下读取吸光度，吸光度测定要在1h内完成。
3．2 Bradford法 1、溶液的配制 Bradford储存液 100ml 95% 乙醇 200ml 88% 磷酸 350mg 考马斯亮蓝G-250
