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蛋白质组学中的从头测序方法ppt课件

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蛋白质组学介绍-PPT精选文档67页

蛋白质组学介绍-PPT精选文档67页
• PTMs involving addition include:
• Acetylation - the addition of an acetyl group, usually at the N-terminus of the protein
• Alkylation - the addition of an alkyl group (e.g. methyl, ethyl)
• Or - A complete description of proteins expressed in any given cell at any given time
Proteomics
• A cellular proteome is the collection of proteins found in a particular cell type under a particular set of environmental conditions such as exposure to hormone stimulation
• This is due to:
• alternative splicing of genes
• post-translational modifications like glycosylation or Phosphorylation.
alternative splicing of genes
• PTMs involving addition include:
• Phosphopantetheinylation - the addition of a 4'phosphopantetheinyl moiety from coenzyme A, as in fatty acid, polyketide, non-ribosomal peptide and leucine biosynthesis

蛋白质组学全部全套ppt课件

蛋白质组学全部全套ppt课件

1961 1966
Jacob 和Monod Nirenberg
乳糖操纵子模型 遗传密码
1966
Gellert
DNA连接酶
1970 1970 1972 1977 1981 1983 1984 1986 1989 1994 1997 2001
生命科学回顾（续）
Smith
限制性内切酶
Temin
逆转录酶
Berg
•其目的是阐明人类基因组30亿个碱基对的序 列，发现所有人类基因并阐明其在染色体上的 位置，从而在整体上破译人类遗传信息。
•该计划启动于1990年，原定15年完成，由 于技术的成熟与基因组测序的规模化运作，以 及来自商业竞争方面的压力，2000年6月26 日基因组序列草图测序完成。
基因组计划
遗传图 物理图
功能基因组学
转录组学 蛋白质组学 代谢组学 表型组学 相互作用组学 ……
• 功能基因组学采用一些新的技术，如转录组学应用微 阵列(Microarray)、DNA芯片(DNA chip）及 SAGE(Serial analysis of gene expression)等技术， 可对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整 体水平上对基因的活动规律进行阐述，力求从细胞水 平上解决基因组问题，以建立对生命现象的整体认识。
序列图
这三条数据将提供此生物所有基因在染色体上的精确定位、 基因内部序列以及基因的间隔序列。
---原核生物或低等真核生物。
1/2 of all genes “identified” have no known function
人类基因组以及多种模式生物、重要生物
基因组全序列的完成，标志着生命科学研 究进入所谓的“后基因组时代 (Postgenome era)”, 即产生了功能基因 组学（Functional Genomics）

蛋白组学PPT课件

蛋白组学PPT课件
2. 难溶于水或分子量大于18万的蛋白质难于在 2-D胶上显示。
3. 质谱技术虽有较高的灵敏度，但对来自2-D胶 上的许多低丰度的蛋白质仍不能鉴定。
蛋白组学
4.蛋白质的修饰对于蛋白质组蛋白质种类的确定 将是一种“无限”的工作。
5.蛋白质组研究任务是我们面临的“无尽挑战”。
蛋白组学
第三节 蛋白质的生物合成及其干扰
蛋白组学
蛋白质的生物合成参与物质
1. mRNA与密码子
蛋白组学
蛋白组学
蛋白组学
2. 氨基酸的运载工具：tRNA
蛋白组学
3. 核糖体—肽链合成的“装配机器”
蛋白组学
蛋白组学
多核糖体
蛋白组学
二、蛋白质的生物合成过程 （一）、氨基酸的活化
氨基酸活化的总反应式是：
氨基酰-tRNA 合成酶 氨基酸 + ATP + tRNA + 氨基酰-tRNA
第三章 蛋白质组与蛋白质组学
蛋白组学
第一节 蛋白质组与蛋白质组学的定义
蛋白质组
protein + genome
proteome
一种基因组所表达的全部蛋白质
一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质
蛋白组学
一、蛋白质组与蛋白质组学的定义
蛋白质组学 阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式 从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质
蛋白组学
3.在IF-2和GTP的帮助下， fMet-tRNA进 入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与 mRNA上的起始密码子配对。
IF-2 GTP
5'
AUG
3'
DNA-BD具有与报告 基因转录调控区特异结 合的功能，DNA-AD则具 有活化转录的功能。

《蛋白质组研究技术》课件

《蛋白质组研究技术》课件
纯化得到相互作用蛋白。
酵母双杂交技术
利用酵母细胞表达的蛋白与待测蛋白 进行相互作用，筛选出与待测蛋白相 互作用的蛋白。
串联亲和纯化技术
将待测蛋白与其相互作用蛋白一起纯 化下来，再通过分离纯化得到相互作 用蛋白。
03 蛋白质组学在生物医学中 的应用
疾病标志物发现
疾病诊断
通过蛋白质组学技术，发现与疾病相关的特异性蛋白质标志物，有助于疾病的早 期诊断和预后评估。
电泳技术
利用蛋白质在电场中的迁移率不同，将蛋白质分 离成不同的条带。
蛋白质芯片技术
将蛋白质固定在芯片上，通过与待测蛋白质的相 互作用，实现对蛋白质的筛选和检测。
蛋白质鉴定技术
蛋白质鉴定技术
利用各种技术手段对分离得到的蛋白 质进行鉴定，确定其氨基酸序列和分 子量等信息。
氨基酸序列分析
通过测定蛋白质中氨基酸的排列顺序 ，确定蛋白质的种类和来源。
未来发展趋势与展望
技术创新
未来蛋白质组学技术将继续创新 ，如高通量、高灵敏度、高分辨 率的蛋白质检测技术。
跨学科融合
蛋白质组学将与生物信息学、计 算生物学等学科进一步融合，实 现多维度、多层次的数据分析。
临床应用拓展
随着技术的进步和应用研究的深 入，蛋白质组学将在临床诊断、 治疗和药物研发等方面发挥更大 的作用。
分子量测定
利用质谱等技术手段测定蛋白质的分 子量，以验证蛋白质鉴定的准确性。
免疫学检测
利用特异性抗体对蛋白质进行检测和 识别，具有高灵敏度和特异性。
蛋白质功能研究技术
蛋白质功能研究技术
通过各种手段研究蛋白质在生物体内的功能 和作用机制。
细胞生物学技术
通过观察蛋白质在细胞内的定位、分布和动 态变化，研究其功能和作用机制。

蛋白质组学全部全套ppt课件

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蛋白质组研究包括两个方面：
Proteomics
蛋白质组表达模式
The study of global changes in protein expression
蛋白质组功能模式
The systematic study of proteinprotein interactions through the isolation of protein complexes
▪ 基因组表达的各种 mRNA是彼此孤立的， 互不干扰；
蛋白组
相互作用
▪ 蛋白质组中的各种蛋白质 却是彼此间有着广泛的相 互作用；
▪ 蛋白质互作的研究有两类： 第一类是研究蛋白质相互 作用的网络，第二类是研 究蛋白质复合体组成。
基因组
单一手段
▪ 在基因组研究中， DNA测序技术是最基 本和最主要的工具， 因为基因组的均一性 和简单性使得一种单 一的技术就能胜任基 因组的研究任务。
蛋白质组学是研究蛋白质或应用大规模蛋白质分 离和识别技术研究蛋白质组的一门学科，是对基 因组所表达的整套蛋白质的分析。
蛋白质组学可以被广泛定义为生物样本中蛋白 质的系统分析与存档，阐明生物体全部蛋白质的 表达模式及功能模式,其内容包括蛋白质的定性鉴 定、定量检测、细胞内定位、相互作用研究等,最 终揭示蛋白质功能网络。
• 这说明转录和翻译水平对蛋白的含量有几乎相同的重要 性
Why Proteomics?
（2）蛋白质的动态修饰和加工并非必 须来自基因序列
• 蛋白质在翻译后有多种化学修饰,如糖基化、磷酸 化、异戊二烯化、酰化作用等。
• 蛋白质在翻译后还有各种加工过程，如剪切（酶 原降解、结构域拼接）等，不但可以改变其立体 结构，而且是实施其功能与调节的重要结构基础。

蛋白质组学(ppt文档)

蛋白质组学(ppt文档)

6
第一节 蛋白质组学的概念及发展进展
一、蛋白质组和蛋白质组学的概念
蛋白质组（proteome）：PROTEins + genOME，意思是 Proteins expressed by a genome（基因组表达的所有蛋 白质）
1994年由澳大利亚科学家Wilkins提出，是一个动态的概念， 指的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质
approximately 250,000 proteins in the human genome Only 2-5% of proteins in human genome have been identified
2019/11/25
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
Hotspot:对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物 学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需 要和重要任务
2019/11/25
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
4
前言与背景
The era of ‘omics’-based science （组学时代） – Genomics （基因组学） – Post-genomic science （后基因组时代） • Functional genomics （功能基因组学） – Transcriptomics（ 转录组学） – Proteomics （蛋白质组学） – metabonomics／metabolomics （代谢组学） • Structural genomics （结构基因组学） – Aim - 3D structures of all protein folds !

蛋白质组学Proteomics-PPT课件.ppt


ICAT的优点
• ICAT具有广泛的兼容性，主要表现在：(1) 能够兼容分析任何条件下体液、细胞、组 织中绝大部分蛋白质；(2)烷化反应即使在 盐、去垢剂、稳定剂(如SDS、尿素、盐酸 胍等)存在下都可进行；(3)只需分析含Cys 残基的肽段，从而降低了蛋白质混合物分 析的复杂性；(4)ICAT战略允许任何类型的 生化、免疫、物理的分离方法，因此能很 好地定量分析微量蛋白质。
双向凝胶电泳
• 首先利用等电点聚焦来分离不同等电点的 蛋白，再利用SDS－PAGE来分离不同分子 量的蛋白，其分辨率是非常高的。微克级 的蛋白质就可以被很好的分辨开了。
基质辅助的激光解吸电离技术
（MALDI）的发展
• 日本岛津公司的田中耕一的工作，是质谱分析发 展的一个主动力。 1987年，在第二届中－日质谱 分析联合讨论会上，田中耕一论述了软激光解吸 附技术可以使蛋白质分子离子化。一年之后，他 的这篇创造性的论文发表在Rapid Communications in Mass Spectrometry上。田中 耕一的工作为基质辅助的激光解吸电离技术 （Maldi）打下了基础。2019年，他和弗吉尼亚联 邦大学的John B Fenn，由于他们对软吸附电离 方法上的贡献一起被授予了该年度诺贝尔化学奖
应用实例
• 1.通过比较给药前后细胞的蛋白质组, 鉴别出毒理学的蛋白质标志物 。
• 2. 疟疾疫苗的研究。
ICAT技术
同位素标记的亲和标签（isotope-coded affinity tag， ICAT）技术作为一种体外标记稳定同位素的相对定量方法， 已经成为重要的蛋白质组学定量分析方案。2019年，Gygi 等人用化学方法合成一种能和半胱氨酸反应的亲和试剂， 称为稳定同位素编码的亲和标签，它有轻链和重链(稳定重 同位素)两种形式，可以在体外标记不同状态下的蛋白质样 品，酶解并用亲和柱分离纯化被标记的肽段后，再用质谱 进行分析，和体内标记法一样也能够得到成对的峰表示不 同样品中肽段及对应蛋白质含量的差异。这种稳定同位素 亲和标签技术可以广泛地应用在细胞和组织的定量蛋白质 组学分析上，提供精确的蛋白质相对定量数据。

蛋白质组学定量研究常见方法-PPT课件



辉骏生物：fitgene/
免费服务热线：400-699-1663
1：双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量：抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离：蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色（银染、 考染等）。 3、蛋白质的 定性与定量分 析：通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点，质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
4：化学标记法—ICAT
ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子 的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每 个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特 异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰 物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造 成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生β -消除反应 使部分标签断裂。
蛋白质组学定量研究常见方法
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蛋白质组学定量研究常见方法

1：常规双向电泳 2：DIGE 3：15N等同位素标记 4：ICAT 5：iTRAQ 6：SILAC
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蛋白质检测方法Ppt讲课文档

✓ ELISA 和 Western 杂交都利用抗原抗体间的分子识别作用 ，借助不同的抗体分子标记实现蛋白质的检测。
第7页，共41页。
紫外吸收法
✓ 理论基础：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸 残基使其在 280 nm 处具有紫外吸收， 其吸光度与蛋白质含 量成正比。 此外，蛋白质溶液在 238 nm 的吸光度值与肽键 含量成正比。 利用一定波长下蛋白质溶液的吸光度值与蛋 白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。
分子的荧光被敏化增强
第21页，共41页。
✓ 基于蛋白质疏水作用： ✓ 在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水性残基包埋
在分子内部而形成疏水空腔。疏水作用及亲水和疏水平衡在蛋 白质结构与功能方面起着关键作用。
✓ 利用极性敏感有机小分子荧光探针与蛋白质结合前后基于 其疏水空腔提供了一个非极性环境从而导致探针荧光性质的 改变
凯氏定氮法由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此，通过测 定生物样品的含氮量便可估算出样品中的总蛋白质含量 。 蛋白质含量＝含氮量 Х 6.25
此方法的测定范围为0.2～1.0 mg氮。 ✓ 优点：应用范围广，重现性好、准确度高 ✓ 缺点：局限于样品中总蛋白的检测，破坏蛋白质结构，
易受到被测样品中其它有机含氮化合物的干扰
导致在不知道蛋白质种类的情况下测量结果存在部分偏差。
第11页，共41页。
比色法-BCA法
✓ BCA （Bicinchoninic acid) 试剂的主要成分为二喹啉甲酸钠 。 ✓ BCA并不能直接与蛋白质发生化学或是物理上的反应，而是对 双缩脲反应的强化。BCA 极易与 Cu+结合形成紫色的复合物，该 复合物在 562 nm 处有最大吸收峰，对入射光的吸收程度与 Cu+ 的浓度成正比。

蛋白质组学总结ppt课件

如有可能，可加入强变性剂：
8 mol/L 尿素、 10% TCA 或 2% SDS。
但在上述条件时，仍有些蛋白酶保持一定活性，所以 需要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。
13
四、通过沉淀分离蛋白 分离策略： 沉淀蛋白质，使之与其它成份分开，再重悬溶解蛋白 质。 附带作用： 浓缩较稀的样品（如植物、尿液等）。 注意： 某些蛋白会由于重悬造成一定的丢失。
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二、剧烈的裂解方法 用于难以破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有 坚硬细胞壁的细胞，比如酵母。 1）超声裂解法。 2）弗氏压碎法。 3）研磨法。 4）机械匀浆法。 5）玻璃珠匀浆法。
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三、用蛋白酶抑制Байду номын сангаас防止蛋白裂解 细胞裂解，蛋白酶释放出来，必须加以抑制。
蛋白酶在低温下无活性，所以尽量在低温制备。
一个细胞内的全套蛋白质，反映特殊阶段、环境、状
态下细胞或组织在翻译水平的蛋白表达谱。
2
2、技术路线与相关技术
技术路线
蛋白提取 样品 酶切消化 蛋白混合物
双向电泳 蛋白图谱 肽段 数据库 酶切消化
肽段混合物 双向电泳
质谱分析 数据库检索 质谱数据
3
第二章 蛋白质组研究方法
蛋白质组的技术基础 （三大支撑技术）： 双向电泳（2-DE），可以分离数千种蛋白质。 生物质谱技术，精确测定多肽质量及序列。 计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。
2 ）冻融裂解：用液氮迅速冷冻细胞 (1-2 min) ，随后在
37℃ 融化(1-2 min) ，反复几次。
10
3 ）去污剂裂解：主要用于组织细胞。含有去污剂的缓冲 液重悬细胞。 4 ）酶裂解法：裂解植物、真菌和细菌等有细胞壁的细胞。 等渗缓冲液含有某种酶：
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Database-Dependent Methods

Database-Dependent Methods的另 一种方法是光谱匹配。在这种情况下， 实验光谱是与一个仔细地以前获得的真 正的MS/MS谱组装库相匹配。该方法在 速度和精度方面有良好的性能。然而， 如果MS/MS谱没有被预先的和可靠的识 别可能会导致无法鉴别。
结论

因为它们公正的假设，运用从头测序解释MS/MS谱的 该方法迅速地在重要性上有进展。有效率的从头测序 软件是运用高分辨率MS仪器的获得高品质光谱的最好 的实现。ETD或ECD与CID碎片的结合，也提高了从头 测序方法。虽然比数据库搜索方法需要更多的计算， 从头测序将在大型的蛋白质组学实验中发挥越来越大 的作用。在不远的未来，一个实用的策略可能在使用 数据库搜索在第一步，然后是一个在低得分的肽以及 在无解释的MS/MS谱中的从头方法。另一个可供选择 的方法可能是一个从头测序步骤，接着是一个同源类 型的搜索用以鉴别突变或修饰的多肽。
蛋白质组学中的 从头测序方法
摘要

本综述描述了通过质谱进行多肽从头测序的方法。从 头测序方法利用计算的方式，直接从MS/MS谱实验来 推断多肽序列或部分序列。讨论了很多从头测序方法 背后的概念。通过串联质谱来识别多肽的其他方法是 匹配碎片离子和来自一个基因组或蛋白质数据库的有 效肽离子。当基因组未知时，从头测序方法对识别蛋 白质是必不可少的，但甚至当基因组已知时，它们也 是非常有用的，因为它们不受在一个搜索数据库中的 错误的影响。从头测序方法的另一个优点是，部分序 列能够被用来搜索翻译后修饰，或进行由基于同源的 软件的突变的识别。
Hale Waihona Puke 引言各种质谱分析仪和仪器设计目前可用于 蛋白质组学实验。绝大多数仪器设计在 现在的研究实验室发现的均是混合工具， 结合两个或更多的质谱分析仪（Fig.1）。
Database-Dependent Methods


从MS/MS谱鉴别肽的主要的方法可以被划分为 两大类：database dependent and database independent（fig. 3）。 Database-Dependent Methods的鉴别策略 企图匹配从MS谱中获得的实验光谱与表现出从 一个蛋白质或从基因组数据库生成的已经被翻 译的假设肽的理论光谱。显然，这些数据库是 唯一适用于基因组已经测序的生物体。理论光 谱是使用已知的特定系列的氨基酸的碎裂模式 生成的。
引言

质谱分析法（MS）在生物科学中扮演了一个越来越重 要的角色。MS一直被用于分析小分子但是最近已经成 为了一种可选择的检测蛋白质特性的工具。现代质谱 仪能够在一个相对较短的时间里分析一个成千上万条 肽的混合物并获得序列信息。因为它的灵敏度、准确 性和稳健性，MS已经取代早期化学和酶的方法进行蛋 白质测序。MS的最新进展，分离科学和生物信息学， 都有助于蛋白质组学的快速出现。事实上，蛋白质组 学，或全球研究的整个蛋白质的细胞或组织，已经形 成了一个自己的领域。由于这些技术的进步，在一个 高吞吐量的程度下，使完成分析一个非常复杂的蛋白 质混合物成为可能。蛋白质组学可以提供基因组分析 中特别是蛋白质的修饰、定位和量化中不能探究的问 题的答案。
Database-Independent Methods


从头测序 光谱图的从头测序 光谱的直接从头测序 CID和ECD/ETD的从头测序 准确的大规模肽测序 单一肽的命中
结论

随着蛋白质组学分析质谱的效率的与日俱增， 分析和验证数据软件的需要从这些仪器中获取。 初始的解决方案包括数据库搜索软件的使用， 是依赖于一批数据库内的基因组序列。尽管被 测序的生物体数量越来越多，仍然保留有大量 的遗传密码未知的物种。此外，数据库搜索方 法由于在数据库内的相应的序列的缺失或由于 未知的翻译后修饰，留下大部分无解释的 MS/MS谱数据。