果实蛋白质组学研究的实验方法
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植物蛋白组学实验心得体会
植物蛋白组学实验心得体会植物蛋白组学是一门重要的研究领域，通过对植物蛋白质的组成、结构和功能进行研究，对于深入了解植物的生理、生化过程以及应对外界环境的适应性具有重要意义。
在进行植物蛋白组学实验时，我深刻体会到了以下几点。
首先，实验设计是非常重要的。
在进行植物蛋白组学实验时，需要考虑实验的目的和问题，合理设计实验步骤和方法。
例如，选择合适的试样、提取方法、分离和纯化方法等，都需要充分考虑实验的可行性和准确性。
在实际操作中，我发现实验前的细致准备和实验过程中的周密计划非常重要，能够提高实验的成功率和可靠性。
其次，实验中的数据分析是关键环节。
蛋白质组学实验产生的数据庞大复杂，需要通过合适的数据处理和分析方法进行解读。
对于植物蛋白质组学实验来说，常用的数据分析方法包括聚类分析、差异分析和功能富集分析等。
对于聚类分析，可以通过分析蛋白质表达模式的相似性和差异性，发现潜在的分子机制和生物学过程。
对于差异分析，可以通过比较不同样品之间的差异表达蛋白质，筛选出可能的关键蛋白质，从而研究其功能和作用机制。
对于功能富集分析，可以进一步探索蛋白质的生物学功能和参与的代谢途径等。
数据分析过程中，要注重结果的可靠性和重复性，避免主观因素的干扰，确保分析结果的准确性和可解释性。
最后，植物蛋白组学实验需要综合运用多种技术手段。
植物蛋白质组学研究需要使用多种技术手段进行实验，如二维凝胶电泳（2-DE）、液相层析（LC）和质谱分析等。
这些技术手段可以用于蛋白质的分离、纯化和鉴定。
在实验中，我学会了如何操作这些技术设备，掌握了各种技术操作流程和注意事项。
同时，我也学会了如何根据实验结果进行数据解读和分析，提出合理的研究结论。
通过参与植物蛋白组学实验，我不仅学习到了实验操作的技巧和方法，还深入了解了植物蛋白质组的特点和研究方法。
同时，我也发现了植物蛋白组学研究领域的一些挑战和需求，例如如何更好地提高蛋白质组学实验的可靠性和准确性，如何应用新技术手段提高实验效率和数据解读的准确性。
《盐胁迫下樱桃砧木生长、生理生化及解剖结构的研究》
《盐胁迫下樱桃砧木生长、生理生化及解剖结构的研究》一、引言随着全球气候的变化，土壤盐渍化问题日益严重，对农业生产的负面影响日益凸显。
樱桃作为重要的经济果树，其砧木在盐胁迫下的生长、生理生化及解剖结构变化研究，对于提高樱桃砧木的抗盐性，保障樱桃产业的可持续发展具有重要意义。
本文以樱桃砧木为研究对象，探讨其在盐胁迫下的生长、生理生化及解剖结构变化。
二、材料与方法1. 材料本实验选用具有代表性的樱桃砧木品种，采集其幼苗进行实验。
2. 方法（1）生长指标测定：测定盐胁迫下樱桃砧木的株高、地径、叶片数等生长指标。
（2）生理生化指标测定：测定盐胁迫下樱桃砧木的叶绿素含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量等生理生化指标。
（3）解剖结构观察：通过石蜡切片法，观察盐胁迫下樱桃砧木的根、茎、叶等部位的解剖结构变化。
三、结果与分析1. 生长指标变化盐胁迫下，樱桃砧木的株高、地径、叶片数等生长指标均受到不同程度的影响。
随着盐浓度的增加，樱桃砧木的生长速度逐渐减缓，叶片出现黄化、脱落等现象。
这表明盐胁迫对樱桃砧木的生长具有抑制作用。
2. 生理生化指标变化（1）叶绿素含量：盐胁迫下，樱桃砧木的叶绿素含量降低，表明其光合作用能力受到抑制。
（2）可溶性糖含量：随着盐浓度的增加，樱桃砧木的可溶性糖含量呈现先升高后降低的趋势。
这可能是由于在盐胁迫初期，植物通过积累可溶性糖来调节渗透压，后期由于生长受阻，可溶性糖的合成减少。
（3）脯氨酸含量：脯氨酸是植物在逆境下的重要渗透调节物质。
盐胁迫下，樱桃砧木的脯氨酸含量显著增加，表明其通过增加脯氨酸的合成来抵抗盐害。
3. 解剖结构变化通过石蜡切片法观察发现，盐胁迫下樱桃砧木的根、茎、叶等部位的解剖结构发生变化。
根部的皮层细胞排列紊乱，导管堵塞；茎部的维管束发育受阻，细胞壁增厚；叶片的叶肉组织疏松，气孔密度降低等。
这些变化可能导致樱桃砧木的抗逆能力下降，生长受阻。
四、结论本研究表明，盐胁迫对樱桃砧木的生长、生理生化及解剖结构均产生显著影响。
使用质谱仪进行蛋白质组学研究的实验流程与建议
使用质谱仪进行蛋白质组学研究的实验流程与建议蛋白质组学是一门研究生物体内蛋白质的种类、结构和功能的重要科学领域。
质谱仪作为蛋白质组学研究的重要工具，能够通过分析蛋白质样本中的质谱数据，揭示蛋白质的组成和特性。
本文将介绍使用质谱仪进行蛋白质组学研究的实验流程，并提出一些建议。
1. 样品制备样品制备是蛋白质组学研究的第一步，其质量直接影响后续实验结果的准确性和可靠性。
在样品制备过程中，需要注意以下几点：a. 样品的来源：样品可以是细胞、组织或生物体液等，根据研究目的选择合适的样品来源。
b. 蛋白质提取：选择合适的蛋白质提取方法，确保提取得到高质量的蛋白质。
c. 蛋白质浓度测定：使用合适的方法测定蛋白质的浓度，以确保实验中使用的样品浓度一致。
2. 蛋白质分离蛋白质分离是质谱分析的关键步骤之一，常用的方法包括凝胶电泳、液相色谱等。
在进行蛋白质分离时，需要注意以下几点：a. 样品预处理：根据样品的特性选择合适的预处理方法，如还原、脱氧核糖核酸酶处理等。
b. 分离条件优化：根据样品的特性和研究目的，优化分离条件，如凝胶电泳的电压、电流和染色剂的选择等。
c. 蛋白质纯化：对分离得到的蛋白质进行纯化，去除杂质，提高质谱分析的准确性。
3. 质谱分析质谱分析是蛋白质组学研究的核心内容，包括质谱仪的选择、样品的制备和质谱数据的解析等。
在进行质谱分析时，需要注意以下几点：a. 质谱仪的选择：根据研究目的和实验需求选择合适的质谱仪，如质谱仪的分辨率、灵敏度和质谱图的分析软件等。
b. 样品的制备：根据质谱仪的要求，对样品进行适当的处理，如蛋白质的消化、衍生化等。
c. 质谱数据的解析：对质谱数据进行解析和鉴定，确定蛋白质的氨基酸序列、翻译后修饰等信息。
4. 数据分析与解释质谱数据的分析与解释是蛋白质组学研究的最后一步，它对于揭示蛋白质的功能和生物学意义至关重要。
在进行数据分析与解释时，需要注意以下几点：a. 数据的统计学分析：对质谱数据进行统计学分析，确定差异表达的蛋白质，寻找潜在的生物标志物。
实验一食品中蛋白质含量测定凯氏定氮法
营养技能实训指导≤烹饪营养与安全≥课程组福州黎明职业技术学院药学系2007年02月目录1、实训一食物中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）2、实训二食物中脂肪含量的测定（索氏抽提法）3、实训三荧光法测定食物中维生素B24、实训四大学生食谱编制与计算5、实训五用配餐软件配制幼儿园一周食谱6、实训六烹饪营养配餐与菜单设计7、实训七厨房用具砧板的卫生调查（细菌菌落总数测定）8、实训八厨房卫生调查（大肠菌群快速检测法）实训一食物中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。
2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。
二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。
食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。
因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白三、仪器与试剂（一）试剂1、硫酸铜（CuSO4·5H20）2、硫酸钾3、硫酸（密度为1.8419g/L）4、硼酸溶液（20g/L）5、氢氧化钠溶液（400g/L）c——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）；0.0140 ——1.0mL 盐酸[c(HCl) 1.000mol / L]标准滴定溶液相当的氮的质量（g）；m——样品的质量（g）；F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。
计算结果保留三位有效数字。
六、注意事项及说明1、本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。
半固体试样一般取样范围为2.00g~5.00g；液体样品取样10.0mL~25.0mL（约相当氮30mg~40mg）。
蛋白质组学研究技术-PPT精品文档
二维凝胶电泳（2-DE）—目前唯一能将 数千种蛋白质同时分离与展示的分离技 术 工作原理是根据蛋白质的两个一级属性： 等电点和分子量的特异性，将蛋白质混 合物通过等电聚焦电泳（IEF）和聚丙烯 酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），在两个水 平上进行分离。 1975年首先由O’Farrell等创立
2019/7/11
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21
第一节 概述
蛋白质组学研究范围及意义
表达蛋白质组学研究 选择具有重要生物学意义且已完成DNA测
序的生物体，鉴定出生物体/某种组织（细胞） 所表达的全部蛋白质，建立其蛋白质表达谱数 据库。 进展较快的领域：一些重要的疾病及微生物组。 有难度的领域：估计人类的蛋白质组由50万个 蛋白质组成，真核生物细胞表达的蛋白质也超 出1万个
2019/7/11
9
第一节 概述
2019成立了中国人类蛋白质组组织 （CHHUPO），并分别于2019年9月、 2019年8月以及2019年8月召开了中 国蛋白质组学首届、第二届及第三届 学术大会，2019年10月在中国北京召 开了第三届国际蛋白质组学会议。
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10
第一节 概述
科技部已将疾病蛋白质组研究列入我 国“973”计划项目和“863”计划项 目；国家自然科学基金委员会也将 “蛋白质组研究”列为重点项目。
第一节 概述
基因与其编码产物蛋白的非线性关系
mRNA水平的基因表达研究取得进展，但 mRNA与蛋白质间的相关系数仅为0.4～0.5， mRNA的种类与含量不能代表蛋白质的种类与 含量。支原体的蛋白质数目较基因多24%，对 于人，蛋白质的数目至少多3倍。 蛋白质自身特点难以从DNA和mRNA水平得到 解答：复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定 位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等
植物生物学实验技术掌握研究植物的实验方法和技术
植物生物学实验技术掌握研究植物的实验方法和技术植物生物学是研究植物的生理、生态和遗传等方面的科学。
要深入了解植物的生命活动，就需要掌握一定的实验方法和技术。
本文将介绍几种常用的植物生物学实验技术，帮助读者更好地开展植物科研工作。
一、组织培养技术组织培养是植物生物学研究中常用的实验技术之一，其主要目的是通过体外培养植物组织、细胞或器官，以探究植物的生长发育规律以及植物的分子与细胞机制等。
组织培养技术主要包括无菌技术、组织切分和培养基的制备等。
二、基因转化技术基因转化是将外源基因导入植物体内，使其在植物体内表达的技术。
通过基因转化技术，可以引入外源基因，改善植物的品质、抗逆性等性状，同时也有利于研究植物的基因功能。
常用的基因转化技术包括农杆菌介导的遗传转化和基因枪法等。
三、蛋白质组学技术蛋白质组学是研究植物蛋白质组成、结构和功能等方面的科学。
通过蛋白质组学技术，可以全面了解植物中各种蛋白质的表达情况、相互作用以及功能等信息。
常用的蛋白质组学技术包括二维凝胶电泳、质谱分析和蛋白质互作网络分析等。
四、分子标记技术分子标记技术是利用植物基因组中的特定序列进行物种鉴定、遗传连锁图谱构建和基因定位等的技术。
通过分子标记技术，可以对植物的遗传背景进行研究，推进植物育种和种质资源保护等工作。
常用的分子标记技术包括PCR、RAPD和SSR等。
五、光合作用测定技术光合作用是植物进行能量和有机物质合成的重要过程。
通过测定光合作用速率和光合色素的含量等指标，可以评估植物的光合能力和生长发育状态。
光合作用测定技术主要包括光合速率测定、气体交换测量和光合色素提取等。
六、荧光探针技术荧光探针技术是利用荧光信号来研究植物生理和生化过程的技术。
通过荧光探针技术，可以实时监测植物的氧化还原状态、酸碱平衡、离子浓度等生理生化过程。
常用的荧光探针技术包括叶绿素荧光测定、荧光染料标记和荧光显微镜观察等。
在进行植物生物学实验时，务必注意实验操作的准确性和可重复性。
label free蛋白质组学的实验方法
label free蛋白质组学的实验方法
随着蛋白质组学的发展，越来越多的实验方法被研究出来，其中“label free蛋白质组学”的实验方法受到越来越多的关注。
本文将分步骤阐述这种实验方法。
第一步：蛋白组分离
蛋白质组学实验的第一步是将样品中的蛋白质分离出来，常用的方法有凝胶电泳、液相色谱和离子层析。
其中，液相色谱分离的分离效果较好，离子层析则可以将蛋白质按照电荷分离出来。
第二步：液相质谱分析
得到纯化后的蛋白质后，下一步是进行液相质谱分析。
这种分析方法可以自动化地分离各个蛋白质，然后根据蛋白质的质荷比对蛋白质进行鉴定。
同时，液相质谱也可以进行蛋白质的相对定量分析，评估不同样品中蛋白质的变化。
第三步：生物信息学分析
一旦蛋白质鉴定和定量完成，下一步是进行生物信息学分析。
这种分析方法可以帮助科研人员识别样品中不同蛋白质之间的相互作用，同时还可以预测蛋白质在生物过程中的功能。
总之，label free蛋白质组学的实验方法在蛋白质组学研究中具有非常重要的意义。
通过这种方法，科研人员可以更好地了解生物过程中的蛋白质变化，为疾病的研究和新药的开发提供基础支持。
医学检验研究生蛋白质组学教学方法探讨
ＢＬＯＣＫＳ、ＳＭ ＡＲＴ 、ＰＲ０ｓＩ ＴＥ、Ｗ ＯＲＬＤ－ ＤＰＡＧＥ、ＥＭ ＢＬ、Ｇ ｅ — ２ ｎ
实 验 方 法 广 泛 应 用 于生 命 科 学 研 究 的 各 个 领 域 ＿ 。《 白质 组 】 蛋 ］
学 》 本 系 针 对 硕 士 研 究 生 开设 的 一 门 专 业 基 础 课 程 ， 是 旨在 通
识 。另 外 组 织 学 生 参 观 本 系 的 蛋 白质 组 学 实 验 室 ， 课 教 师 可 任
以在 专 属 电脑 上 进 行 Ｐ ＵＥ Ｔ 软 件 使 用 演 示 ，ｊ 生 对 实 ＤＱ Ｓ ｔ学 ＝
＊ 基金项 目： 国家 级 教 学 团 队 （ 高 ￣ Ｅｏ ９ １ 教 ｚ ｏ ３ ８号 ） 高 等 学 校特 色 专业 建 设 点 （ 高 函 ［ｏ ｏ １ ； 教 ｚ ｌ ］ ５号 ） 贵州 省 高 等 学 校 教 改 重 点 项 目 （ 教 ； 黔 高发 ［ ０ ０ ２ ８号 ） ２１３０ 。
Ｂｎ ａ ｋ等 。（ ） 白质 组 学 在 医学 中 的 应 用 ： 点 讨 论 其 在 检 验 ７蛋 重
过 学 习这 门课 程 使 研 究 生 掌 握 其 中的 科 研 思 维 和 方 法 ， 高 研 提
究 生 的科 研 能 力 和 水平 。
１ 教 学 内容 的安 排
医学 如 肿 瘤 的早 期 诊 断 中 的应 用 研 究 ， 自身 免 疫 性 疾 病 方 面 在
映 最 新 的 研 究 动 态 、 术 手 段 ， 阅 文 献 能 启 发 学 生 的研 究 思 技 查
研 究 生 的 自选 课 题 ， 论 是 否可 以采 用 蛋 白质 组 学 的 技 术 和 方 讨
法 ， 计 实 验 方 案 并讨 论 方 案 的可 行 性 ， 此 增 强 研 究 生 的 科 设 以
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蛋白质组学的基本研究方法
3、蛋白质组研究的技术路线流程
二、蛋白质的提取与样品制备
样品制备原则
1、尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质损失。
（1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白。 （2）不同类型的蛋白质需要不同的方法
（3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法
2、细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，从特殊亚细胞器提取 蛋白还的分级分离。
度为0.1-0.15mM,能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。
4、蛋白质沉淀步骤
（1）硫酸铵盐析 原理：高盐将蛋白质沉淀出来，从而与核酸分离 步骤：蛋白质浓度>1mg/ml，缓冲溶液浓度>50mM(含EDTA),缓慢加 入(NH4)2SO4,搅拌10-30min，离心分离。 注意点：只用作预分离和富集，且(NH4)2SO4 会干扰IEF （2）TCA沉淀 三氯乙酸（终浓度10-20%）加到提取液中混均，置冰上30min，最后用 丙酮或乙醇清洗沉淀除TCA。该法不易造成蛋白质变性和化学修饰。 （3）丙酮沉淀 提取物加入3倍体积的冰丙酮，-200C沉淀2小时，离心空气干燥去丙酮。 （4）丙酮/TCA沉淀 用丙酮在10%的TCA中重悬样品溶液（含有0.01的ß -巯基乙醇或 20mmol/L),-200C沉淀45min,离心分离,丙酮清洗沉淀,空气干燥。 （5）苯酚提取 蛋白质提取到饱和酚中，加到甲醇溶液中NH4CA沉淀，然后先用NH4CA 洗涤，再用丙酮洗涤，空气干燥去丙酮。本法适合于高杂质的植物样品。
白。另外膜蛋白通常位于两相去污系统中相对较丰富的一相。
B、摸蛋白的特性 低丰度、大多偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中。
C、为了从二维电泳凝胶图谱中分离出膜蛋白，首先必须服从三个条件
蛋白组和代谢组学植物样品
百泰派克生物科技
蛋白组和代谢组学植物样品
植物在不同生长时期及外界环境影响下会表达不同的蛋白质或代谢产物以适应和应对这种变化，研究植物体内蛋白质或小分子代谢产物的变化规律即植物蛋白质组学和植物代谢组学有助于理解植物体内相关生命过程的本质和分子机理。
进行植物蛋白质组学和代谢组学研究首先要从待研究的植物组织如种子、根、茎、皮、木、叶和果实中提取蛋白质和代谢物样品，或者提供相应的植物组织。
需要注意的是，蛋白质提取过程中，不同的代谢物应选择不同的适宜的提取方法；对于取样后不能马上进行内含物提取的组织应尽快用液氮处理并于-80℃冷冻保存，防止蛋白质或代谢物发生变化或降解。
百泰派克生物科技采用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC纳升色谱技术，提供高效精准的植物代谢组学服务技术包裹，能对多种植物蛋白、初级代谢产物以及次级代谢产物进行精确的定性和定量鉴定，欢迎免费咨询。
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1970)。因此, 建立蛋白质提取的有效方法和标准化技 术体系对于果实蛋白质组学研究十分必要。
本文在借鉴模式植物蛋白质提取方法的基础上, 建 立了一整套适用于多种果实, 如甜樱桃( P r u n u s a v i v u m ) 、桃( P r u n u s p e r s i c a ) 、苹果( Ma l u s domest ic a)、芒果(Mangifera indica)和冬枣(Ziz iphus jujub a)的蛋白质组学研究方法, 包括蛋白质的抽提 、 蛋 白 质 裂 解 液 的 优 化、 双 向 凝 胶 电 泳 以 及 凝 胶 染 色 方法等。
加入上槽电极缓冲液(20 mmol.L-1 NaOH)及下槽电极缓 . 冲液(20 mmol L-1 H3PO4), 依照 200 V × 30 分钟, 400
V × 16 小时, 800 V × 1 小时的程序进行等电聚焦。聚 焦完毕后, 从凝胶管中取出胶条, 放入平衡缓冲液 I (62.5
mmol.L-1 Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% (w/v) SDS, 10% (v/ v)
收稿日期: 2008-04- 22; 接受日期: 2008- 05- 10 基金项目: 国家自然科学基金(No. 30671473, U0631004) * 通讯作者。E-mail: tsp@ibcas.ac .c n
108 植物学报 44(1) 2009
州市。果实采摘后直接运回实验室, 剔除伤果和病果, 挑选出大小均一的果实, 用 1% 的次氯酸钠溶液消毒, 清 洗 后 晾 干。
向蛋白干粉中加入 225 µL 裂解缓冲液 1 或 2(表 1), 振荡 30 分钟, 溶解后用超声波破碎仪处理 。23 755×g 离心 30 分钟, 取上清。采用 B radford(1976)的方法进行定 量, 每个处理上样为 600 µg 蛋白。
1.4 双向电泳
载体两性电解质梯度双向电泳(CA -IE F): 第一向等电聚 焦在长 13 c m、直径 3 c m 的玻璃管中进行(Komats u et al. , 1999)。用 P arafilm 封口膜封好干净的玻璃管 (Daiichi pure Chemic als, Tok yo, Japan)底部, 在13 cm 处做好标记, 垂直放置于置胶器上。用注射器吸取胶液
CA (pH 3.5－10)
1% (v/v)
CA (pH 5－8)
1% (v/v)
NP- 40
0.2% (v/v)
酚提取法(P he)根据 Saravanan 和 Rose(2004)的方 法并加以改进。称取 4 g 果肉, 用液氮在研钵中研磨成 粉。然后加入 4 mL 的匀浆缓冲液( 匀浆液中含有 2 0
关键词 果实, 凝胶染色, 等电聚焦, 裂解缓冲液, 蛋白质提取 王清, 产祝龙, 秦国政, 田世平 ( 2009). 果实蛋白质组学研究的实验方法. 植物学报 44, 107−116.
果实生长发育阶段的生理代谢变化, 以及采后处理 对果实品质的影响一直受到人们的关注。在过去的研 究中, 我们发现生物和非生物因子处理果实可以激发抗 氧化酶类和防御基因的表达(Chan and Tian, 2006; Tian et al. , 2007)。为了进一步研究果实应答生物因子和非 生物因子过程中参与表达的蛋白及其功能, 利用蛋白质 组学的研究方法来揭示果实抗性应答的机理是十分重要 的 手 段。
表 1 裂解缓冲液的配方
Table 1 Lysis buff er rec ipes f or selected steps in 2D elec-
tr ophores is
Re c ip es 1
Ch emi c a ls Ur ea
Co nc e ntra tio ns
. 8 mol L-1
NP- 40
收酚相, 加入5倍体积含0. 1 mo .l L-1 乙酸铵的预冷甲醇,
充分混匀, － 20°C 下过夜培养, 沉淀蛋白。沉淀分别用
预冷的含 0. 1 mol.L-1 乙酸铵的甲醇和丙酮冲洗 2 次,
4°C 下干燥后溶于 250 µL 裂解缓冲液中(表 1), － 80°C 保存备用。
1.3 蛋白质的溶解和上样
(10% (v/v) NP-40, 30% (w/v) acry lamide, 9.5 mol.L-1
urea, 10% ammonium persulfat e, 1% (v/ v) ampholine (pH 5－8), 1%(v/v) ampholine (pH 3. 5－10)), 灌胶。待 胶条聚合后, 除去 P arafilm 膜。然后加入 600 µg 蛋白 样品, 并于其上覆盖 30 µL 的 50% 裂解缓冲液。最后
1 材料与方法
1.1 实验材料
桃(Prunus persica L. B at sc h)采于北京市平谷的试验 果园, 甜樱桃(Prunus avivum L. ‘Hongdeng’) 采于中国 科学院植物研究所的试验果园, 苹果(Malus domes tica Bork h ‘Fuji’) 采于中国农业科学院林果所果园, 芒果 (Mangif era indic a L. ‘Zill’)和冬枣(Ziz iphus jujub a Mill. ‘Dongz ao’)分别采自四川省攀枝花市和山东省滨
摘要 双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖 、多酚、单宁和有机酸等物质，蛋白质的提取比 其它植物组织更加困难 。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术，并建立了一套适用于桃、樱 桃、苹果、 芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法 。结果表明，采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质 ，裂解缓冲 液2溶解蛋白质， 并用固相pH梯度进行等电聚焦， 可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱，具有较好的重复性，可用于果 实蛋白质组学的研究。 我们的研究结果显示， 固相干胶条与IEF管胶相比 ，具有更加明显的优势。而不同的染色方法，对结 果影响不大。
匀浆法(Homo)参照 Chan 等(2007)的方法。称取 4 g 果肉, 用液氮在研钵中研磨成粉。加入 4 mL 的匀浆
缓冲液(匀浆液中含有 20 mmo .l L-1 Tris -HCl (pH 7. 5), 250 mmol.L-1 s uc ros e, 10 mmol.L-1 E GTA, 1 mmol. L-1 P MS F, 1 mmol.L-1 DTT, 以及 1% Triton X-100)继
2% (v/v)
ห้องสมุดไป่ตู้
CA (pH 3.5－10)
1% (v/v)
CA (pH 5－8)
1% (v/v)
2- mer captoethanol
5% (v/v)
PV P
5% (w /v)
2
Ur ea
Thiour ea
. 7 mol L-1 . 2 mol L-1
CHA PS
4% (w /v)
DTT
1% (w /v)
1.2 蛋白质提取
以下所有步骤均在 4 °C 条件下进行。 TCA 法(TCA)参照 S arry 等(2004)的方法并稍加改
进。用取样器从 10 个果实中分别取 4 g 果肉, 用液氮 在研钵中将其研磨成粉。然后加入 4 倍体积冰冷的10% TCA (含 0. 07% β- 巯基乙醇), 匀浆液于 －20°C 下过夜培 养, 纱布过滤。滤液以 20 000×g 离心 30 分钟, 收集沉 淀。沉淀用冷丙酮冲洗 3 次, 并在 4°C 下干燥, 之后溶 于裂解缓冲液中(表 1), 保存于 － 80°C 备用。
续研磨。匀浆液以 20 000×g 离心 30 分钟。将上清液 转移到新的离心管中, 加入终浓度为 10% 的 TCA 溶液, 4°C 下放置 2 小时。20 000×g 离心 40 分钟, 收集沉淀。 用冷丙酮冲洗 3 次, 4°C 下干燥后溶于 250 µL 裂解缓冲 液中(表 1), 保存于 －80°C 备用。
蛋白质组学技术包括蛋白质的高分辨率电泳分离、 胶内酶解、质谱鉴定以及数据库搜索等。如今, 蛋白 质组学技术已经被广泛地应用于动物和微生物领域的研 究(A nt elmann et al., 1997; Qin et al., 2007), 在植物 生物学方面也有广泛的应用(Dominguez -P uigjaner et al., 1992; Chang et al., 2000)。植物细胞中包含许多 次生代谢物质, 可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化 (Granier, 1988; Meyer et al. , 1988)。而从果实组织 中提取蛋白质更加困难, 可能是由于果实中蛋白质含量 相对较低, 并且含有大量干扰性物质, 如色素、淀粉、 多酚 、多聚糖、单宁和有机酸类等( C l e m e n t s ,
mo .l L-1 urea, 75 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 8.8, 29. 3% (v/
v) glycerol, 2% (w/ v) S DS , 0.002% (w/ v) bromophenol blue)中各平衡 20 分钟, 然后再转移至分离胶浓度为 15%, 浓缩胶浓度为5%的SDS-PAGE胶上端进行第二向 垂直电泳。除特别注明外, 等电聚焦均使用 1PG 胶条。
1.5 凝胶染色方法
本文所用的凝胶染色方法见表 2, 包括: (1)考马斯亮蓝 R-250(CBB R-250) (S hen et al., 2003); (2)胶体考马斯 亮蓝染色(B lue silver)(Candiano et al., 2004); (3)银染 (S ilver st aining)(Blum et al., 1987)。
行。分别取蛋白质样品 60 0 µg 及水化液(7 m ol . L-1 urea, 2 mol.L-1 t hiourea, 2% (w/v) CHAPS , 0. 5% IPG