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液相色谱仪分离测定奶茶、可乐中咖啡因一、实验目的（1）了解高效液相色谱仪的结构及基本操作。
（2）了解色谱分离的基本原理，尤其是反相色谱的基本规律。
（3）掌握色谱的基本定性、标准曲线定量方法。
二、实验原理高效液相色谱仪一般分为四个部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和监测系统。
本实验当中还配有数据处理装置。
在液相色谱仪中，通过流动相使试样沿色谱柱移动，试样在色谱柱中与固定相与流动相都发生选择性的相互作用，利用样品的分离系数不同达到分离的效果。
本实验采用的是液相色谱中的反相分配色谱，反相色谱用的是非极性填料分析柱（如ODS-C18），流动相是极性较强溶剂（如甲醇和水），样品根据在固定相和流动相中的分配系数不同而进行分离。
通过标准样品的保留时间进行定性，以峰面积对浓度绘制的工作曲线定量。
通过线性拟合，计算出奶茶和可乐中咖啡因的浓度。
咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1，3，7-三甲基黄嘌呤，分子式：C8H10N4O2，是由茶叶或咖啡中提取出的一种生物碱，沸点为178℃（升华）熔点237℃，溶于乙酸乙酯、氯仿、四氢呋喃等，微溶于水。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
三、仪器与试剂1. 仪器Agilent 1260型液相色谱仪：真空在线脱气装置；四元梯度泵；多波长检测器；ODS-C18柱。
2. 试剂甲醇（色谱纯）；水（超纯水）；咖啡因标样；奶茶；可乐。
四、实验步骤1. 确定实验条件打开计算机，等计算机启动完毕后，依次打开输液泵、真空在线脱气装置、柱温箱、检测器的开关。
通讯完毕后，设定操作条件。
流动相：甲醇/水＝60/40 ；总流速0.5mL/min 设定在254nm波长下进行检测，柱温30℃，流动相的比例可以根据实验内容的需要在控制单元中修改。
2. 样品制备将可乐、奶茶倒入烧杯后放在超声波仪中超声脱气，去除奶茶、可乐中溶解的空气以及大量二氧化碳气体。
将脱气后的可乐溶液稀释5倍后，通过0.45μm的滤膜过滤，转移至定量管中备用。
高效液相色谱法测定茶饮料中的咖啡因含量作者：宁炜来源：《食品安全导刊》2022年第08期摘要：建立了高效液相色谱法测定茶饮料中咖啡因含量的分析方法。
试样经预处理后，过0.45 μm微孔水相滤膜，经Promosil C18色谱柱分离，以甲醇和纯水为流动相，等度洗脱，二极管阵列检测器检测。
结果表明，咖啡因在0.059～1.960 μg/mL与4.91～196.30 μg/mL时线性关系良好，线性系数均大于0.999，加标回收率为96.43%～103.31%，方法的重复性RSD为1.56%，检出限为0.059 mg/kg，定量限为0.2 mg/kg。
该方法前处理简便，定性定量准确，可用于茶饮料中咖啡因含量的批量快速检测。
关键词：咖啡因;茶饮料;高效液相色谱法Determination of Caffeine in Tea Drinks by HPLCNING Wei（Shanxi Inspection and Testing Center Shanxi Institute of Standard Measurement Technology， Taiyuan 030012， China）Abstract： The method for the determination of caffeine in tea beverage by high performance liquid chromatography was established. After pretreatment， t he sample passes 0.45 μm microporous aqueous phase filter membrane， separated by Promosil C18 chromatographic column， eluted with pure water and methanol as mobile phase， and detected by diode array detector. The results showed that caffeine ranged from 0.059～1.960 μg/mL and 4.91～196.30 μg/mL， the linear relationship within was good， the linear coefficients were greater than 0.999， the recovery was 96.43%～103.31%， the repeatability RSD of the method was 1.56%， the detection limit was0.059 mg/kg， and the quantitative limit was 0.2 mg/kg. The method is simple in pretreatment，accurate in qualitative and quantitative analysis， and can be used for rapid batch determination of caffeine in tea drinks.Keywords： caffeine; tea drinks; high-performance liquid chromatography咖啡因，又稱咖啡碱，是一种从咖啡或茶叶中提取的黄嘌呤生物碱化合物，具有使人体中枢神经系统兴奋的作用，适度使用可以祛除疲劳、振奋精神，然而长期或超剂量摄入会对人体肝肾功能造成损害，而且其具有成瘾性，停用后会出现身体疲乏、精神不振等症状[1-4]。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因方法的讨论作者：沈丽龙丽娟来源：《中国科技博览》2009年第01期[摘要]精确测定咖啡因在饮料中的含量，建立测定饮料中咖啡因含量的RP-HPLC法的最佳工作条件。
方法：色谱柱为C18；150×4.60mm(5μm)；流动相为A为取2.02g庚烷磺酸钠和2.10g柠檬酸于1L容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，B为乙腈；流速为1.0ml／min；DAD 检测波长240nm。
结果：本法操作简便、准确、线性关系良好，相对标准偏差小于0.50%，加标回收率为95.6%-99.8%。
结论与现行国标方法相比，通过优化了的色谱条件，提高了测定灵敏度及检出范围。
[关键词]高效液相色谱饮料咖啡因中图分类号:TS207 文献标识码：A 文章编号: 1009-914X(2009)01(a)-0099-01咖啡因又名咖啡碱，属甲基黄嘌呤化合物，化学名称为1，3，7-三甲基黄瞟呤，具有提神醒脑等刺激中枢神经作用，但易上瘾。
为此，到目前为止我国仅允许咖啡因加入到可乐型饮料中。
本文利用反相高效液相色谱法实现了饮料中咖啡因的测定，并对检出限和定量限、标准曲线、方法的准确度和精密度作了验证。
一、实验材料与方法（一）试剂1.甲醇：色谱纯2.乙腈：色谱纯3.咖啡因标准品：纯度98%以上（二）仪器和设备1.安捷伦1100型高效液相色谱仪2.色谱柱C18 150x4.60mm(5um)3. 超声清洗器4. 混纤微孔滤膜（三）分析步骤1.色谱条件流动相：称取2.02g庚烷磺酸钠和2.10g柠檬酸于1L容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。
将该溶液与乙腈溶液按9：1混和。
流速：1.0ml/min；检测器：二级管阵列（DAD）、波长240nm；柱温： 40℃；进样量：5ul。
2.标准曲线的绘制准确称取咖啡因标准品0.1000g于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容。
此储备液为1.0mg/l。
用移液管分别移取标准储备液0.2ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml于10ml容量瓶内，用甲醇溶液定容，该咖啡因标准系列浓度为20ug/ml、50 ug/ml、100 ug/ml、150 ug/ml，然后分别进样5 ul，于波长为240nm测定其峰面积，作峰面积-咖啡因浓度的标准曲线。
实验八 可乐、咖啡、茶叶中咖啡因的高效液相色谱分析 摘要： 咖啡因是一种具有药理活性的物质，在通常的饮料如咖啡、茶和可乐以及头痛药、止疼药中都发现有咖啡因的存在。
适量食用咖啡因有祛除疲劳、兴奋神经等作用，临床上用于神经衰弱、伤风、偏头痛等疾病的治疗，但大量或长期摄取咖啡因有损人体的健康，如咖啡因自身的毒性，引发心脏病，对人体骨骼状况及钙平衡产生不利影响等状况及钙平衡产生不利影响等本文介绍两种常用的咖啡因检测法，即高效液相色谱法、离心萃取紫外光谱法。
并比较两种方法的优缺点，得出测定咖啡因的最佳检测法。
关键词：高效液相色谱法，紫外光谱法，检测一、 引言咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。
咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。
可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。
其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为： NN CH 3H 3COO N N CH 3当前，各种可乐饮料已经成为人们饮食当中摄取咖啡因次数和频率较高的一个重要来源。
因此，发展简便、快速、可靠、分析成本低的分析方法来对可乐饮料中咖啡因含量进行测定非常重要。
通常采用色谱、色谱/质谱联用、毛细管电泳、分光光度和流动注射等分析方法检测可乐饮料中的咖啡因测定方法。
本文采用高效液相色谱法与离心萃取紫外光谱法测定可乐中咖啡因的含量。
二，实验部分1实验原理用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。
如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
2实验仪器与药品⑴仪器LC-10A液相色谱仪C-R6A数据处理机色谱柱（EconosphereC18）平头微量进样器⑵药品①甲醇（色谱纯）双蒸水氯仿（A.R）1mol/LNaOH;NaCl(A.R.) Na2SO4(A.R.) 咖啡因（A.R.）可口可乐（1.25L瓶装）雀巢咖啡茶叶②1000mg/L咖啡因储备液将咖啡因在110℃下烘干1小时，准确称取0.1000g咖啡因，用氯仿溶解，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。
高效液相色谱法测定可乐中咖啡因的含量
刘阳;孙艳丽
【期刊名称】《山东化工》
【年(卷),期】2013(42)5
【摘要】建立了测定可乐中咖啡因含量的新方法.检测波长为286 nm；以去离子水和甲醇以5∶5的体积比作为流动相；流速0.8 mL/min;咖啡因在质量浓度为10～50 μg/mL范围内与峰面积有良好的线性关系.相对标准偏差为0.64％.该方法准确、简便、快速,适合可乐型饮料中咖啡因的测定.
【总页数】3页(P72-73,76)
【作者】刘阳;孙艳丽
【作者单位】日照市环境保护局岚山分局环境监测站,山东日照276807;菏泽学院化学化工系,山东菏泽274015
【正文语种】中文
【中图分类】O652.1
【相关文献】
1.紫外分光光度法测定可乐中咖啡因含量样品前处理方法探讨 [J], 谷苗苗;王尉嘉;王迪;周爱东
2.高效液相色谱法测定可乐定透皮贴剂中可乐定的含量 [J], 王爱爱;秦小花;高菊芳
3.高效液相色谱法测定可乐中咖啡因含量 [J], 丁瑞芳;张敏娜;朱军
4.紫外分光光度法测定可乐中咖啡因的含量 [J], 武开业
5.反相高效液相色谱法测定可乐中咖啡因的含量 [J], 武开业
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毕业论文文献综述
应用化学
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量咖啡因（Caffeine ）是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种生物碱。
茶、咖啡、可乐这三大非酒精饮品和许多功能饮料都有咖啡因成分。
适量摄入咖啡因对人体是有益的，如可以缓解工作压力，起到提神醒脑作用等。
但是，大剂量或长期使用也会对人体造成损害，特别是它也有成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状，虽然其成瘾性较弱，戒断症状也不十分严重。
因此也被列入受国家管制的精神药品范围。
所以每人每天咖啡因的摄入量不宜过高。
摄入咖啡因量可分为以下等级:成人每天摄入80 ～250 mg 咖啡因( 1.1 ～3.5 mg/kg·d- 1 ) 为低摄入量, 300 ～ 400 mg ( 4 ～6 mg/kg·d- 1 )为中摄入量，超过500 mg(7mg/kg·d- 1 )为高摄入量。
滥用咖啡因通常也有吸食和注射两种形式，其兴奋刺激作用及毒副反应、症状、药物依赖性与苯丙胺相近。
咖啡因是受国家管制的精神药品。
作为中枢兴奋药中的清醒药,低、中摄入量时能够振奋精神、提高注意力、增强自信心、提高工作效率、减少疲乏感、增强识别能力、提高瞬时口头记忆力。
而高摄入量的咖啡因可引起焦虑、烦躁、失眠、易怒及精细运动功能受损。
作为中枢神经系统兴奋药，小剂量能兴奋大脑皮质，改善思维活动,提高对外界的感应性。
大剂量则可兴奋延髓的呼吸中枢和血管运动中枢,增加呼吸频率和深度。
已有研究表明大量摄入咖啡因容易上瘾 ,导致慢性中毒,引起众多严重后果,如影响睡眠, 引起局部缺血性心脏病，出现心律不齐、心悸及心动过速，降低女性受孕率，提高孕妇自然流产率和致畸率，引发阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝脏、胃、肾等器官,诱发呼吸道炎症、妇女乳腺瘤疾病等。
咖啡因在全球范围内作为一种神经兴奋剂被广泛使用，并且是唯一一种可以添加在食物中的药物。
虽然公认适量饮用不会有任何不良作用，但是咖啡因还是会增加患上一些疾病的风险。
怀孕的妇女不能喝咖啡，不能使用咖啡因，也不能使有任何包含甲基黄嘌呤的物质，因为这样会增加其流产和产下低体重婴儿的风险。
咖啡因会引起心跳加快和轻微的血压升高，这种影响会同样发生在母亲和婴儿身上。
动物实验显示，咖啡因会
导致出生缺陷。
咖啡因促进高血压，骨质疏松，并在一定程度上提高患肠癌的风险，并且会导致失眠，焦虑，心悸以及缩短月经周期。
虽然咖啡因并不像其他强力的成因毒品一样作用于大脑的区域，它仍被认为轻微成瘾，并且导致一些机体依赖性。
一旦咖啡因上瘾，每天早上没有喝到固定的咖啡就会性情乖戾和头痛。
咖啡因上瘾的症状包含了通常的头痛，易怒，失眠，虚弱，压抑，表现不佳，注意力不集中以及“反应灵敏紊乱”。
目前提取天然咖啡因的主要方法有：水提法、醇提法、升华法及其它有机溶剂提取法。
醇提法是一种比较经典的实验提取方法，该法的特点是使用一次量的溶剂在索氏提取器中连续抽提，通过重复循环流动，固体物质不断与新鲜溶剂接触，大大提高萃取效率。
某些在有机溶剂中溶解度较低的物质也能通过延长萃取时间，得到较好的萃取，而且咖啡因由升华提纯，所得产品纯度较高。
但缺点一是萃取时间长，二是若升华操作不当，经常使实验失败。
实验中的改进有: (1)用一支比索氏提取器内径细的试管封口端顶在圆形滤纸的中间，然后用试管将滤纸推入到索氏提取器内,这样滤纸在索氏提取器内就自然成圆柱状，如果滤纸筒在索氏提取器内的高度太高，则可在滤纸推入前将滤纸边缘剪去一截，滤纸筒上端不封口，回流时，乙醇直接滴入茶叶,可提高萃取效果。
(2)保证一定的回流时间，一般2．5～3h即可满足。
(3)蒸馏回收乙醇时不可将提取液蒸得太干，否则容易结焦碳化。
(4)焙炒要充分，蒸馏残液加氧化钙或氯化钙吸水后，应在酒精灯隔石棉网焙炒片刻，务使水分全部除去，焙炒过程必须不停搅拌、翻动，防止结焦。
(5)升华操作是关键，咖啡因约在178℃升华较快，千万不可加热温度太高，否则会使产物碳化，影响产物收率。
水提法中选用碱性强度较弱的CaCO
为好，茶汁颜色较淡、稀薄透明，而且CaCO3 和
3
茶叶中的单宁或没食子酸反应生成不溶性的钙盐，使咖啡因作为可溶性的生物碱留在水溶液中, 易于分离和提纯；提取时间以20min为宜。
这种方法与醇提法相似，只是提取剂由水取代了乙醇，后期的提纯与醇提法一致。
但提取时间在20～30min的变化不大，太短则茶叶中的咖啡因提取不完全，太长则咖啡因易在100℃就失去结晶水而开始升华，提取收率也不高。
由于水提法为一步提取工艺，缺乏像醇提法中的连续回流效果，因此，咖啡因的收率要较醇提法低，但作为实验方法是能够取得成功的。
升华：是纯化固体有机物的方法之一。
某些物质在固态时有相当高的蒸气压，当加热时不经进液态而直接气化，蒸气遇次则凝结成固体，这个过程叫做升华。
升华得到的产品有较高的纯度，这种方法特别适用于纯化易潮解或与溶剂起分解的物质。
升华法只能用于纯化在不太高的温度下，有足够的蒸气压（在熔点以下高于266.6Pa）的固态物质，因此，有一定的局限性。
有机溶剂萃取法的特点是有机溶剂进行萃取，相对时间较短。
但也存在一些缺点，主要原因是由于咖啡因经过了多次相转移，势必会造成咖啡因的损失，影响产物收率。
各种提取法各有优劣，但利用有机溶剂萃取法, 与水提法、醇提法相比较，提取较为安全，且相对时间较短。
目前测定咖啡因的方法很多，如薄层色谱法、紫外分光光度法和高效液相色谱法。
前两种方法样品预处理过程比较复杂；HPLC法灵敏、快速、准确，样品预处理较简单，可广泛用于咖啡因含量的测定，对于确保人类健康有着重要的意义。
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