致病性大肠埃希氏菌及其检验

致病性大肠埃希氏菌ESBLs基因型的检测及其抑制剂的抑酶保护作用张春辉;张晓根;张晓风;王建华【摘要】[目的]检测致病性大肠埃希氏菌中超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型,初步研究β-内酰胺酶抑制剂(BLI)-他唑巴坦的抑酶保护作用.[方法]对产生ESBLs的5株致病性大肠埃希氏菌,设计并合成TEM-1和是SHV-1 2对引物,用PCR方法进行了ESBLs的DNA扩增、测序和基因型分析;用试管二倍稀释法测定头孢噻呋与BLI-他唑巴坦钠以不同配比对产生ESBLs大肠埃希氏菌的最小抑菌浓度.[结果]从产生ESBLs细菌中均扩增出了TEM型ESBLs产物,但未扩增出SHV型ESBLs产物;头孢噻呋与BLI-他唑巴坦钠(质量比1∶1～8∶1)联合使用,对产生ESBLs的大肠埃希氏菌的最小抑菌浓度较头孢噻呋单独使用基本降低,最高可降低16倍.[结论]国内畜禽产生ESBLs的大肠埃希氏菌未通过质粒进行细菌间耐药基因的交换, ESBLs 的产生与生物种属没有关系,BLI-他唑巴坦有较强的抑制ESBLs作用.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2009(037)005【总页数】5页(P24-28)【关键词】β-内酰胺酶;BLI-他唑巴坦;大肠埃希氏菌;耐药性;基因型【作者】张春辉;张晓根;张晓风;王建华【作者单位】郑州牧业工程高等专科学校,药物工程系,河南,郑州,450011;西北农林科技大学,动物医学院,陕西,杨凌,712100;郑州牧业工程高等专科学校,药物工程系,河南,郑州,450011;郑州牧业工程高等专科学校,药物工程系,河南,郑州,450011;西北农林科技大学,动物医学院,陕西,杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】S855.1;Q781动物专用的第3代头孢类抗生素,如头孢噻呋(又名塞得福)，抗菌谱广、抗菌活性强，生物利用度高，在国内外正逐渐广泛应用于畜禽疾病的治疗。

资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载大肠埃希菌检查法地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容大肠埃希菌检查法Escherichia Coli Test Method1.目的建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。

2.范围适用于大肠埃希菌检查的操作。

3.责任者QC化验员。

4.程序：4.1.简述4.1.1. 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。

埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。

大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。

在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。

大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。

为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。

4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。

4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。

实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。

MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。

大肠埃希菌埃希菌属：大肠埃希菌、蟑螂埃希菌、弗格森埃希菌、赫尔曼埃希菌、伤口埃希菌致病因素；侵袭力K抗原和菌毛与炎症相关内毒素与发热、休克、DIC相关肠毒素耐热肠毒素和不耐热肠毒素cAMP水平升高，与腹泻相关所致疾病：肠道外感染：泌尿系统感染、菌血症、胆囊炎、肺炎及新生儿脑膜炎常见于肠穿孔激发腹膜炎、腹腔内脓肿、肠道手术后激发感染肠道内感染：微腹泻至霍乱样严重腹泻、溶血性尿毒综合征根据其不同的血清型，毒力和所致临床症状的不同，分为：危险因素感染类型发病年龄主要临床表现肠毒素型大肠埃希菌（ETEC）海外旅行旅行者腹泻成人、儿童水样便肠致病型大肠埃希菌（EPEC) 急性腹泻﹤2岁婴儿、成人水样便肠侵袭型大肠埃希菌（EIEC) 海外旅行志贺样脓血便成人粘液脓血便，含红白细胞肠出血型大肠埃希菌（EHEC) 未熟牛肉牛奶出血性肠炎儿童、老人血便、发热（白）肠凝聚型大肠埃希菌（EaggEC）急、慢性腹泻儿童腹泻水泻、呕吐ETEC：儿童腹泻和旅行者腹泻EPEC;：黏液便但无血液EIEC：志贺样脓血便（有红细胞、白细胞）EHEC：多为水源性或食源性感染，人与人之间通过粪口感染，产生Veno细胞毒素，抑制蛋白质合成并致Veno细胞病变，潜伏期3--5天，血便中无白细胞EaggEC:：:与世界各地慢性腹泻有关。

形态结构;:格兰阴性直短杆菌，多有鞭毛，能运动；引起场外感染的菌株有荚膜和周身菌毛抗原成分：O抗原多糖磷脂复合物(LPS），耐热，分型基础H抗原不耐热蛋白质K抗原多糖荚膜抗原，对热稳定血清型按O:K:H顺序培养特性：兼性厌氧，营养要求不高血琼脂上产生β溶血肠道选择培养基，发酵乳糖，形成有色菌落发酵多种糖产酸产气，吲哚、甲基红、VP、枸橼酸盐（1MVC)试验结果为+ + - -动力、吲哚、脲酶（MIU）反应为+ + -克氏铁琼脂上斜面和底层产酸产气，硫化氢阴性（AA+ -）微生物学检验采集标本;：静脉血，血培养痰液、脓、分泌物等尿液，3000r/min 10min，沉淀物涂片镜检：格兰阴性杆菌分离培养：痰液血平板、巧克力平板、沙保弱氏培养基尿液血平板、MAC、沙保弱氏培养基血液血培养鉴定：EMB上，扁平、粉红色有金属光泽MAC上粉红色或红色SS上红-粉或中央为粉红色，周围无色的菌落XLD上，不透明黄色的菌落大肠埃希菌一般不产生硫化氢血清分型：ETEC：生化反应鉴定加血清分型加肠毒素测定EPEC：生化反应鉴定加血清分型乳糖阳性用ELISA和细胞培养来检测EPECEIEC;：生化反应加血清分型及毒力鉴定多数此型菌动力阴性，乳糖不发酵或迟缓发酵，O152 和O124,，与志贺菌有的抗血清有交叉反应豚鼠眼结膜试验：角膜上皮细胞出现大量细菌和志贺菌鉴别：醋酸钠、葡萄糖胺利用试验和黏质酸盐产酸大肠埃希菌均阳性，志贺菌均阴性EHEC：生化鉴定加血清分型O157 ：H7 ，不发酵山梨醇。

《微生物与实验技术》食品中大肠埃希菌的检验实验一、实验目的1.熟悉大肠埃希菌的检验原理2.熟悉大肠埃希菌检验的基本操作二、实验原理1.大肠杆菌，又叫大肠埃希氏菌是条件致病菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染。

因此，检查食品中是否存在治病大肠埃希氏菌具有实际意义。

2. 在TSI琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢(H2S)。

置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察,MUG阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生,MUG阴性的应无荧光产生，大肠埃希氏菌O157:H7/NM为MUG试验阴性,无荧光。

三、试剂及器材1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤：2 EC肉汤（E.coli broth）：3 蛋白胨水：4磷酸盐缓冲液：5伊红美蓝（EMB）琼脂：6 营养琼脂斜面：7结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：8革兰氏染色液：9无菌1mol/LNaOH：10无菌1mol/LHCl：四、操作方法样品的稀释1. 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1:10的样品匀液或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min制成1:10的样品匀液。

2.液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1.10的样品匀液。

3. 样品匀液的pH值应在6.5~7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl 调节。

4 .用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL 磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面）振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。

埃希菌属及其鉴定本属以大肠埃希菌为代表种。

1．细菌特性大肠埃希菌为革兰阴性杆菌，直杆状，周鞭毛，能运动，有菌毛。

具有O抗原、H抗原、K抗原，其血清型别按O∶K∶H的顺序排列，以数字表示，如O111∶K58∶H2；O157∶H7等。

兼性厌氧，营养要求不高，菌落为灰白色、圆形，在肠道选择培养基上能发酵乳糖产酸形成不同颜色的菌落。

生化特征为：发酵多种糖类产酸产气，KIA：AA+-，脲酶-；IMViC++--。

2．临床意义大肠埃希菌是临床最常见的革兰阴性杆菌，也是医院感染常见病原菌，可引起各种肠道外感染和肠道内感染。

引起肠道内感染的亦称为致腹泻大肠埃希菌，分为五组：（1）肠产毒性大肠埃希菌（ETEC） ETEC致病机制主要通过产生LT和ST肠毒素导致腹泻和中毒症状，是旅游者腹泻和婴幼儿腹泻的常见病因，导致恶心、腹痛、低热和类似轻型霍乱的急性水样腹泻。

（2）肠致病性大肠埃希菌（EPEC）是婴儿腹泻的重要病原菌，可导致发热、呕吐、严重水泻和粘液便，常引起婴儿脱水性酸中毒。

（3）肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）与志贺菌有共同抗原，可引起类似志贺菌肠炎的症状，如发热、腹痛、水泻或典型菌痢的里急后重症状，并出现脓血粘液便。

（4）肠出血性大肠埃希菌（EHEC）主要血清型为O157∶H7，引起出血性结肠炎（HC）。

表现为腹痛、水泻、血性便。

主要见于婴幼儿。

以暴发流行为主。

O157∶H7感染者中有少部分可发展成为溶血性尿毒综合征（HUS），出现溶血性贫血、血小板减少性紫癜和急性肾功能不全。

（5）肠凝聚性大肠埃希菌（EaggEC）引起婴儿急性或慢性水样腹泻伴脱水，偶有腹痛、发热与血便。

3．微生物学检验（1）标本采集无菌方法采集各类感染标本及时送检；粪便标本宜采集新鲜、有脓血、粘液的部分。

（2）检验方法1）显微镜检查为革兰阴性杆菌。

2）分离培养标本接种于BAP、SS、MAC/EMB培养基、或增菌培养基，置35℃孵育18～24h，观察菌落。

大肠埃希菌的微生物检验分析王春玲摘要】目的：探讨大肠埃希菌的微生物检验方法及临床意义。

方法：对100例各类送检标本中大肠埃希菌的肠道外感染大肠埃希菌鉴定和肠道内感染大肠埃希菌鉴定方法进行分析。

结果：大肠埃希菌中检出率48%。

大肠埃希菌常引起各种肠内外感染，是腹泻和泌尿道感染的主要病原菌。

结论：肠道外感染的鉴定是临床分离的革兰阴性杆菌中最常见的之一。

可引起各种感染，常见的是泌尿系感染。

还可引起胆囊炎、菌血症、肺炎及新生儿脑炎等，亦可引起腹腔内脓肿、肠穿孔继发腹膜炎，术后感染或大面积创面感染等，又易混合厌氧菌感染等症。

肠道外感染大肠埃希菌的鉴定。

肠道内感染的大肠埃希菌的鉴定这些菌株可引起轻微腹泻或霍乱样腹泻。

严重时，可引起致死性并发症(HUS)，造成严重后果。

【关键词】大肠埃希菌；微生物检验【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）14-0376-02大肠埃希菌是重要的条件致病菌，俗称大肠杆菌，常引起各种肠内外感染，是腹泻和泌尿道感染的主要病原菌。

现对大肠埃希菌的微生物检验及临床意义进行分析如下。

1.资料与方法1.1 一般资料对2014年1月～12月收治的各类送检标本100例，为住院或门诊患者，年龄8～83岁，其中尿液45例，痰液16例，脓液13例，血液11例，分泌物5例，胆汗4例，引流液2例，其他2例。

1.2 方法1.2.1肠道外感染大肠埃希菌鉴定1.2.1.1标本采集根据不同疾病采集不同部位的标本。

采集血液标本以无菌操作技术抽取静脉血5mL；痰标本取自口腔清洁后从深部咳出的痰液；脓、分泌物等标本用无菌棉拭子直接采取。

1.2.1.2检验方法(1)标本直接检查：除血液标本外，其他标本均可作涂片染色镜检。

中段尿和其他各种体液标本以3000r／min离心10 min后取沉淀物涂片，脓、痰、分泌物等可直接涂片，革兰染色后镜检。

镜下可见革兰阴性短杆菌。

(2)分离培养与鉴定：①分离培养：血液标本接种肉汤增菌培养，待生长后移种于血平板；其他标本直接或离心取沉淀接种于血平板及肠道弱选择性平板，35℃孵育18～24h。

致泻性大肠埃希氏菌PCR多重检测方法建立目前国内检测致泻大肠埃希氏菌的现行有效方法是GB/T 4789.6-2003，该方法主要从分离培养、生化试验、血清学试验和肠毒素试验对致泻性大肠埃希氏菌进行鉴定，本方法虽然不需要贵重仪器设备、费用低，但是耗时较长，实验所用的试剂不易买到，实验过程干扰因素较多。

由于该类菌与普通大肠埃希氏菌生化反应相似，在分离平板上菌落形态近似，因此从平板上反应上挑取可疑菌落就很困难，只有多挑取可疑菌落进行下一步的鉴定才能增加样品中检出致泻性大肠埃希氏菌的几率。

而多挑取菌落进行鉴定又增加了人力物力的消耗。

由于致泻性大肠埃希氏菌包含5种，因此对挑取的单个菌落要同时进行EPEC,ETEC,EIEC,EHEC 和EAEC的检测，半轴繁琐，复杂。

分子生物学尤其是PCR方法以其快速、简便，灵敏度高，特异性强等特点，越来越多的应用于病原体毒力基因的检测，而大肠埃希氏菌的致泻性主要取决于是否携带相应的独立因子，因此该技术特别是多重PCR技术特别适合于5种致泻大肠埃希氏菌多种毒力基因的检测。

多重PCR技术，可以在一个反应体系中进行多个目的基因片段的PCR扩增，快速获得致病菌种属、型别和毒力基因的扩增结果。

美国早在2008版BAM上将PCR检测技术应用到致泻性大肠埃希氏菌的鉴定。

近年来，许多学者进行了该方面的研究，但仅限于一种致泻大肠的毒力基因和种属基因的检测，而同时对五种致泻大肠埃希氏菌进行鉴定的多重PCR试剂盒未见报道。

天津生物芯片开发的五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒通过同步扩增致泻性杆菌菌典型毒力基因，快速实现对EPEC/ EHEC/ ETEC/ EIEC/ EAEC等五种致泻性大肠埃希氏菌的型别划分和鉴定。

【预期用途】用于食品、饮用水、临床样品以及环境样品中的五种致泻性大肠杆菌（EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC）的分型检测。

【检验原理】五种致泻性大肠杆菌（EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC）共含有11种毒力基因，针对这11种毒力基因，试剂盒使用11对特异引物，与样本中基因组的相应靶位点特异性结合，PCR反应后，不同类型的样本产生不同的扩增片段，从而达到对五种致泻性大肠杆菌快速分型检测的目的。

大肠杆菌的原理、危害、检测与预防大肠杆菌是什么肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。

直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。

大肠杆菌属于细菌。

大肠杆菌的原理大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。

是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。

大肠杆菌能合成维生素B和K，正常栖居条件下不致病；若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。

在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。

大肠菌群数常作为饮水、食物或药物的卫生学标准。

大肠杆菌的危害大肠杆菌是原核生物，构造相对简单，遗传背景清晰，培养操作容易，因此也常常被作为基因工程的对象加以利用：研究者常常将外源基因导入质粒，将质粒整合入大肠杆菌基因，这样，大肠杆菌就能够表达基因重组后的蛋白（例如胰岛素，某些疫苗等）了。

此外，大肠杆菌还常常作为模型生物参与细胞学实验。

虽然绝大多数大肠杆菌与人类有着良好合作，但是仍有少部分特殊类型的大肠杆菌具有相当强的毒力，一旦感染，将造成严重疫情。

其中最具代表性的就是代号为O157:H7的大肠杆菌，它是EHEC （肠出血性大肠杆菌）家族中的一员。

大肠杆菌的传播途径O157H7大肠杆菌主要是通过污染食物而引起人的感染，O157H7大肠杆菌的致病能力和对胃酸的抵抗力均较强，对细胞的破坏性大。

因此很多国家将O157H7大肠杆菌引起的感染性腹泻归为食源性疾病。

在世界各地报告的爆发中，约有70%以上与进食可疑食物有关。

大肠埃希菌的鉴定要点和鉴定依据
1. 嘿，你知道吗？大肠埃希菌鉴定要点之一就是它的形态呀！你看，就像每个人都有独特的长相，大肠埃希菌也有自己特别的模样哦！比如在显微镜下观察，它是那种短杆状的，这可不是随便什么细菌都这样的哟！
2. 还有啊，大肠埃希菌的生长特性也是很关键的呢！它就像是一个对环境有要求的“小矫情”，在一些特定的培养基上才能长得好呢。

比如在伊红美蓝培养基上会呈现出很典型的特征，这就好比是它的专属印记！
3. 说到生化反应，这可是鉴定大肠埃希菌的重要依据呀！就好像是它独特的技能，一展示出来你就能认出它啦。

像能发酵乳糖产酸产气，哇，这可是它的招牌动作呢！
4. 你想过没有呀，血清学鉴定也很厉害呢！这不就像是给大肠埃希菌办了个专属身份证嘛。

有特定的血清可以跟它反应，一下子就能确定是不是它啦！
5. 耐药性也可以作为鉴定要点哦！它对某些药物的反应就像是它的个性签名一样，是独特的呀。

如果对某些药特别敏感或耐药，那很可能就是它哦！
6. 分子生物学鉴定现在也越来越重要啦！这就像是给大肠埃希菌做了个超级详细的身份鉴定，从基因层面来确定是不是它，多厉害呀！
7. 咦，还有它的致病性呢！有些大肠埃希菌可是会让人生病的哟，这就像是它隐藏的小“坏心思”。

了解这一点对于准确鉴定也很重要呢！
总之，这些鉴定要点和依据就像是一套组合拳，让我们能准确地认出大肠埃希菌这个家伙！。

大肠埃希氏菌生化鉴定结果
【原创实用版】
目录
1.大肠埃希氏菌的概述
2.大肠埃希氏菌的生化鉴定方法
3.大肠埃希氏菌在食品、药品、化妆品等行业的应用
4.大肠埃希氏菌菌株的保存与复活
正文
大肠埃希氏菌（Escherichia coli，简称 E.coli）是一种革兰氏阴性的短杆菌，周生鞭毛，能运动，无芽孢。

它能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常菌群。

大肠埃希氏菌在生化鉴定时，通常采用发酵乳糖产酸产气、IMViC 试验等方法进行鉴定。

在食品、药品、化妆品等行业中，大肠埃希氏菌常被用作阳性对照反应和培养基质量控制等实验。

例如，在食品检测中，大肠埃希氏菌被用作粪便污染指标，以评估食品的卫生质量。

此外，大肠埃希氏菌还可用于生产酸奶、发酵食品等。

大肠埃希氏菌菌株的保存与复活也是实验室工作中的重要环节。

为了保持菌株的质量稳定，长时间保存，可以采用真空冷冻干燥技术。

在复苏菌株时，需要使用配套的菌株复苏液和复活说明书，以确保菌株的简单、方便地复活。

总之，大肠埃希氏菌在生化鉴定、食品检测、发酵生产等方面具有广泛的应用。

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