蓖麻毒蛋白作用的研究进展

蓖麻粗毒蛋白的提取及灭鼠试验
胡良成;张越华;郭晓昭;宋光泉
【期刊名称】《广州城市职业学院学报》
【年(卷),期】2008(002)002
【摘要】研究了从蓖麻籽和蓖麻饼粕中提取蓖麻粗毒蛋白的工艺条件,并对其进行了灭鼠试验.结果表明:这两种蓖麻粗毒蛋白杀鼠活性明显,小鼠死亡率均达100%.从对小鼠的致死速度来看,两者相差不大.这为进一步分离提纯杀鼠活性成分提供了基础,也为蓖麻作为植物源灭鼠剂的开发提供了依据.
【总页数】3页(P31-33)
【作者】胡良成;张越华;郭晓昭;宋光泉
【作者单位】广州城市职业学院生物与环境工程系,广东,广州,510405;广州城市职业学院生物与环境工程系,广东,广州,510405;广州城市职业学院生物与环境工程系,广东,广州,510405;仲恺农业技术学院应用化学研究中心,广东,广州,510225
【正文语种】中文
【中图分类】Q945
【相关文献】
1.蓖麻粗毒蛋白中草药解毒剂的筛选 [J], 孙媚华;陈迁;宋光泉
2.蓖麻粗毒蛋白的提取及其杀鼠活性初步研究 [J], 张越华;郭晓昭;胡良成;宋光泉
3.具有灭鼠活性的蓖麻毒蛋白提取工艺的优化 [J], 周卫;詹帅军;何利钦;陶科;侯太平
4.蓖麻粗毒的分离、提取及野外灭鼠初步试验 [J], 高杉;何耀宏;侯太平
5.蓖麻粗毒的获取及草原灭鼠的应用研究 [J], 王松涛;赵建;侯若彤;杨志荣;张杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

２０２１年３月Ｖｏｌ．３９Ｎｏ．３Ｍａｒｃｈ２０２１ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ２６０ ２７０专论与综述ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０２０．１０００１收稿日期：２０２０⁃１０⁃１０∗通讯联系人．Ｔｅｌ：（０１０）６９７６０３３０，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉｕｃｈａｎｇｃａｉ＠ｓｋｌｎｂｃｐｃ．ｃｎ（刘昌财）；Ｔｅｌ：（０１０）６９７６０２５９，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉｕ＿ｓｈｉｌｅｉ＠ｌａｃｒｉｃｄ．ｃｏｍ（刘石磊）．基金项目：国民核化生灾害防护国家重点实验室基金项目（ＳＫＬＮＢＣ２０１８⁃１０）．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｉｔｅｍ：ＰｒｏｇｒａｍｏｆＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮＢＣＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒＣｉｖｉｌｉａｎ（Ｎｏ．ＳＫＬＮＢＣ２０１８⁃１０）．剧毒性Ⅱ型核糖体失活蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测鉴定方法研究进展梁龙辉１，２，㊀夏俊美２，㊀刘昌财１，２∗，㊀刘石磊１，２∗（１．国民核生化灾害防护国家重点实验室，北京１０２２０５；２．防化研究院分析化学实验室，北京１０２２０５）摘要：Ⅱ型核糖体失活蛋白（ＲＩＰｓ）是一类重要的蛋白毒素，该类毒素大都具有一对二硫键连接的Ａ⁃Ｂ链结构特征，Ｂ链具有半乳糖结合特性，能够与真核细胞膜表面受体特异性结合，将具有Ｎ⁃糖苷酶活性的Ａ链导入细胞，与核糖体特定位点发生脱嘌呤作用使核糖体失活，最终通过抑制蛋白质合成而展现出细胞毒性㊂Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素毒性极强，来源于植物的蓖麻毒素（ｒｉｃｉｎ）和相思子毒素（ａｂｒｉｎ）的毒性分别是神经性毒剂维埃克斯（Ｖｘ）的３８５倍和２８８５倍㊂同时，该类毒素来源广泛㊁易于制备㊁稳定性好，成为一类潜在化生恐怖战剂，受到国内外广泛关注，其中蓖麻毒素作为唯一的蛋白毒素被收录于禁止化学武器公约禁控清单㊂近年来发生的多次蓖麻毒素邮件恐怖事件，进一步促进了有关Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的准确㊁灵敏㊁快速的检测鉴定技术的发展㊂剧毒性Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的检测鉴定方法主要涉及免疫分析法为代表的特异性识别和生物质谱分析为主的定性定量检测方法，以及基于脱嘌呤反应活性和细胞毒性的毒素活性检测方法㊂基于抗原⁃抗体作用的免疫检测法及基于寡核苷酸适配体的特异性识别检测法具有速度快㊁灵敏度高的优势，但对于复杂样品中高度同源蛋白的检测，易产生假阳性结果㊂随着生物质谱技术的快速发展，电喷雾离化（ＥＳＩ）或基质辅助激光解吸离化（ＭＡＬＤＩ）等技术广泛应用于蛋白质的准确鉴定，不仅能够提供蛋白毒素的准确分子量和结构序列信息，而且能够实现准确定量㊂酶解质谱法是应用最为广泛的检测鉴定方法，通过酶解肽指纹谱分析，实现蛋白毒素的准确鉴定；对于复杂样品中蛋白毒素的分析，通过多种蛋白酶酶解策略获得丰富的特异性肽段标志物，然后进行肽段标志物的靶向质谱分析从而获得准确的定性及定量信息，方法有效提升了Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素鉴定的准确度和灵敏度㊂免疫分析法和生物质谱法能够准确鉴定Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素，但无法识别毒素是否还保持毒性㊂对于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的活性分析，主要包括基于Ｎ⁃糖苷酶活性的脱嘌呤反应测定法和细胞毒性测定法，两种方法均可实现毒素毒性的简便㊁快速㊁灵敏的分析检测，是Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素检测方法的有效补充㊂由于该类毒素的高度敏感性，国际禁止化学武器组织（ＯＰＣＷ）对相关样品中Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的分析提出了唯一性鉴定的技术要求㊂该文引用了Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素及其检测方法相关的７０篇文献，综述了以上Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的结构性质㊁中毒机理及典型剧毒性Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素检测方法的研究进展，对不同检测方法的特点和应用潜力进行了总结，并结合ＯＰＣＷ对Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素唯一性鉴定的技术需求，展望了未来Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素检测技术研究的发展趋势㊂关键词：Ⅱ型核糖体失活蛋白；Ｎ⁃糖苷酶活性；毒素；分析检测方法；综述中图分类号：Ｏ６５８㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀文章编号：１０００⁃８７１３（２０２１）０３⁃０２６０⁃１１ＨｉｇｈｌｙｔｏｘｉｃｔｙｐｅⅡｒｉｂｏｓｏｍｅ⁃ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｒｉｃｉｎａｎｄａｂｒｉｎａｎｄｔｈｅｉｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ：ａｒｅｖｉｅｗＬＩＡＮＧＬｏｎｇｈｕｉ１，２，ＸＩＡＪｕｎｍｅｉ２，ＬＩＵＣｈａｎｇｃａｉ１，２∗，ＬＩＵＳｈｉｌｅｉ１，２∗（１．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮＢＣＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒＣｉｖｉｌｉａｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２２０５，Ｃｈｉｎａ；２．ＴｈｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＤｅｆｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２２０５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｙｐｅⅡｒｉｂｏｓｏｍｅ⁃ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＲＩＰｓ）ａｒｅａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｌａｓｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｔｏｘ⁃ｉｎｓｔｈａｔｃｏｎｓｉｓｔｏｆＡａｎｄＢｃｈａｉｎｓｌｉｎｋｅｄｂｙａｎｉｎｔｅｒｃｈａｉｎｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄ．ＴｈｅＢ⁃ｃｈａｉｎｗｉｔｈｌｅｃ⁃ｔｉｎ⁃ｌｉｋｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｓｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｂｉｎｄｉｎｇｔｏｔｈｅｇａｌａｃｔｏｓｅ⁃ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒｓｏｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ㊃１６２㊃㊀第３期梁龙辉，等：剧毒性Ⅱ型核糖体失活蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测鉴定方法研究进展ｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒＡ⁃ｃｈａｉｎｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎｂｙｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ．ＴｈｅＡ⁃ｃｈａｉｎｈａｓＮ⁃ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｔｈａｔｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙｄｅｐｕｒｉｎａｔｅｓａｓｐｅｃｉｆｉｃａｄｅｎｉｎｅｆｒｏｍ２８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ（２８ＳｒＲＮＡ）ａｎｄｔｅｒｍｉｎａｔｅｓｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＴｈｅｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅＡ⁃Ｂｃｈａｉｎｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅ，ｉｎｈｉｂｉｔｓｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄｅｘｈｉｂｉｔｓｈｉｇｈｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＲｉｃｉｎａｎｄａｂｒｉｎｔｈａｔａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙｔｈｅｐｌａｎｔｓＲｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓａｎｄＡｂｒｕｓｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｒｅｔｙｐｉｃａｌｔｙｐｅⅡＲＩＰｓ．Ｔｈｅｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｒｉｃｉｎａｎｄａｂｒｉｎａｒｅ３８５ｔｉｍｅｓａｎｄ２８８５ｔｉｍｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｍｏｒｅｔｈａｔｏｆｔｈｅｎｅｒｖｅａｇｅｎｔＶＸ．Ｏｗｉｎｇｔｏｔｈｅｉｒｅａｓｅｏｆｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｗｉｄｅａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌｕｓｅａｓａｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍａｇｅｎｔ，ｔｙｐｅⅡＲＩＰｓｈａｖｅｇａｒｎｅｒｅｄｉｎｃｒｅａｓｉｎｇａｔｔｅｎｔｉｏｎｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ．Ｒｉｃｉｎｉｓｌｉｓｔｅｄａｓａｐｒｏｈｉｂｉｔｅｄｓｕｂｓｔａｎｃｅｕｎｄｅｒｓｃｈｅｄｕｌｅ１ＡｏｆｔｈｅＣｈｅｍｉｃａｌＷｅａｐｏｎｓＣｏｎｖｅｎ⁃ｔｉｏｎ（ＣＷＣ）．Ｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｒｉｃｉｎ⁃ｒｅｌａｔｅｄｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍｉｎｃｉｄｅｎｔｓｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓｈａｓｐｒｏｍｏ⁃ｔｅｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｙｐｅⅡＲＩＰｓ．ＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｈａｓｂｅｅｎｍａｄｅｉｎｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｏｘｉｃｉｔｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｓ，ｗｈｉｃｈｐｒｉｍａｒｉｌｙｉｎｖｏｌｖｅｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌａｓｓａｙｓ，ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄｔｏｘｉｎａｃｔｉｖ⁃ｉｔｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓｇｅｎｅｒａｌｌｙｉｎｖｏｌｖｅｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｇｅｎｓａｎｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｂａｓｅｄｏｎｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｅｌｅｍｅｎｔｓｃａｌｌｅｄａｐｔａｍｅｒｓ．Ｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓａｒｅｆａｓｔａｎｄｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｂｕｔｆｏｒｈｉｇｈ⁃ｌｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｃｏｍｐｌｅｘｓａｍｐｌｅｓ，ｔｈｅｙｐｒｏｖｉｄｅｆａｌｓｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓ．Ｗｉｔｈｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｓｕｃｈａｓｅｌｅｃｔｒｏｓ⁃ｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）ａｎｄｍａｔｒｉｘ⁃ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）ａｒｅｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓｎｏｔｏｎｌｙｐｒｏｖｉｄｅａｃｃｕｒａｔｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｎｍｏｌｅｃ⁃ｕｌａｒｗｅｉｇｈｔａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｂｕｔａｌｓｏｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅａｃｃｕｒａｔｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｉｓｔｈｅｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙｕｓｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ａｃｃｕ⁃ｒａｔｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｔｏｘｉｎｓｃａｎｂｅａｃｈｉｅｖｅｄｂｙｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙｄｉｇｅｓｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｔｏｘｉｎｓｉｎｃｏｍｐｌｅｘｓａｍｐｌｅｓ，ａｂｕｎｄａｎｔｐｅｐｔｉｄｅｍａｒｋｅｒｓａｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｕｓｉｎｇａｍｕｌｔｉ⁃ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｔａｒｇｅｔｅｄｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｅｐｔｉｄｅｍａｒｋｅｒｓｉｓｕｓｅｄｔｏｏｂｔａｉｎａｃｃｕｒａｔｅｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｅｆｆｅｃ⁃ｔｉｖｅｌｙｉｍｐｒｏｖｅｓｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｔｏｘｉｎｓ．ＡｌｔｈｏｕｇｈｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙａｎｄｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｃｃｕｒａｔｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｓ，ｔｈｅｙｃａｎｎｏｔｄｅｔｅｒｍｉｎｅｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｔｏｘｉｎｓｗｉｌｌｒｅｔａｉｎｐｏｔｅｎｃｙ．ＴｈｅｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒａｃｔｉｖｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｓｉｎｃｌｕｄｅｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎａｓｓａｙｂａｓｅｄｏｎＮ⁃ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｓｓａｙ．Ｂｏｔｈｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｐｒｏｖｉｄｅｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ，ａｎｄｓｅｎｓｉ⁃ｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｔｏｘｉｃｉｔｙ，ａｎｄｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｏｔｈｅｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ．ＯｗｉｎｇｔｏｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｔｏｘｉｎｓ，ｔｈｅＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＰｒｏｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＷｅａｐｏｎｓ（ＯＰＣＷ）ｈａｓｐｒｏｐｏｓｅｄｃｌｅａｒｔｅｃｈｎｉｃａｌｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌｅ⁃ｖａｎｔｓａｍｐｌｅｓ．Ｗｅｈｅｒｅｉｎｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ；ｎｅａｒｌｙ７０ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｙｐｅⅡＲＩＰｔｏｘｉｎｓａｎｄｔｈｅｉｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｈａｖｅｂｅｅｎｃｉｔｅｄ．ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎｔｏｔｈｅｔｅｃｈｎｉｃａｌｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆＯＰＣＷｆｏｒｔｈｅｕｎａｍｂｉｇｕｏｕｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｔｏｘｉｎｓ，ｔｈｅｔｒｅｎｄｏｆｆｕｔｕｒｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰ⁃ｂａｓｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｓｂｅｅｎｅｘｐｌｏｒｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｙｐｅⅡｒｉｂｏｓｏｍｅ⁃ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＲＩＰｓ）；Ｎ⁃ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ；ｔｏｘｉｎ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ；ｒｅｖｉｅｗ色谱第３９卷㊀㊀核糖体失活蛋白（ＲＩＰｓ）是一类Ｎ⁃糖苷酶家族的特征毒蛋白，基于蛋白结构，ＲＩＰｓ被分为Ⅰ型㊁Ⅱ型㊁Ⅲ型共３类［１］㊂Ⅰ型ＲＩＰｓ由单亚基或两个亚基通过非肽键相连构成，相对分子质量约为３０ｋＤａ，具有ＲＮＡ⁃Ｎ⁃糖苷酶活性，例如商陆植物（Ｐｈｙｔｏｌａｃ⁃ｃａａｃｉｎｏｓａ）的ＰＡＰ蛋白和玉米黍的Ｍａｉｚｅｂ⁃３２蛋白等［２，３］㊂Ⅲ型ＲＩＰｓ全部由单亚基构成，相对分子质量约为２５ｋＤａ，通常以前体形式存在，包括Ｎ⁃糖苷酶活性区和未知功能区，经酶切加工转换生成有活性的ⅡＩ型ＲＩＰｓ，目前，仅在大麦中分离检测出Ⅲ型ＲＩＰ蛋白ＪＩＰ６０［４］㊂Ⅱ型ＲＩＰｓ是两个亚基通过二硫键连接构成的异二聚体蛋白，含有Ａ㊁Ｂ链，其中Ａ链为功能链，具Ｎ⁃糖苷酶活性；Ｂ链为结合链，具半乳糖结合的凝集素活性㊂与Ｉ型和Ⅲ型ＲＩＰｓ相比，Ⅱ型ＲＩＰｓ多了具有凝集素活性的Ｂ链，导致其毒性远高于Ｉ型和Ⅲ型ＲＩＰｓ［３］㊂目前，除在少数几种细菌和真菌中发现以外，Ⅱ型ＲＩＰｓ主要存在于一些有毒植物中，并且具有明显的组织特异性，普遍发现植物成熟种子中Ⅱ型ＲＩＰｓ活性相对较高［２］㊂３种类型的ＲＩＰｓ结构及代表蛋白质如图１所示㊂表１㊀剧毒Ⅱ型ＲＩＰｓ及其毒性［２］Ｔａｂｌｅ１㊀ＨｉｇｈｌｙｔｏｘｉｃｔｙｐｅⅡＲＩＰｓａｎｄｔｈｅｉｒｔｏｘｉｃｉｔｙ［２］ＴｏｘｉｎＳｏｕｒｃｅＴｏｘｉｃｉｔｙＨｅｌａｃｅｌｌＩＣ５０／（ｍｏｌ／Ｌ）ａ）ＭｉｃｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎＬＤ５０／（μｇ／ｋｇ）ｂ）Ａｂｒｉｎ（相思子毒素）Ａｂｒｕｓｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓｓｅｅｄｓ３．９ˑ１０－１２０．０４Ｒｉｃｉｎ（蓖麻毒素）Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓｓｅｅｄｓ６．０ˑ１０－１３３ＭｉｓｔｌｅｔｏｅｌｅｃｔｉｎＩ（槲寄生凝集素Ｉ）Ｖｉｓｃｕｍａｌｂｕｍｌｅａｖｅｓ１．７ˑ１０－９２．４Ｍｏｄｅｃｃｉｎ（药莲毒素）Ａｄｅｎｉａｄｉｇｉｔａｔａｒｏｏｔ２．８ˑ１０－１２５．３Ｖｏｌｋｅｎｓｉｎ（蒴莲毒素）Ａｄｅｎｉａｖｏｌｋｅｎｓｉｉｒｏｏｔ３．０ˑ１０－１３１．７ＲＩＰ（ＲＩＰ毒素）Ａｄｅｎｉａｇｏｅｔｚｉｉｃａｕｄｅｘ１．０ˑ１０－１２－Ｌａｎｃｅｏｌｉｎ（柳杉毒素）Ａｄｅｎｉａｌａｎｃｅｏｌａｔａｃａｕｄｅｘ５．０ˑ１０－１３６．８Ｓｔｅｎｏｄａｃｔｙｌｉｎ（西番莲毒素）Ａｄｅｎｉａｓｔｅｎｏｄａｃｔｙｌａｃａｕｄｅｘ３．０ˑ１０－１３１．２Ａｒａｌｉｎ（阿拉林毒素）Ａｒａｌｉａｅｌａｔａｓｈｏｏｔｓ１．３ˑ１０－１２－Ｒｉｐｒｏｘｉｍｉｎ（利普西敏毒素）Ｘｉｍｅｎｉａａｍｅｒｉｃａｎａｐｏｗｄｅｒ１．１ˑ１０－１２－㊀ａ）ＩＣ５０：ｈａｌｆｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ｂ）ＬＤ５０：ｌｅｔｈａｌｄｏｓｅｏｆ５０％．－：ｎｏｔｒｅｐｏｒｔｅｄ．㊀㊀Ⅱ型ＲＩＰｓ发挥毒性作用的分子机理是能够特异㊁不可逆地催化脱去真核细胞核糖体的２８ＳｒＲＮＡ中保守ＧＡＧＡ⁃茎环结构中的第一个腺苷上的腺嘌呤，导致核糖体失去进行正常的蛋白质合成功能，从而引起细胞死亡［５，６］㊂表１列举了代表性剧毒Ⅱ型ＲＩＰｓ蛋白的来源及毒性［２］㊂在已发现的剧毒Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素中，蓖麻毒素和相思子毒素的毒性最强㊁危害最大㊂由于分布广泛㊁易于获得㊁致命性强等特点，Ⅱ型ＲＩＰｓ被一些国家军方深入研究并制作为化学武器［７］，第一次世界大战期间，美军曾对蓖麻毒素开展过深入研究，并开展了蓖麻毒素作为吸入剂图１㊀３种类型核糖体失活蛋白的结构示意图［１］Ｆｉｇ．１㊀Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｔｙｐｅｓｏｆｒｉｂｏｓｏｍｅ⁃ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＲＩＰｓ）［１］的测试试验㊂在第二次世界大战期间，英国军方研发了一种含有蓖麻毒素的复合炸弹，只是由于难以将大剂量的蓖麻毒素原体转化为气溶胶状态，这类武器还未在正式战争中使用［４］㊂但是，蓖麻毒素经常被作为生物恐怖战剂用于恐怖袭击以及政治暗杀等活动中［７］㊂１９７８年在伦敦的国际间谍人员曾用装有蓖麻毒素的伞尖在公开场所行刺，造成保加利亚作家及持不同政见者乔治㊃马可夫中毒身亡㊂２０１３年和２０２０年，美国时任总统奥巴马和特朗普都收到了含有蓖麻毒素粉末的信件㊂此外，Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素来源广泛，易于制备，一旦被不法分子掌握其制备技术，将会成为严重的安全隐患㊂㊀㊀因此，无论是化学武器核查还是生物恐怖防御，对剧毒Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素开展检测研究十分重要，也是国内外学者关注的热点㊂目前国际禁止化学武器组织（ＯＰＣＷ）正在组织国际相关领域实验室开展毒素分析演练工作，旨在形成技术体系完善的检测能力，并将毒素分析结果根据获得的信息分为４级，分别是：唯一性鉴定（ｕｎａｍｂｉｇｕｏｕｓ）㊁确证（ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ）㊁㊃２６２㊃㊀第３期梁龙辉，等：剧毒性Ⅱ型核糖体失活蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测鉴定方法研究进展临时性确证（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）和未确证（ｕｎｃｏｎ⁃ｆｉｒｍｅｄ）㊂由于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的高度敏感性，ＯＰＣＷ要求对样品必须实现最高级别的唯一性鉴定［８］，这包括必须提供：１）应用质谱或电泳检测的毒素分子量信息；２）应用酶解⁃串联质谱检测至少两条分别来源于Ａ链和Ｂ链肽段标志物的质谱鉴定结果；３）应用酶联免疫吸附检测（ＥＬＩＳＡ）检测的毒素定量分析结果；４）应用脱嘌呤或体外细胞毒性检测方法对Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素Ａ链的脱嘌呤活性以及可选的Ｂ链凝集素活性的鉴定结果㊂本课题组所在的防化研究院分析化学实验室作为ＯＰＣＷ指定实验室代表中国持续参加该毒素分析演练任务，研究并构建了包括酶解质谱结构鉴定㊁ＥＬＩＳＡ定量检测以及体外脱嘌呤活性检测等Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素唯一性鉴定技术体系［９－１２］㊂本文综述了典型Ⅱ型ＲＩＰｓ蓖麻毒素和相思子毒素的理化性质㊁毒理作用及其检测鉴定方法研究进展，以期为开展相关科学研究提供参考依据㊂１㊀Ⅱ型ＲＩＰｓ的毒性作用机理１．１㊀毒理作用㊀㊀Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的Ａ链具Ｎ⁃糖苷酶活性，特异性水解真核细胞核糖体６０Ｓ大亚基２８ＳｒＲＮＡ保守茎环结构顶部四核苷酸ＧＡ４３２４ＧＡ的腺嘌呤残基；Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的Ｂ链具凝集素特性，通过两个球状结构域发挥活性，每个结构域含有一个半乳糖结合位点，与细胞表面的半乳糖结合，介导Ａ链进入细胞［１３］，导致核糖体失活，从而抑制蛋白质合成，最终引起细胞死亡［９－１１］㊂研究［１４］显示，蓖麻毒素与ＨｅＬａ细胞具较强的相互作用，在每个细胞上检测到约３ ３ˑ１０７个毒素结合位点，结合常数达到２ ６ˑ１０７ｍｏｌ－１㊂然而，Ⅱ型ＲＩＰｓ对植物细胞展现的毒性远不如动物细胞，原因可能是植物细胞壁表面的半乳糖结合位点较少［２］㊂㊀㊀Ⅱ型ＲＩＰｓ毒性强，相思子毒素和蓖麻毒素的小鼠静脉注射毒性是神经性毒剂维埃克斯（Ｖｘ）的２８８５倍和３８５倍㊂同时，研究［１５，１６］发现，序列高度同源的Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素以及毒素不同亚型之间的毒性具有较大差异㊂例如，同样来源于植物蓖麻子中的蓖麻凝集素（ＲＣＡ１２０）具有与蓖麻毒素相似的糖苷酶活性，其氨基酸序列与蓖麻毒素Ａ链和Ｂ链的同源性分别达到了９３％和８４％，但其细胞毒性不足蓖麻毒素的十分之一［１７］㊂相思子毒素存在ａ㊁ｂ㊁ｃ和ｄ４种亚型，同源性高达７８％，但毒性差异较大，其中相思子毒素⁃ｂ和相思子毒素⁃ｃ由于其Ｂ链的凝集素活性较低而只有较弱的细胞毒性，反之相思子毒素⁃ａ与相思子毒素⁃ｄ具有极强的细胞毒性［１５，１８］㊂ＲＩＰｓ细胞毒性产生巨大差异的原因主要与细胞表面的受体数量㊁受体亲和力以及ＲＩＰｓ本身的抗降解能力等因素有关㊂１．２㊀细胞内转运途径㊀㊀对于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素在细胞内的代谢途径，目前公认的机理是［１９］：Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素通过胞吞作用进入细胞膜，一部分返回细胞膜表面，另一部分进入初级内体（ｅａｒｌｙｅｎｄｏｓｏｍｅｓ）后被转运至次级内体（ｌａｔｅｅｎｄｏｓｏｍｅｓ）；次级内体中的毒素大部分进入溶酶体中进行降解，仅约５％的毒素原体到达高尔基体反面网络结构，经逆向转运至内质网（ＥＲ）；在蛋白质二硫键异构酶和分子伴侣的作用下，Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素Ａ链和Ｂ链解离，暴露出疏水区域的Ａ链从ＥＲ释放到细胞质中发挥毒理作用（见图２）［７］㊂此Ａ㊁Ｂ链解离代谢途径在酵母中得到了证实，研究［２０］表明进入内质网的蓖麻毒素Ａ链（ＲＴＡ）通过误折叠激活内质网相关蛋白质降解途径（ＥＲＡＤ），将Ａ㊁Ｂ链解离并使ＲＴＡ穿过ＥＲ膜进入胞浆后在完整核糖体诱导下重新折叠，恢复活性，催化２８ＳｒＲＮＡ脱去腺嘌呤，破坏核糖体结构，导致细胞死亡㊂２㊀Ⅱ型ＲＩＰｓ的检测鉴定方法㊀㊀由于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的特点及毒害作用，使得此类致命毒素在化生防护㊁化武履约核查和防反化生恐怖等工作中备受关注㊂利用分析检测技术准确鉴定环境及生物医学等样本中的Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素，可为Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的使用取证㊁核查分析以及染毒人员的救治提供重要技术依据㊂基于结构与活性，我们将剧毒性Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的检测方法分为３大类，第一类是基于免疫等原理的特异性识别检测方法分析方法，第二类是生物质谱分析方法，前两类均属于毒素非活性定性定量分析方法；第三类是基于脱嘌呤反应活性和细胞毒性的毒素活性体外检测分析法㊂２．１㊀特异性识别检测方法２．１．１㊀酶联免疫吸附检测㊀㊀ＥＬＩＳＡ是将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体专一性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法㊂ＥＬＩＳＡ方法种类较㊃３６２㊃色谱第３９卷图２㊀Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素进入细胞及在细胞内运输途径的示意图［７］Ｆｉｇ．２㊀ＰａｔｈｗａｙｏｆｔｙｐｅⅡＲＩＰｔｏｘｉｎｓｅｎｔｅｒｉｎｇｃｅｌｌｓａｎｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇｉｎｃｅｌｌｓ［７］ＥＲ：ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．多且具有敏感度高㊁特异性强㊁操作简便等特点，使其在Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的检测中应用最为广泛㊂随着增强比色法和化学发光技术的出现，进一步提高了ＥＬＩＳＡ方法的灵敏度［２１，２２］㊂Ｓｈｙｕ等［２３］建立了尿液和血清样品中蓖麻毒素的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ定量检测方法，检出限达到了５ ０ｎｇ／ｍＬ㊂王晨宇等［２４］利用蓖麻毒素单克隆抗体（ＭＡｂ）３Ｄ７４和标记的小鼠抗⁃蓖麻毒素单克隆抗体４Ｃ１３辣根过氧化物酶（ＨＲＰ），建立了定量检测血清和大鼠组织样品中蓖麻毒素的双夹心ＥＬＩＳＡ方法，检出限为１ ２５ｎｇ／ｍＬ，方法应用于蓖麻毒素组织分布的定量测定，在静脉染毒大鼠的心㊁肝㊁脾㊁肺㊁肾㊁肠和脂肪等组织中均成功检测出蓖麻毒素㊂Ｌｅｉｔｈ等［２５］应用亲和素⁃生物素⁃过氧化物酶复合物法（ａｖｉｄｉｎ⁃ｂｉｏｔｉｎ⁃ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｃｏｍｐｌｅｘｍｅｔｈｏｄ，ＡＢＣ法），建立了动物组织样本中蓖麻毒素的竞争ＥＬＩＳＡ检测方法，检出限达到０ ２ｎｇ／ｍＬ㊂ＥＬＩＳＡ方法的缺点是对抗体的要求极为苛刻，一旦出现抗体对同源性抗原间的交叉反应，极容易产生假阳性结果㊂同源蛋白干扰（如蓖麻毒素与蓖麻凝集素ＲＣＡ１２０，相思子毒素与相思子凝集素（ａｂｒｕｓａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ））一直是ＥＬＩＳＡ方法检测Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的技术瓶颈，随着样品基质复杂程度的提高，出现假阳性结果的可能性也大大提高㊂为了区分Ⅱ型ＲＩＰｓ同源蛋白蓖麻毒素和ＲＣＡ１２０，德国ＲｏｂｅｒｔＫｏｃｈ研究中心［２６］开发了蓖麻毒素和ＲＣＡ１２０的专属双夹心ＥＬＩＳＡ方法㊂蓖麻毒素⁃ＥＬＩＳＡ双抗体夹心方法应用单抗Ｒ１８（抗蓖麻毒素Ａ链）与单抗Ｒ１０９（抗蓖麻毒素Ｂ链），对蓖麻毒素的最低检出限达到２ｐｇ／ｍＬ，定量范围为５７０８ｐｇ／ｍＬ，在蓖麻毒素定量线性检测范围内，该方法与同源蛋白ＲＣＡ１２０基本不发生交叉反应；ＲＣＡ１２０⁃ＥＬＩＳＡ双抗体夹心方法应用ＲＣＡ１２０单抗ＡＲＫ４和多抗ＩＧＹＲＣ２２，对ＲＣＡ１２０的最低检出限达到１ｐｇ／ｍＬ，定量范围为３ ００ １５４９ｐｇ／ｍＬ，在ＲＣＡ１２０的线性检测范围内，该方法对同源蛋白蓖麻毒素基本不发生交叉反应㊂该中心［２７］应用这两个方法，在２０１３年国际 复杂基质中蓖麻毒素定性和定量检测 能力考试中，准确鉴定出９个样品中添加的蓖麻毒素或蓖麻凝集素，定量检测结果准确度均达到９０％以上㊂２０１７年，Ｈｅ等［２８］从７种相思子毒素新型单克隆抗体中分别筛选出专属相思子毒素Ａ链和Ｂ链的单克隆抗体，并建立了相思子毒素夹心ＥＬＩＳＡ检测方法，该方法能够区分相思子毒素和其同源蛋白相思子凝集素，对牛奶等基质，相思子毒素检出限达为１ｎｇ／ｍＬ㊂随着抗体技术的不断发展，ＥＬＩＳＡ分析法在专属性方面取得了很大的进步，然而，要想获得专属性强的抗体，制备成本非常高，而且需要忍受较短的储存期限和苛刻的保存条件㊂２．１．２㊀蛋白质免疫印迹法㊀㊀蛋白质印迹法（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，ＷＢ）是将经过凝胶电泳分离的蛋白质样品转移到固相膜载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，再利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法㊂近年来，ＷＢ也常应用于Ⅱ型ＲＩＰ毒素的检测，Ｌａｎｇ等［２９］采用抗ＲＴＡ的兔血清作为抗体，建立了蓖麻毒素的ＷＢ检测方法，最低检出限可达１ｎｇ㊂该方法已成㊃４６２㊃㊀第３期梁龙辉，等：剧毒性Ⅱ型核糖体失活蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测鉴定方法研究进展功应用于兔血清㊁肝脏组织样品中蓖麻毒素的检测，能够分别在最低加标水平为０ ６７μｇ／ｍＬ的兔血清㊁肝脏组织匀浆样本中检测出蓖麻毒素㊂２．１．３㊀免疫磁性微球及生物传感检测㊀㊀免疫磁性微球（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃｍｉｃｒｏ⁃ｓｐｈｅｒｅｓ，ＩＭＭＳ）检测将目标蛋白抗体与磁性微球进行偶联，特异性捕获复杂基质中的目标蛋白，从而达到分离纯化和检测目的㊂免疫磁性微球捕获具分离速度快㊁效率高㊁操作简单㊁重现性好等优点，结合荧光㊁化学发光或电化学发光检测技术，极大地提升了检测速率，使检测时间由８ｈ缩短至２ ４ｈ［３０，３１］㊂基于免疫原理发展的生物传感检测技术，其最大优点是能够通过微型芯片的设计，实现多种毒素的同时快速检测，是事故现场快速检测的有效手段㊂Ｄｅｌｅｈａｎｔｙ等［３２］使用配备电荷耦合原件的抗体微阵列免疫芯片，在１５ｍｉｎ内实现了霍乱毒素㊁葡萄球菌肠毒素Ｂ（ＳＥＢ）㊁蓖麻毒素和芽孢杆菌的同时检测，其中蓖麻毒素的检出限为１０ｎｇ／ｍＬ㊂Ｌｉｇｌｅｒ等［３３］对免疫芯片进一步优化设计，实现了６种毒素的同时检测㊂Ｍｕ等［３４］发展了一种基于隧道磁阻（ＴＭＲ）生物传感器的蓖麻毒素快速检测新方法，将磁免疫色谱试纸与ＴＭＲ磁敏传感器信号检测有效地结合在一起，通过检测功能化磁信号探针在免疫色谱试纸上产生的磁场强度，实现蓖麻毒素的快速检测，定量检测的线性范围为１ｎｇ／ｍＬ ２００μｇ／ｍＬ㊂该方法克服了复杂环境干扰物对毒素检测的影响，可以满足水㊁土壤㊁食物㊁血液等复杂样品的分析要求㊂Ｎａｓｉｒａｈｍａｄｉ等［３５］以含有９个氨基酸的肽段分子印迹聚合物作为模板，在紫外光作用下，在功能单体和表位之间的氢键作用下形成分子印迹聚合物，然后使用２ ５％的十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）和０ ６％乙酸对聚合物进行衍生，最终得到生物传感芯片；将设计的纳米生物传感器应用于血浆和尿样等样品中槲寄生蛋白毒素的快速检测，检出限分别为０ ５和１ ２５ｎｇ／μＬ㊂２．１．４㊀适配体分析法㊀㊀目前已报道的基于抗体识别原理的免疫分析法具有灵敏度高㊁专属性好㊁耗时短㊁定量准确等优点，广泛应用于复杂基质中Ⅱ型ＲＩＰｓ蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测㊂存在的不足是：方法依赖亲和力强㊁效价高的抗体，对实验室抗体制备能力要求较高，且抗体的贮存稳定性较差㊂Ｓｈｕ等［３６］通过指数富集的配体系统进化技术（ＳＥＬＥＸ），结合ＰＣＲ体外扩增，经过数轮反复的体外筛选㊁扩增得到与蓖麻毒素抗体亲和力和特异性相当的寡核苷酸适配体，建立了基于适配体识别的多纳米孔检测技术，实现了蓖麻毒素的有效检测㊂Ｔａｎｇ等［３７，３８］使用ＳＥＬＥＸ技术筛选出了蓖麻毒素和相思子毒素的适配体并应用于两种毒素的定量检测，定量限分别为１μｇ和０ ３μｇ㊂与免疫识别法相比，适配体的最大优势在于稳定性好㊁可反复使用，但存在筛选过程复杂㊁灵敏度较差等问题㊂因此Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的特异性识别技术的一个关键在于设计制备稳定性好㊁灵敏度高的适配体㊂２．２㊀生物质谱分析㊀㊀２０世纪８０年代发展起来的基质辅助激光解吸附离子化（ＭＡＬＤＩ）和电喷雾离子化（ＥＳＩ）技术，为分析稳定性差㊁难挥发的生物大分子样品提供了优越的分析手段，越来越多的科学家将质谱技术应用于核酸㊁蛋白质等大分子的检测与鉴定㊂如今，生物质谱法已成为复杂样品中蛋白质鉴定的基本方法㊂利用生物质谱技术可以实现大分子蛋白质相对分子质量的测定，２０００年，Ｄｅｓｐｅｙｒｏｕｘ等［３９］使用ＥＳＩ⁃四极杆（Ｑ）质谱对蓖麻毒素进行鉴定，蓖麻毒素原体经电喷雾离化产生多电荷离子，将数据进行解卷积计算，最终得到平均相对分子质量为６３ｋＤ的质谱峰簇，即为蓖麻毒素的相对分子质量㊂高分辨质谱的发展可以提供更为准确的相对分子质量信息，从而有效提升鉴定结果准确性㊂例如ＭＡＬＤＩ⁃飞行时间（ＴＯＦ）高分辨质谱被报道用于鉴定完整蓖麻毒素原体，该方法检测到的蓖麻毒素的相对分子质量为６２７６６Ｄａ［４０］㊂然而，在实际应用中，相对分子质量测定法仍无法给出Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的准确结构信息［４１］㊂随后，人们［４２］尝试在分析前将毒素进行酶解，再应用ＬＣ⁃ＭＳ分析肽指纹图谱或ＬＣ⁃ＭＳ／ＭＳ靶向测定特异性肽段，通过酶解肽段氨基酸序列的鉴定，鉴定蛋白毒素的序列结构，依据这种策略发展出了酶解质谱分析法㊂２．２．１㊀酶解质谱鉴定法㊀㊀与免疫分析方法相比，酶解质谱法具有很多优势：１）能够准确鉴定毒素特异性肽段的氨基酸序列，从而实现高度同源蛋白间的差异性鉴定；２）准确识别毒素蛋白分子内的二硫键位置及翻译后修饰信息；３）通过靶向特异性肽段的定量检测从而实现Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素原体的定量检测㊂此外，酶解质谱技术可以与各种分离纯化技术（如凝胶亲和㊁免疫磁㊃５６２㊃色谱第３９卷珠㊁一维及二维电泳等）结合，在质谱分析前对目标蛋白进行富集纯化，降低基质干扰，实现复杂基质中Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素专一㊁灵敏的检测㊂酶解质谱法的分析策略如图３所示［４２］㊂图３㊀酶解质谱法分析蛋白策略［４２］Ｆｉｇ．３㊀Ｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓｂｙｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｆｏｌｌｏｗｉｎｇｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ［４２］ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ：ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅ⁃ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．㊀㊀酶解质谱法将大分子蛋白质酶解生成多肽混合物，然后使用高分辨质谱技术（ＬＣ⁃Ｑ⁃ＴＯＦＭＳ或ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ）分析肽指纹图谱（ＰＭＦ）或ＬＣ⁃ＥＳＩ⁃ＭＳ／ＭＳ靶向测定特异性肽段，从而实现蛋白质的鉴定㊂２００１年，Ｄａｒｂｙ［４０］首次将ＰＭＦ法应用于蓖麻毒素的鉴定，分别使用ＬＣ⁃Ｑ⁃ＴＯＦＭＳ和ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ对蓖麻毒素的酶解产物进行分析，结合数据库检索，成功鉴定出蓖麻毒素的１４条肽段㊂Ｓｏｕｓａ等［４３］采用加速溶剂萃取（ＡＳＥ）技术处理含有蓖麻毒素的复杂样品，经ＳＤＳ⁃聚丙烯酰胺凝胶（ＰＡＧＥ）㊁胰蛋白酶解后采用ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ对酶解的肽段进行鉴定，通过ＰＭＦ数据库检索，鉴定出蓖麻毒素的１９条肽段，然后对其中３条唯一性肽段进行ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ／ＭＳ二级质谱检测，实现了蓖麻毒素的唯一性鉴定㊂㊀㊀这些方法虽然准确度高，但在酶解前需要变性㊁还原和烷基化等步骤，整个过程步骤多㊁周期长㊂为解决这一问题，有机溶剂辅助直接酶解蛋白质原体的方法被开发并应用于蓖麻毒素的分析鉴定，例如在酶解样品中使用甲醇等能够有效促进胰蛋白酶解效率㊁缩短酶解时间，这些方法在蓖麻毒素的鉴定与高灵敏检测等方面都取得了较好的结果㊂目前，Ｔ７Ａ㊁Ｔ１１Ａ㊁Ｔ６Ｂ和Ｔ１８Ｂ是蓖麻毒素的胰蛋白酶解肽段中使用最多的代表性肽段标识物，被广泛应用于粉末㊁蓖麻子粗提物㊁牛奶㊁饮料等复杂基质中痕量蓖麻毒素的唯一性鉴定［４１，４４－４９］㊂但是，该方法存在酶解效率较低㊁易发生漏切等缺点㊂本课题组［１１］研究发现乙腈有助于胰蛋白酶准确酶解毒素原体㊁高效生成标识性肽段，并开发和建立了一种乙腈辅助胰蛋白酶直接酶解蓖麻毒素原体的方法，显著提高了酶解效率，将酶解反应时间从１８ｈ减至４ｈ㊂㊀㊀随着技术的不断发展，近年来，免疫磁珠㊁凝胶亲和等技术常作为高效的样品制备手段被应用于复杂基质中目标物的分离与纯化，与质谱等技术相结合，在蛋白质鉴定等方面发挥着重要的作用㊂２０１１年，美国疾控中心（ＣＤＣ）的ＭｃＧｒａｔｈ等［４６］通过制备修饰蓖麻毒素抗体的免疫磁珠，对饮用水㊁牛奶㊁果汁等基质中的蓖麻毒素进行富集，经胰蛋白酶酶解，利用液相色谱⁃线性离子阱质谱靶向鉴定蓖麻毒素Ａ链和Ｂ链的标志性肽段（Ｔ７Ａ和Ｔ１８Ｂ），最终实现了蓖麻毒素的高灵敏鉴定与定量分析，最低检出限达到０ ６４ｎｇ／ｍＬ㊂２０１５年，Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ等［５０］采用半乳糖凝胶树脂填充柱，对饮用水，饮料㊁粉末以及擦拭样品中的典型剧毒Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素（蓖麻毒素㊁相思子毒素㊁蓖麻凝集素）进行选择性富集，结合胰蛋白酶解和高分辨质谱靶向检测技术，实现了复杂样品中Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素准确鉴定㊂Ｆｅｌｄｂｅｒｇ等［５１］采用琼脂糖凝胶亲和富集结合三重四极杆串联质谱技术建立了复杂环境样品中痕量蓖麻毒素的检测方法；该方法对从不同地理区域获取的６０种不同环境样本（例如土壤㊁沥青和植被）进行测定，蓖麻毒素的最低检出限达到１ｎｇ／ｍＬ（ｇ）㊂㊀㊀除了使用胰蛋白酶解以外，近年来，科学工作者们还探索了其他酶解方法㊂本课题组［１２］系统研究了蓖麻毒素在不同蛋白酶解（糜蛋白酶㊁胃蛋白酶㊁蛋白酶Ｋ和胰蛋白酶／胞内蛋白酶（Ｇｌｕ⁃Ｃ）串联酶㊃６６２㊃㊀第３期梁龙辉，等：剧毒性Ⅱ型核糖体失活蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测鉴定方法研究进展解）体系中的最优酶解条件，采用ＬＣ⁃ＥＳＩ⁃Ｑ／ＴＯＦＭＳ高分辨质谱对酶解产生的肽段进行鉴定，结合美国国家生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）数据库检索比对，对所有肽段的专属性进行确认与分类，最终筛选鉴定出专属性强且质谱响应好的肽段作为蓖麻毒素的肽段标志物，大大丰富了唯一性鉴定蓖麻毒素肽段标志物的选择范围㊂此外，本课题组［５２］通过离子交换㊁ＨＰＬＣ等方法对我国东北槲寄生植物（Ｖｉｓ⁃ｃｕｍ．ＯｌｏｒａｔｕｍＮａｋａｉ）中的槲寄生毒素进行分离纯化，使用Ｇｌｕ⁃Ｃ酶解槲寄生毒素，然后采用ＭＡＬ⁃ＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ对酶解的肽段进行测定，首次鉴定出含有四对二硫键的槲寄生毒素Ｂ７㊂Ｂｒａｕｎ等［５３］报道了使用糜蛋白酶蓖麻毒素进行酶解过夜，使用高分辨液相色谱⁃质谱对糜蛋白酶酶解产生的两条蓖麻毒素肽段进行靶向鉴定，成功实现了植物提取物和土壤样品中蓖麻毒素的准确鉴定㊂㊀㊀近年来，酸消解技术也被用于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的分析鉴定㊂Ｃｈｅｎ等［５４］采用微波辅助⁃热酸消解方法选择性水解蓖麻毒素氨基酸序列中的天冬氨酸残基，水解时间仅需要１５ｍｉｎ，大大提高了反应效率，结合ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ检测，成功鉴定出蓖麻毒素中的二硫键肽段，为蓖麻毒素的物证鉴定提供了一种可靠的技术手段㊂２．２．２㊀质谱定量检测㊀㊀随着ＬＣ⁃ＭＳ技术的发展，目前除了实现痕量毒素的定性检测外，更多的努力被放在定量分析研究中㊂液相色谱⁃三重四极杆质谱（ＬＣ⁃ＱＱＱＭＳ）的多反应监测模式（ＭＲＭ）和液相色谱⁃四极杆⁃轨道离子阱质谱（ＬＣ⁃Ｑ⁃ＯｒｂｉｔｒａｐＭＳ）的平行反应监测模式（ＰＲＭ）在较宽的动态范围内具有很好的线性响应，在Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的定量分析方面得到了广泛的关注和应用㊂质谱定量离不开同位素标记的内标，目前的研究大多基于同位素标记多肽为内标的绝对定量策略（ａｂｓｏｌｕｔｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｐｅｐｔｉｄｅｓｔｒａｔ⁃ｅｇｙ，ＡＱＵＡ）：在质谱分析前，向样品中添加已知浓度的同位素标记的多肽内标，由于内标肽段与目标肽段标识物具有相同的色谱和质谱特征，通过比较定量肽段和内标肽段的绝对丰度，实现复杂样品中目标蛋白质的定量检测㊂Ｓｃｈｉｅｌｔｚ等［４９］采用ＡＱＵＡ方法和酶解质谱策略，对１８种不同产地植物蓖麻子中的蓖麻毒素和ＲＣＡ１２０进行定量检测，该研究揭示了不同产地蓖麻子中两种Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的含量差异信息㊂ＭｃＧｒａｔｈ等［４６］以同位素内标肽段建立了饮用水㊁牛奶㊁果汁等食源性基质中蓖麻毒素的免疫捕获⁃酶解质谱定量检测方法，线性范围在１０１００００ｆｍｏｌ／ｍＬ㊂２０１７年，Ｈａｎｓｂａｕｅｒ等［１８］应用胰蛋白酶解结合液质检测不同亚型相思子毒素肽段标志物，首次实现了不同亚型相思子毒素和相思子总蛋白的定量检测㊂㊀㊀ＡＱＵＡ定量方法虽然显著提高了复杂样品中目标蛋白质的定量准确度，但是由于内标肽段无法兼容复杂样品的前处理程序，只能在样品制备后加入内标，导致定量结果仍然存在偏差㊂针对以上问题，科学家［５５，５６］提出了以稳定同位素标记的蛋白质为内标的蛋白质内标绝对定量（ｐｒｏｔｅｉｎｓｔａｎｄａｒｄａｂｓｏｌｕｔｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＰＳＡＱ）策略㊂基于无细胞快速表达系统，在体外表达合成稳定同位素标记的内标蛋白质，由于ＰＳＡＱ内标与目标蛋白质具有相近的生化性质，因此可以在分析的最初阶段将蛋白质标样加入样品中，在样品制备及酶解过程中发生的蛋白质损失将不会影响蛋白质定量的准确性㊂Ｄｕｐｒé等［５７］使用单链ＰＳＡＱ内标标记法结合Ｑ⁃Ｏｒｂｉｔｒａｐ高分辨质谱定量研究体液㊁食品等复杂基质中的蓖麻毒素Ａ链㊁金黄葡萄球菌毒素Ｂ和产气荚膜梭菌毒素（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）３种毒素，检出限均达到１ｎｇ／ｍＬ㊂该方法的主要是缺点是ＰＳＡＱ内标的合成制备难度大㊁成本高昂，仅适用于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素单链的定量检测㊂全毒素内标的设计与制备，将是实现Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素绝对定量检测的关键，然而，目前应用无细胞体外表达和细胞表达技术均未实现具链间二硫键的Ⅱ型ＲＩＰｓ全蛋白毒素同位素内标的生物合成㊂２．３㊀毒性活性的体外检测㊀㊀免疫分析法和酶解质谱法成功应用于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的定性定量检测，但无法鉴定毒素是否还保持毒性㊂Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的活性鉴定在反应机理评估㊁酶学性质研究㊁寻找抑制剂以及毒素的检测诊断等方面具有重要意义㊂由于该类毒素的高度敏感性，禁止化学武器组织在核查分析中，不仅要求对其进行定性定量检测，同时还要求对其活性进行准确表征㊂目前，对于Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的活性鉴定一般选择脱嘌呤活性的间接测定法和细胞毒性测定法㊂２．３．１㊀脱嘌呤活性体外检测㊀㊀１９８７年Ｅｎｄｏ等［５８］开发的苯胺裂解测定法是最早用于检测Ⅱ型ＲＩＰｓ毒素的脱嘌呤活性的分析方法；结果表明，２８ＳｒＲＮＡ经Ⅱ型ＲＩＰｓ处理后迁移㊃７６２㊃。

蓖麻中毒与检测方法的研究进展常春;焦媛媛;方琪;傅强【摘要】Objective To provide a reference for further research of ricinine and ricin s rapid detection and their application in the medical field. Methods Papers, monographs, etc. published in recent years on the extraction and detection of the ricinine and ricin were reviewed and analyzed retrospectively. Results This paper briefly reviewed the physico chemical properties of ricinine and ri cin which are the toxic factors of castor, and methods for their extraction, purification and detection. Conclusion It is quite necessa ry to establish a rapid and effective detection method for ricin poisoning rescue.%目的为进一步研究蓖麻中毒性成分的快检方法及在医药领域中的应用提供参考.方法查阅近年来公开发表的论文、专著等资料,对蓖麻碱和蓖麻毒蛋白的提取检测进行概述.结果明确了蓖麻中毒性成分蓖麻碱和蓖麻毒蛋白的理化性质及提取、纯化方法,总结了这2种毒性物质的提取、分离和检测方法.结论建立快速有效的检测鉴定方法对蓖麻中毒的解救是十分必要的.【期刊名称】《西北药学杂志》【年(卷),期】2012(027)004【总页数】4页(P394-397)【关键词】蓖麻碱;蓖麻毒蛋白;蓖麻中毒;提取;检测【作者】常春;焦媛媛;方琪;傅强【作者单位】西安交通大学医学院药学系,西安,710061;西安交通大学医学院药学系,西安,710061;西安交通大学医学院药学系,西安,710061;西安交通大学医学院药学系,西安,710061【正文语种】中文【中图分类】R282蓖麻（castor）为大戟科蓖麻属栽培种（Euphorbiaceae ricinus Communis L．），为一年或多年生草本植物，其根、茎、叶、果实在有关行业或领域均有相应的应用。

蓖麻毒蛋白的提取及应用研究熊冬梅;苏小军;熊兴耀【摘要】蓖麻毒蛋白是具有强烈细胞毒性的天然毒素之一,其毒性作用在生物农药、医学抗癌、细胞内转运机理研究、生物防恐等方面得到广泛的应用.简述了蓖麻毒蛋白的性质、结构及作用机理,并对蓖麻毒蛋白不同提取方法进行了比较,对其应用研究进行了介绍.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2013(030)012【总页数】4页(P59-62)【关键词】蓖麻毒蛋白;毒性机理;提取;应用【作者】熊冬梅;苏小军;熊兴耀【作者单位】湖南农业大学湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室,湖南长沙410128;湖南农业大学湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室,湖南长沙410128;湖南农业大学湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室,湖南长沙410128;中国农科院蔬菜花卉研究所,北京100081【正文语种】中文【中图分类】R284.2蓖麻毒蛋白来源于大戟科植物蓖麻，在蓖麻籽中的含量为1%～5%［1］。

蓖麻毒蛋白由两条肽链组成，属于二型核糖体失活蛋白，具有天然植物毒素典型的半毒素结构及强烈的细胞毒性，从而造就了蓖麻毒蛋白的双面性，一方面赋予它在医学抗癌、生物农药、细胞内转运机理研究等方面的潜在作用和优势；另一方面因难以察觉且快速致命的强烈毒性使其成为恐怖袭击者的武器，威胁人类生命安全。

随着蓖麻毒蛋白在医学、农业、军事防控等领域应用的拓展，研究者们对高纯度、高活性的蓖麻毒蛋白的需求进一步增多，因此获得高效提取蓖麻毒蛋白的方法具有重要意义。

1 蓖麻毒蛋白的性质、结构及作用机理蓖麻毒蛋白为无味白色粉末或结晶型固体，不溶于有机溶剂，易溶于稀酸或盐类水溶液，能在饱和硫酸铵溶液中沉淀析出，对热、酸、碱比较稳定，干热处理不易变性［2］。

蓖麻毒蛋白是由效应链RTA和结合链RTB经二硫键结合而成的异源二聚体植物蛋白毒素，RTA由263个氨基酸残基组成，分子量32 000；RTB由259个氨基酸残基组成，分子量34 000。

蓖麻毒蛋白的分离纯化和毒理作用研究
曾佑炜;宋光泉;彭永宏;徐杰;梁关生
【期刊名称】《中国农学通报》
【年(卷),期】2004(20)4
【摘要】经(NH4)2SO4沉淀,分子筛层析和亲和层析等处理,从去壳蓖麻籽中分离纯化得到蓖麻毒蛋白,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈32kDa和34kDa两条蛋白带,证明该蓖麻毒蛋白已被纯化至均一。

用等电聚焦法测出该蓖麻毒蛋白的等电点为pI6.1和pI6.7。

高效液相色谱测出该蓖麻毒蛋白在非变性条件下有五个峰,表明蓖麻毒蛋白可能存在五个不同的多聚态。

动物实验表明该蓖麻毒蛋白对小白鼠有较强的毒性,但对斜纹夜蛾幼虫无毒杀作用。

【总页数】4页(P23-25)
【关键词】蓖麻毒蛋白;分离;纯化;毒理作用;亚基组成;等电点;高效液相色谱;杀虫剂【作者】曾佑炜;宋光泉;彭永宏;徐杰;梁关生
【作者单位】广东轻式职业技术学院食品与生物工程系;华南师范大学生命科学学院广东省植物发育生物工程重点实验室;仲恺农业技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】S482.39
【相关文献】
1.蓖麻毒蛋白的分离纯化及其对南方根结线虫杀灭效果的研究 [J], 金汝城;贾超;杨晓华;谭玉玲;侯楠楠
2.平颏海蛇神经毒组分ⅩⅢ的分离纯化及毒理的初步研究 [J], 梁京生;吴秀荣
3.蓖麻毒蛋白分离纯化及小鼠腹腔注射半致死量研究 [J], 苏雅拉图;黄凤兰;陈宇杰;杨文军;王立异;冯景涛
4.姬松茸发酵液多糖的分离纯化及其抗疲劳作用研究 [J], 黎轶
5.毛蚶抗癌蛋白主要组分的分离纯化及作用研究 [J], 梁桓熙;王子依;李晶哲;马琰岩;刘长振;孙震晓
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

蓖麻毒蛋白免疫毒素的制备及其体外靶向抗肿瘤效应陈海霞，陈祥胜△，黄婧，祝香芝（湖北中医药大学，湖北武汉 430065）[摘要] 目的制备蓖麻毒蛋白（Ricin）A链（RTA）与转铁蛋白受体（TFR/CD71）mAb偶联的免疫毒素（IT），并考察其体外靶向抗肿瘤活性。

方法以蓖麻子为原料，提纯RTA，在偶联剂N-琥珀酰胺-3-（2-吡啶二硫）丙酸酯（SPDP）的作用下，构建IT；并以间接ELISA法检测IT的免疫反应性，以CCK-8法测定并比较IT在体外对人肝癌SMMC-7721细胞和正常肝细胞LO2的细胞毒效应。

结果 SPDP偶联法制备的IT对肿瘤细胞的免疫反应性无明显变化，体外实验结果显示，各浓度IT 对SMMC-7721细胞的杀伤作用较LO2细胞差异具有统计学意义（P＜0.05）。

结论 CD71 mAb-RTA免疫反应性稳定，对肿瘤和正常体细胞的体外细胞毒效应差异明显，提示其对肿瘤细胞有较好的靶向杀伤作用，有望开发成为肿瘤的靶向治疗药物。

[关键词]免疫毒素；蓖麻毒蛋白；CD71；恶性肿瘤；靶向治疗[中图分类号] R735.7 [文献标识码] APreparation of Ricin immunotoxin and studying its targeted therapyanti-tumor effect in vitroCHEN Hai-xia, CHEN Xiang-sheng△, HUANG Jing, ZHU Xiang-zhi(Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430065, China)[Abstract]Objective To prepare the immune toxin (IT) of Ricin A chain (RTA) and transferrin receptor (TFR/CD71) mAb coupling, and to investigate the anti-tumor activity in vitro. Methods IT was constructed by using castor beans as raw materials, purified RTA, under the action of the coupling agent N - succinamide-3-(2-pyridine disulfide) propionate (SPDP). In order to detect the immune reactivity of IT in the indirect ELISA method, the cck-8 method was used to determine and compare the cytotoxic effects of IT in vitro for human liver cancer cell SMMC -7721 and normal hepatocellular LO2. Results SPDP coupling method of IT there was no significant alteration of the immune response to tumor cells, in vitro experimental results showed that the concentration IT on LO2 cells SMMC-7721 cell killing effect significantly enhanced (P＜0.05). Conclusion CD71 mAb - RTA immune reactivity is stable, and there was obvious difference betweem the tumor and normal cells in vitro cytotoxic effect. It has better targeted killing effect on tumor cells,and is expected to develop into tumor targeted therapy drugs.[Keywords] immunotoxin; Ricin; CD71; malignant tumor; targeted therapy资助项目：湖北省卫计委资助项目（WJ2015MB132）；湖北省教育厅科研项目（B2013129）作者简介：陈海霞，女，硕士，主管中药師，研究方向：药物，E-mail：598121112@；陈祥胜，通信作者，男，硕士，副教授，研究方向：生物药物，E-mail：515887025@。

蓖麻毒蛋白的提取及分析第18卷,第4期2001年7月光谱实验室ChineseJournalofSpectroscopyLaboratoryVo1.18,No.4July,2001蓖麻毒蛋白的提取及分析高宝岩?(天津师范大学化学与生盎科学学院天津甫卫章路241号300074)摘要本文报道了蓖麻毒蛋白的提取和分析,采用琼脂糖(Sepherose4B)分离和纯化,研究了高效蔽相色谱法同时测定蓖麻毒蛋白和蓖麻碱,结果令人满意.关键词蓖麻毒蛋白,蓖麻碱,高效液相色谱仪,琼脂错.中图分类号:0657.72文献标识码:B文章编号:]004—8138(200])04.0429—03 1前言蓖麻是一种重要的经济作物,蓖麻籽是蓖麻成熟的果实,含有45左右的油,其油可作为重要的化工原料,生产高级润滑油,油漆,表面话性剂等.脱脂后的饼粕含有35N左右的蛋白质,但其中含有少量蓖麻毒素,使这部分蛋白质的利用受到限制,如能将蓖麻毒素除去,则可成为饲料工业中蛋白质的重要来源.蓖麻毒蛋白就毒性而言对蛋白质的利用有害,但又可用于研制对肿瘤细胞具有强烈杀伤导向药物,这又使蓖麻毒蛋白找到用武之地,也将使蓖麻这种重要的经济作物得到充分综合利用.然而,所有这些重要的应用离不开对蓖麻毒素的分析.蓖麻毒素主要包括蓖麻毒蛋白,蓖麻碱,过敏性物质.其中蓖麻毒蛋白属于剧毒,蓖麻碱属于中等毒性生物碱,过敏性物质毒性较小,因此对毒素的测定主要着眼于前两种.蓖麻毒素分析目前尚缺乏简单,快速,准确的定量分析方法.通用的方法仅达目视比较半定量分析”,还不适用于工业化规模的产品控制分析,更缺乏同时检出能力.为此,我们研究了使用高效液相色谱法同时测定蓖麻毒蛋白和蓖麻碱,效果令人满意.2实验部分2.1仪器与试剂LC一6A高效液相色谱议(日本岛津公司);超速离心机(美国贝克曼公司),食品粉碎机(天津).乙腈(色谱纯),醋酸(分析纯)~NaAc(分析纯);NaCI(分析纯);D一半乳糖(分析纯);亚沸重蒸蒸馏水;Sepharose4B(购自天津华美分公司).2.2蓖麻毒蛋白的纯化2.2.1粗蓖麻毒蛋白的提取适量去壳蓖麻籽和石油醚加人到食品粉碎机中进行粉碎脱脂,过滤除去石油醚,用乙醚洗涤滤饼,所得脱脂蓖麻粉置于用醋酸调整pH=3.8的醋酸水溶液中浸取12h,所得上清液对蒸馏水透析?联系人,电话:(0Z2)24452577(宅),(022)23540284(办)作者简介:高~(1942--)?男,天律甫人.天津师范大学副教授,从事仪器分析教学和研究工作收稿日期;Z000-12-05光谱宴验室第18卷24h,然后对pH一6.5磷酸缓冲溶液透析24h,透析液经25000r/rain超速离心30rain,上清液为蓖麻毒蛋白粗提液.2.2.2蓖麻毒蛋白的枉层析分离纯化蓖麻毒蛋白粗提液的纯化参考文献[2]进行.50mL酸式滴定管内装Sepharose4B,用10mIla_o|/LpH6.5的磷酸缓冲溶液平衡,然后将粗毒蛋白溶液柱头进样,以0.25m[/rain流速缓缓流过层析柱,再用10mmol/LpH6.5的磷酸缓冲溶液洗脱杂蛋白,洗尽杂蛋白的层析柱用lOmmol/IpH5.0HAc—NaAc缓冲溶液再次平衡,然后用含0.2mol/LD-半乳糖pH5.0HAc—NaAc缓冲溶液洗脱毒蛋白.每5mL收集一个试管,随时用紫外光谱仪测定吸光度,以吸光度对体积作出毒蛋白流出曲线,当洗尽毒蛋白后在洗脱液中再加入NaCI,使之浓度达0.14mmol/LNaCI,可洗脱出血凝集素2.3蓖麻碱的提取蓖麻碱的提取按文献[33进行.2.4高效液相色谱分析色谱条件色谱柱150×4.6mm,5m键合c.固定相,水,乙腈混合流动相,流速lmL/min,紫外检测器测定渡长280nm.3结果与讨论3.1纯化蓖麻毒蛋白流出曲线被亲和吸附在Sepharose4B层析柱上蓖麻毒蛋白用台0.Zmol/LD-半乳糖,lOmmol/LpH5.0HAc—NaAc缓冲溶液洗脱,流出曲线见图1中峰,洗尽毒蛋白后在洗脱液中加入NaCI,使含0.14mmol/LNaCI的洗脱液洗脱出血凝集素,见图1中6峰.3.2高效液相色谱分析结果纯化毒蛋白进样液相色谱流出曲线见图2中,纯化血凝集素进样液相色谱流出曲线见图图1sephrose4B层析柱上蓖麻毒蛋白和血凝集紊流出曲线2中b,毒蛋白粗提液进样液相色谱流出曲线见图2中c,蓖麻碱进样液相色谱流出曲线见图2中d.3.3讨论从图1中可以看出,毒蛋白粗提液经琼脂糖Sepharose4B分离可得纯品.经高效液相色谱分析(见图2中n),可以看出该流出曲线只有一个峰(保留时间I.97rnin),将图l6所分离的血凝集素进样也只流出一个单峰(见图2中6),保留时间1.446min.说明毒蛋白粗提液经Sepharose4B层析柱分离相当完全将毒蛋白粗提液直接进样(见图2中c)则出三个峰,分别是血凝集素,杂蛋白,蓖麻毒蛋白(保留值分别是?1996t21(4)-22一蹦-[.]张振华.应文斌,王庚诚.用琼脂糖亲和层析一步纯化蓖麻毒蛋白[刀.生轴化学,1989?5(6)486—490[3]高宝岩.霍建中,等蓖麻碱的提取及光谱研究[刀.克谱彝赣主?2000,17(i)8B一9O-ExtractionandAnalysisofRicinO203.0GAOBao-Yan(CollegeofCh~istryamtLif.Seienc~?Tianfinl~ormalUnivers~y,No-1Weijkalu’Ti~jin300074,PR?C/u’~)AbsttactWereportthemethodofextrationandanalysisofriein.Rieinwasbeenseparated andpurificatedbysepharose4B.Rieinandricinineweredeterminedsimultaneouslybyhighperf ormanceliquidchr0matography(HPLC)wjthsatisfactoryresults.KeywordsRicin,Ricinine,HighPerformanceLiquidChr0matogfaphy,Sepharose 4B.欢迎使用电子信箱为缩短出版周期,作者向本刊投稿.可将论文以纯文本文件(即后缀为TXT的文件),Word文件,北大方正小样文件等形式同时发送到如下5个电子信箱:(1)gpsysh@public.sti.a’cI(2)gpsys@f(3)gpsys81@’(4)gpss@.c;(5)gpsys81@hotmail-co rn?为避免电子邮件发生故障而延误收稿,请作者发了电子邮件后,要打电话通知编辑部?以便及时查询,电话(010)62183031.’光碍实验室)蝙辑部。

蓖麻毒素1 蓖麻毒素1．1 蓖麻毒素是一种有害物质蓖麻毒素(Ricin)系指蓖麻毒蛋白、蓖麻碱、蓖麻变应原和血球凝集素四种毒性物质，其中蓖麻毒蛋白的毒性最大。

在药物研究中，蓖麻毒蛋白又称蓖麻毒素。

在英语中蓖麻毒素和蓖麻毒蛋白是同一词一“Ricin”。

蓖麻毒素对人和哺乳动物有剧毒，几乎对所有真核细胞都有毒性。

一个毒素分子进入细胞内，就足以使整个细胞的蛋白质合成完全停止而死亡。

1．1．1 蓖麻毒蛋白(Ricin) 最早是在1887年由Dixson从蓖麻籽中分离出来的，它是由全毒素、毒类素、凝集素三种物质组成的蛋白质。

并由数种不同类型的高分子蛋白质组成，其分子量64 000左右，也有报道为36 000～85 000。

目前已发现的结晶型有BI型、TL型、cI型、D型，其中以D型毒性最强。

蓖麻毒蛋白由A、B两个肽链以二硫键共价相连接，其A链在B链的协助下，容易穿过细胞膜破坏核蛋白体60S亚单位，抑制蛋白质的合成，致使细胞死亡。

蓖麻毒素的一级结构表明，A链由263个氨基酸残基组成，分子量32 000，是活性链，第10个残基Asn已糖基化，接有(Glc Nac)，(Man) 寡糖链。

A链中只有两个LY残基，一个位于N端第四位，一个位于C端附近，对A链的毒性作用至关重要。

B链是由259个氨基酸残基组成的序列，含有两个寡糖链(Glc Nac) (Man) 和(Glc Nac)：(Man) ，分别与第93位和第133位上两个Asn残基相连，分子量34 000 不同的蓖麻及其变种的毒蛋白的氨基酸序列不完全相同。

蓖麻毒蛋白为白色粉末或结晶型固体，无味，不溶于乙醇、乙醚、氯仿、甲苯等有机溶剂，溶于酸性稀释液或盐类水溶液，在饱和的硫酸铵溶液中能沉淀析出。

在沸水中或加压蒸汽处理即凝固变性，失去毒性，但在干热的情况下变性很难蓖麻毒蛋白在蓖麻籽中含量为0．5％～4．5％，也有含量为0．5％～15％的报道，在蓖麻的根、茎、叶中也有一定含量。

蓖麻毒素的分离提取及活性研究本研究以蓖麻毒素灭鼠为目的，以小白鼠活性实验为筛选指标，研究了从蓖麻种子中分离蓖麻毒蛋白的方法，实现了对蓖麻毒素的最优提取，并利用得到的蓖麻籽粗提物对小白鼠进行灭鼠试验，来模拟高原鼠兔的灭鼠效果评价。

最终在野外大面积应用实验中，取得了比较满意的效果。

以蓖麻籽为原料，通过选用不同物质做浸提剂，单独研究了各种浸提剂对蓖麻毒素的最佳提取方法，在综合对各浸提剂在其最佳提取条件下的提取蓖麻毒素的效果后，最终确定，0.2mol／L的磷酸缓冲液在对去皮蓖麻籽的质量体积比为1：3（g／ml）时，浸提24小时后，所得混合物4000rpm离心30min，小心除去油脂，以及离心所剩的渣滓，保留清液，在清液中加入（NH₄）₂SO₄盐析剂到80％饱和度，盐析24小时，10000rpm 离心30min，再经透析，真空干燥后所得蓖麻毒素（粗毒）产率最高，同时该提取方法还兼顾到蛋白的稳定性及整个提取流程的经济性，正是要寻找的最佳工艺路线。

应用提取出的蓖麻毒素（粗毒）对小白鼠做活性实验，结果表明，蓖麻毒素对小鼠腹腔注射的LD₅₀为7.971ug／kg，其主要药效成分为蓖麻毒素。

蓖麻毒素使小白鼠中毒后无明显异常反应，不容易造成拒食现象，能够提高灭鼠效率。

而小白鼠从腹腔注射后30h开始出现死亡，直到96h后均有死亡，说明本毒饵是高效、慢性灭鼠剂。

针对川西北高原的主要害鼠—高原鼠兔，应用蓖麻毒素灭鼠剂进行了野外防治实验，在大面积实验中，该粗毒以1％浓度配制毒饵对高原鼠兔的校正灭效为85％以上。

小区实验的灭效在90％左右。

通过连续半个月的观察，未发现鹰等天敌出现二次中毒现象，对受试绵羊也无明显影响，禁牧期后，未发现对牲畜造成危害。