抗氧化实验方法

【最新整理，下载后即可编辑】3.2.5 体外抗氧化实验发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。

（1）对超氧阴离子的清除作用 利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。

取50 mmol·L -1的Tris-HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。

以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：()%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (1)式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10 mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10 mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。

注意事项：1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。

2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。

3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。

4、 测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。

（2）对DPPH ·的清除作用DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。

本公司石墨品抗氧化实验报告（方法2）1、前言碳材料在400℃氧化气氛中开始氧化使得碳材料的力学性能明显下降，所以碳材料在高温下的应用受到一定的限制，如何把在高温下氧化的碳材料与氧化环境隔离是解决碳材料氧化的重要任务也是增加碳材料使用寿命和扩大运用范围的关键，通常提高碳材料抗氧化能力的方法有两种：一种是基体改性法，向碳材料中添加抗氧化剂在碳材料中生成某些类似熔融玻璃的物质而在碳材料表面堵塞或阻隔氧气的浸入；另一种就是涂层法，采用耐高温氧化涂层来保护碳材料表面，减少碳材料与氧气发生反应的面积和几率从而达到抗氧化目的。

技术中心用的是实验方法一：基体改性法（浸渍法）2、实验2.1实验目的：提高碳材料抗氧化性2.2实验材料：1、二化品2 、三聚磷酸钠 3、纯净水 4、四聚磷酸钾5、三氧化二铝6、二氧化钛7、氧化镁8、柠檬酸2.3实验用设备：1、天平2、恒温干燥箱（300℃）3、箱式电阻炉（1000℃）4、烧杯5、玻璃棒2.4实验用浸渍剂：35%三聚磷酸钠、30%四聚磷酸钾、20%三氧化二铝、10%二氧化钛、5%氧化镁混合2小时，将混合粉熔于70℃左右清水中，其粉料占液体总重的20%左右，搅拌10分钟加入1.5%的柠檬酸继续搅拌20分钟制的浸渍剂。

2.5浸渍工艺：用蒸馏水清洗试样三次→将试样加热130℃烘干后称重→将试样再次加热至300℃趁热放入装有浸渍液的烧杯中3小时→将浸渍后的试样加热至130℃烘干称重→将试样加热至500℃排除挥发份。

3、试样失重测试：（表1）常温未浸试样理化指标（表2）试样1 一浸后理化指标（表3）试样1 二浸后理化指标一浸后重（g ） 86.7 增重率（g ） 4.96 体密（g/cm3）1.913气孔率（%）19.98度下做氧化失重实验。

试样1（浸渍） 与试样2（未浸渍）对比照（表4）900℃试验氧化失重后数据 单位：克时间试样3h6h9h12h15h试样1（浸渍） 75 62.2 53.5 42 32.8 试样2（未浸渍）6956.747.335.326.5试样1（浸后照）试样2（未浸照）试样1（浸渍） 与试样2（未浸渍）焙烧后对比照4、实验过程和结果描述：4.1、实验的过程描述：在制作浸渍液体配比时液体呈大白色状态，按照浸渍工艺执行将样品放入盛有件液体的烧杯中液体大约在10秒左右浸渍剂沸腾并伴有刺鼻的气味，待浸渍好的样品放入烘箱中烘干，样品表面有一层白色的物质没有全部覆盖整个样品表面，在做氧化失重的过程中发现，非浸渍的样品表面不断的氧化并伴有粉末脱落随着时间的加长而增多一直到实验结束。

1还原力的测定之羊若含玉创作样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混杂液中.混杂物在50℃保温20min，然后在反响混杂物中参加2ml 10%的TCA，混杂后以3000rpm离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反响试管中反响，10min后测定其在700nm处的吸光值.吸光值越大标明还原力越强.注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变更，例如2.5，5之类变更.但具体情况应依据吸光值大小而定.0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表.铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中.比色皿的用法：可见光(>400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）.2 DPPH自由基清除活性的测定将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混杂，振荡，在室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）.清除率盘算公式为：空白为1.5 ml 95%的乙醇参加1.5 ml蒸馏水调零.式中：Ac——对比为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值；Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值；注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变更，如0.5,1,2,2.5之类变更，但是具体情况应视清除率而定，最终成果应有清除率大于50%和小于50%的情况.DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操纵.并且DPPH试剂很昂贵，用时注意勤俭.0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml.3 在卵黄磷脂体系中抗氧化才能的测定以卵黄脂蛋白为底物的LPO模子反响体系包含:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS 配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL.对比管除不加样液外其他试剂同前.将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温造就1h.取出后，参加20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对比管于3500r/min离心10min，取2.0mL上清液，分离参加质量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，加塞于100℃水浴15min，取出冷却.空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率暗示为:SA(%)=(Ac一AS)/AC×100式中:Ac一不加样品的吸光度As一参加样品的吸光度注意：卵黄溶液不必时应放置冰箱保管.酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调剂，但具体应视清除率大小而定，对酶解液蛋白浓度进行调剂.硫代巴比妥酸溶液需放置于棕色瓶内保管.并以50m mol/L NaOH溶液配制.再在50℃水浴溶解.FeSO4溶液应以棕色瓶盛装.4 过氧化值的测定参照本食品学院林华娟等先生主编的食品剖析实验课本一书.5 超氧阴离子自由基清除率的测定邻苯三酚自氧化速率（V对比）：对比组和空白对比组参加4ml 蒸馏水（去离子水）和，0.1 mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2) 4.5ml，在25℃水浴20min后，样品组参加0.2ml （或0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空白组以相同体积蒸馏水（去离子水）代替.震匀后立时在320nm处测定吸光值.迅速混匀并开端计时，每隔30 s读取吸光值,4 min后停止，以空白对比管调零.作吸光度随时间变更的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V对比.（V对比在0.05A/min~0.065A/min之间，不然应调剂邻苯三酚参加量）样品自氧化速率（V样品）：样品组和空白组均参加一定浓度的样品溶液4ml，0.1 mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2) 4.5ml，在25℃水浴20min后，样品组参加0.2ml （或0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空白组以相同体积蒸馏水（去离子水）代替.震匀后立时在320nm处测定吸光值.迅速混匀并开端计时，每隔30 s读取吸光值,4 min后停止，以空白管调零.作吸光度随时间变更的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V样品，按下式盘算样品对超氧阴离子的抑制率：式中：抑制率(%)=(V对比-V样品)/V对比×100V对比－对比组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)V样品－样品组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)动物实验资料：摘自鹰嘴豆:抗氧化剂的抗氧化效果受到多种因素的影响，只有在生物体内具有抗氧化作用的物质才干有效的清除体内产生的自由基，才干表示出一定的生物活性.由于体外抗氧化测定办法容易操纵，周期短，因此评价一种物质的抗氧化效果往往首先采取体外抗氧化体系.但体外抗氧化体系往往与人体内的生理情况相差太大，许多研究成果标明采取体外办法评价有效的抗氧化剂进入人体后却表示不出应有的抗氧化效果，因此抗氧化剂的抗氧化效果在采取体外办法进行初步评价后应采取动物实验进行体内评价.人体在正常生理代谢进程中会产生少量的含氧自由基，如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等，这些自由基通过自然存在于体内的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶及抗氧化剂如抗坏血酸、维生素E组成的抗氧化系统来消除.因此，在正常状态下，体内自由基维持在一定水平并处于动态平衡中，正常量的自由基对细胞的生长、决裂、解毒等具有有益的作用，在杀菌、免疫调节等方面具有积极而重要的意义.然而，随着增龄或在某些病理状态下以及机体受到创伤时，体内抗氧化酶活性下降，从而导致机体代谢异常而骤然产生大量活性氧自由基；或由于机体抗氧化物质缺乏，使促氧化剂与抗氧化剂之间的平衡失常，致使自由基与机的一些生物大分子，如蛋白质、核酸、脂质等产生反响，生成大量氧化物或过氧化物，并进一步引起细胞死亡和组织损伤.业已证明，氧化损伤与衰老、肿瘤、糖尿病、动脉硬化、神经退行性病变以及人类免疫缺陷病毒(HIV)沾染等均有亲密关系.D-半乳糖诱导的亚急性衰老模子是依照衰老的代谢学说树立的，其机制与糖代谢紊乱[6]、D-半乳糖醇中毒[7]和活性氧自由基多余有关；众多研究标明是生物体内含有半乳糖氧化酶，在催化D-半乳糖时可产生超氧阴离子自由基(O2·-)和H2O2；如果长期人为地赐与过量D-半乳糖，使机体和细胞内自由基产生过量，除了造成组织细胞直接损伤外，还导致抗氧化酶活气下降和过氧化产品积聚，从而表示出与人类自然衰老相似的生化变更、免疫功效低下、基因表达与调控异常细胞滋生力下降及细胞退化性衰变等.有研究标明，D-半乳糖可下降人胚肺二倍体成纤维细胞(HBS)，从而使该细胞SOD活气下降和过氧化产品MDA增多，从而起到加快细胞老化的作用.本文在前述章节已经标明，鹰嘴豆蛋白酶解物具有体外抗氧化活性，但其在生物体内的作用效果尚不清楚.为此本章采取D-半乳糖诱导致衰老少鼠作为模子，分离以小鼠的血清、肝脏和心脏组织中的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性作为评价指标，探讨鹰嘴豆蛋白酶解物在生物体内的作用，为揭示鹰嘴豆蛋白酶解物对体内过氧化状态的影响，明确其物质基本和相关机制提供证据.。

附录抗衰老实验实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl 缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。

因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。

抑制率可根据下式计算：式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率二实验仪器和试剂：1 主要仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。

2 主要试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。

三试剂配制：1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。

2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。

3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。

4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。

现配现用，4h内有效。

四实验方法：1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min；2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min；3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。