分子生物学实验常见问题分析及对策
一、各种常见PCR
1.PCR反应扩不出条带，出现假阴性，可能原因：
（1）模版：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，且含量低；Buffer 对样品不合适；引物设计不当或者发生降解；模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
（2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（4）Mg2+浓度：
Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
（5）物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR
失败的原因之一。解决方案：纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量；更换Buffer或调整浓度；重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物；降低退火温度、延长延伸时间。
2 出现假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带不一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR 扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引
物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.非特异性扩增
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其可能原因：引物特异性差，引物形成二聚体；模板或引物浓度过高；酶量过多；Mg2+浓度偏高；退火温度偏低；循环次数过多。解决方案：重新设计引物或者使用巢式PCR；适当降低模板或引物浓度；适当减少酶量；降低镁离子浓度；适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)，减少循环次数。
4.出现片状拖带或抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，模板不纯；Buffer不合适；dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。解决方案：纯化模板；更换Buffer；适当提高退火温度；适量用酶；适当降低dNTP和镁离子的浓度；减少循环次数。
二、电泳
1.DNA带模糊
可能存在的原因和解决方法：
1)电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，故需经常更换电泳缓冲液。
2)所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA 链电泳，温度应＜15℃，同时核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
3)DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。
4)DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
5)有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。
6)DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
7)DNA降解：应避免核酸酶污染。
2.不规则DNA带迁移
可能存在的原因和解决方法：
1)对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。
2)电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液。
3)DNA变性：出现不规则DNA带迁移可能是由于DNA变性引起的。当缓冲液电导很高并产热时，可能会导致DNA变性。选择合适的缓冲液可以解决这个问题，此外，以20mM NaCl缓冲液稀释DNA，电泳前勿加热。也可以缓解这一问题。
3.带弱或无DNA带
可能存在的原因和解决方法：
1)DNA的上样量不够：增加DNA的上样量，但聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。
2)DNA降解：应避免DNA的核酸酶污染。
3)样品分子量不在胶允许范围内。建议另外配置合适的胶。
4)提取不干净或缓冲液有问题。
5)DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
6)对于EB染色的DNA，所用光源不合适：应用短波长（254nm）的紫外光源。
7) 对于提取的质粒跑电泳，可能菌的问题，菌种是否正确，有没有确信加了抗生素，质粒拷贝数高不高，菌量够不够然后提取的时候，试剂盒牌子质量过不过硬，有没有过期，裂解是不是完全，会不会SDS或者高盐都结晶沉淀了，所有溶液有没有加错，比如说柱分离，漂洗液里面有没有确信加了酒精，洗脱时候洗脱液假如用的是纯水，有没有调过pH值，加的量够不够，有没有完全浸润硅胶膜。
4.DNA带缺失
可能存在的原因和解决方法：
1)小DNA带走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
2)分子大小相近的DNA带不易分辨：增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。
3)DNA变性：用20mM NaCl缓冲液稀释DNA，电泳前勿加热。
4)DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适：改在脉冲凝胶电泳上分析。
5.重复性不好
可能存在的原因和解决方法：
1）凝胶制备的不规范：按要求严格操作。
2）凝胶放置过久：聚合时间不能太长或太短，分离胶不过一周，间隔胶当日用。
6.DNA电泳的MARKER带扭曲
可能存在的原因和解决方法：
1）配制胶时的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配制的：最好是同时配制。电泳时缓冲液高过液面1-2mm即可。
2）电泳时电压过高：可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm)，等条带出孔后再调电压。
3）上样时尽量慢慢加样，等样品自然沉降后再加电压。
7. marker条带非常模糊，无法辨别具体条带的原因
（1）marker条带出现了降解。请确保在使用过程中避免核酸酶污染；
（2）电泳缓冲液陈旧。电泳缓冲液多次使用后，离子浓度降低，ph值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液；
（3）电泳条件不合适。电泳时电压应不超过20v/cm，温度应低于30℃；
（4）marker上样量过多。请根据说明书选用合适上样量；
（5）凝胶质量不好。建议使用质量较好的琼脂糖；此外，凝胶凝固不均匀也会导致条带模糊。
8. DNA带相近不易分辨
当DNA的分子大小比较相近时，会在电泳结果中出现DNA带不易分辨的情况。这时可以通过增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度来提高分辨度。
9.做PCR电泳后跑电泳，目的基因是489bp 的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多bp了，有时快到600bp了？为什么？
答：有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker下面去了，后来证实片段没有问题。也有做的一个片段也是这样，是490BP.理论上两个条带一样，可是PCR结果显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。
另外，对于提大肠杆菌质粒后跑琼脂糖凝胶电泳无条带出现？
在确定琼脂糖凝胶电泳无问题的前提下，那应该就是质粒提取有问题。首先看质粒是高拷贝还是低拷贝的质粒，一般低拷贝的质粒5ml的，高拷贝的质粒2-3ml 小剂量提取。量不能过大，否则影响提取。第二点，加入裂解液如SDS-NaOH后，
时间不宜超过5min，因为此步骤的目的是使细胞内物质释放，蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性，时间过长，会导致加入中和裂解液如酸性醋酸钾后，仍无法使质粒DNA复性。导致提取失败。
三、胶回收、纯化
1.切胶的时候如何能切的准？条带的位置肉眼很难判断出来，如何判断条带的位置？
可以将产物与Marker一起电泳，染色后，在紫外灯下观察结果，跟Marker进行相比，就知道要的是哪条带。注意，紫外灯下切胶速度要快，否则DNA会降解，另外，紫外线对身体伤害很大，特别是眼睛，请注意采取保护措施（比如在专门的箱子里切，带眼镜等）。RNA 用具要用10%的NaOH浸泡过液，再用DEPC水冲洗干净70%的乙醇用过国产分析乙醇有杂质，RNA酶还会有，并带入其它污染。
2.凝胶回收DNA实验的关键在哪里?
最关键的是切胶之后，溶胶的那一步。切胶的时候要尽量把多余的琼脂糖凝胶切干净，按照实验步骤，第一步应该是将胶充分的溶化。这以后步一定要做充分，保证凝胶已经完全溶解了。加乙醇这步也很关键，当凝胶溶解后最好多过几次柱子。还有就是洗脱的那一步。洗脱的时候最好用加热到60度的洗脱液洗脱，如果实在效果不好可以分两次洗脱。
3.跑完PCR，暂时不方便胶回收，条带已经切下来放到EP 管里了，能保存么？割下来的胶放在-20℃保存两个星期完全没有问题。切下来的胶放在4℃冰箱中4-5小时没有问题，回收的效果也很好。
4. 回收得片段为什么电泳上样会漂起来？
主要问题是纯化过程中的乙醇没有除干净。
注：DNA回收中常出现的问题
5.利用凝胶回收试剂盒
DNA回收效率较低或者未回收到目的片断？
可能存在的原因和解决方法：
1)胶块未完全溶解：可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解。
2)胶块体积太大，应使用枪头捣碎，还不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收；
3)紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制在30s
以内；
4)电泳缓冲液pH太高：硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整。
5)漂洗液中未加入无水乙醇。或是洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率；
6)外缘DNA污染：在紫外灯下切下含待回收的DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片。
7)改用去离子水洗脱，但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当提高其pH值，以增加洗脱得率。
8)不可以使用更小的洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书上提供的最小洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。
9）回收前的样品量太少，加大点样量；
10）TAE或TBE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH值升高，降低DNA
和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好；
11）洗脱前，预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有
效提高回收率30%以上。
6.DNA回收时，琼脂糖凝胶胶块不溶，如何处理？
可能存在的原因和解决方法：
1)琼脂糖质量不好。
2)含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水、干燥：切胶后应立即进行回收或保存在4℃或-20℃。
3)制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。建议：将融胶问题提高到60度；可能是胶的浓度太高，需要提高融胶液的体积；融胶过程中每隔一段时间就震荡几下帮助融胶。
7. 如果胶在后续过程发生胶没有彻底融化，如何补救？胶很难融如何处理？答：补加融胶液，将胶悬起来，
50-60℃继续保温至彻底融化。将融胶问题提高到60度；可能是胶的浓度太高，需要提高融胶液的体积；融胶过程中每隔一段时间就震荡几下帮助融胶。
8. 没有回收到DNA片段？
如在洗脱后，发现洗脱液中没有DNA片段，请检查是否按瓶身标签，在洗涤液中加入了无水乙醇。
9. 提取率低？
（1) 融胶液为酸性缓冲液,如融胶后，其pH 值升高将影响提取得率.请加入0.1 倍体积的3M乙酸钾（pH=5.0）。
（2) 长时间使用后没有更换的电泳缓冲液，其pH值较高，将影响DNA 的吸附. 请更换新的电泳缓冲液后，再进行电泳，然后切胶。
（3) 在洗脱前，将洗脱液于30～60℃温浴，可提高提取效率。
10. 如果DNA纯化的得率非常低或根本没有，估计是什么问题？
一点都不能得到产物的回收情况很少见，有些情况是判定回收效率的方式不对。如对，请检查一下Wash中有没有加入酒精；检查加入的DNA结合剂（Solution S 或Solution SN）的量对不对；洗脱前有没有将残留得酒精去彻底；洗脱液有没有使吸附材料充分接触（洗脱），接触的时间是否充分。
11. 用Ez-Resin如果凉干过头，如何处理？
答：加TE，50-60度处理10分钟，间或振荡，离心收集上清。
12. 如何计算提取率？
1) 由于回收前样品中，往往含有非目的DNA 片段，引物，dNTP 等，所以不能
用测回收前后吸光度的的方法计算回收率。
2) 可将回收前后DNA 片段一起电泳，使用凝胶成像系统拍照后，用配套的软件进行电泳条带灰度对比.
3) 注意，电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响，请仔细操作，以减小误差。
13. 如何提高胶回收的得率？
Agarose抑制DNA与吸附材料的结合，将不含DNA片段多余的 Agarose切除，能显著提高回首效率。DNA结合到吸附材料，需要一定浓度的结合剂，Agarose多了，结合剂（Solution SN）的相对浓度就会下降，得率就受到影响。大多数情况下，是由于电泳时琼脂糖的浓度不同，切下的胶块有大有小，得率自然不同。
回收的得率还与回收片段的大小有关。提高结合剂（Solution SN）的相对浓度，增加DNA与吸附材料作用时间（放置时间），控制好离心速度都一定程度上可以提高得率。改善洗脱条件，如提高洗脱溶液的pH值，温度，增加洗脱液的体积等也可以提高得率，但是对于pH过高，可能会影响下游反应，通常情况下采用pH8-8.为宜
14. 纯化过程中乙醇或核酸结合剂（Solution S, SN, B等）不能去除干净，对下游实验有影响吗？
影响非常大。操作过程中有专门除残留乙醇的步骤，不可以省略，否则下游的酶切和连接都可能遇到问题。可以使核酸结合到吸附材料上的吸附剂很多，这些吸附助剂的残留对克隆影响较大。
15. 如何鉴定回收的效果？
电泳比较回收前后的条带强弱。比较时需要将回收的产物全部加到胶中去，具有可比性。如果您的样品难得，可以选无关的片段验证一下。
16. 洗脱DNA用什么洗脱好？
需要根据您回收片段下游用途确定。一般情况下，采用TE或Tris 缓冲液可以。测序反应，请用无菌水洗脱。如果你洗脱的DNA需要长期保存，请用TE洗脱。
17. 什么情况下需要在50-60度的情况洗脱?
如果您十分关心效率，回收的片段为大片段（10kb 左右），单链片段等需要预保温洗脱液。
18. UV方式定量回收的量合适吗？
对于Miniprep,回收的量很少，用UV方式定量不合适，用琼脂糖电泳方式确定。
19. 回收率为什么与点样量和片段大小有关？
DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低；DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。
20. 加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象？
1）胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶；
2）胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收；3）水浴温度是否达到规定温度65℃，用温度计检测。
21. 能否使用去离子水洗脱回收？
可以，但是实验室所用去离子水一般PH值偏低，可用NaOH适当调高PH值＞7.0，以增加回收得率。
22.能否使用TE（PH8.0）洗脱？
答：可以。
23．可否使用小于30μl的洗脱液进行洗脱？
答：不可以。因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积。24．为什么溶胶不彻底会影响回收结果的纯度？
在电泳过程中，DNA会与大分子的多糖紧密的结合在一起，凝胶的种类和质量不同，DNA与之结合力也不同，只有凝胶充分溶解，DNA才能充分释放，否则，凝胶将与DNA一起沉淀下来，洗脱后将影响回收结果的纯度。
四、连转
1．DNA连接失败（以T4 DNA连接酶为例）
（1）可能是因为反应体系内无ATP或Mg2+导致连接失败，
解决方案：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP 的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用；（2）可能是因为反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高导致连接失败，解决方案：纯化DNA；⑶可能是因为去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底，解决方案：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶；
（3）可能使因为连接末端为单碱基突出末端，解决方案：使用最高至5μl高浓度连接酶16°C过夜连接；
（4）
可能是因为插入片段和质粒没有磷酸化，假如载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，
解决方案：订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化；
（5）可能是因为插入片段太大，不能进行环化，解决方案：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接；
⑺可能是因为连接酶失活，解决方案：用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。
2．DNA平端连接效率低
解决方案
（1）低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应；
（2）在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。足够多的载体和插入片段是最重要的。要看片段具体情况而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环化的。插入的DNA片段的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键。载体通常50ng就够了，若载体在10k左右，可用50-100ng；（3）平端的连接对于离子浓度很敏感，回收的时候多洗洗，加PEG和扩大酶量，22℃2h 后4℃过夜；
（4）尽可能缩小连接反应的体积，最好不超过10μl，在5-6μl左右最佳；（5）建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14℃好。
五、细菌培养
1.
细菌不生长
（
）可能是因为培养条件不合适，培养基成分不对，解决方案：使用适合细菌生长的优化条件，选择适合细菌
生长的培养基；
（
2
）可能培养基中混入了不对应的抑菌抗生素，解决方案：去除或加入正确的抗生素。
2.
有杂菌生长
（
1
）可能是操作过程中混入了杂菌，解决方案：注意操作与培养条件，保证无菌，做平行试验检验；
（
2
）可能是样品中混入了霉菌，解决方案：空气中有大量的霉菌，注意样品的除菌处理；
（
）可能是忘记加抗生素，解决方案：加入相应的抗生素。
六、质粒抽提（
质粒提取常见问题及解决办法
）
1
．使用酚仿抽提方法，质粒的纯度很好，但酶切不能完全切开？
1)
确认酶的有效性。
2)
平衡酚是否被氧化（正常是黄色，而氧化后是棕色的）。
3)
是否不小心吸入了少量的酚。
4)
乙醇沉淀后，
乙醇漂洗的是否充分（残留的盐类会影响酶切）。
5)
乙醇漂洗后是否完全干燥（残留的乙醇会影响酶切）。
2.
提取的质粒电泳，为连续的一片火箭状？
1)
如果盐离子多，会有走胶变形的现象，如果提到的质粒不够纯，会有电泳条带不平齐的现象。
2)
当电压太大时，容易出现火箭状，而降解应该是弥散状。
3)
可能是宿主菌影响的，质粒抽提好后，用酚
-
氯仿处理一下再酶切。若有改善，则为宿主菌影响。转化到其它宿
主菌再切。
4)NaOH
的浓度过高，会出现火箭状的结果。
3
．未提出质粒或质粒得率较低，可能存在的原因和解决方法：
1)
质粒拷贝数低：
由于使用低拷贝数载体引起的质粒
DNA
提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
2)
菌体中无质粒：
有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质
粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，
检查筛选用抗生素使用
浓度是否正确。
7
3)
菌体过量，碱裂解不充分：
取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的用量（溶液
P1
、
P2
和
P3
）。一般低拷贝的质粒
5ml
的菌液，高拷贝的质粒
2-3ml
小剂量提取。对低
拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液
P1
、
P2
和
P3
（应保持
1
：
1
：
1.4
比例），可能有助于增加质粒提取量和质
粒质量。
4)
溶液使用不当：
溶液
P2
、
P3
在温度较低时可能出现浑浊，应置于
37
℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
5)
吸附柱过载：
不同产品中吸附柱吸附能力不同，
如果需要提取的质粒量很大，
请分多次提取。
若用富集培养基，
例如
TB
或
2×
YT
，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB
培养液体积。
6)
质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）
：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
7)
乙醇残留：
漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。
8)
洗脱液加入位置不正确：
洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效
率。
9)
洗脱液不合适：
DNA
只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液
EB (10 mM Tris?Cl, pH 8.5)
或水。洗脱效率取
决于
pH
值。
最大洗脱效率在
pH7.0-8.5
间。
当用水洗脱时确保其
pH
值在此范围内，
如果
pH
过低可能导致洗脱量低。
洗脱时将灭菌蒸馏水缓冲液加热至
60
℃后使用有利于提高洗脱效率。
10)
洗脱体积太小：
洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大，回收率增高，但产品浓度降低。为了
得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
11)
洗脱时间过短：
洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置一分钟可达到较好的效果。
12)
碱裂解时间过长：
加入裂解液
P2
如
SDS-NaOH
后，时间不宜超过
5min
，因为此步骤的目的是使细胞内物质释
放，蛋白质、染色体
DNA
和质粒
DNA
变性，时间过长，会导致加入中和裂解液
P3
如酸性醋酸钾后，仍无法使质
粒
DNA
复性。导致提取失败。
13)
大肠杆菌老化：
请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
14)
细菌培养物生长过度或不新鲜：
不要于
37
℃培养超过
16
小时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的。
15
）
洗脱效率：
洗脱效率与洗脱液
PH
值、洗脱液用量、洗脱次数、加入洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。
PH7.0-8.5
之间，洗脱液用量不得小于
50μl
，重复洗脱
2-3
次，增加室温静置时间及
65
℃水浴预热可以有效
提高得率
30%
。
4
．测序鉴定时没有问题的细菌，
37
℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常？
这种情况常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法：
1)
降低培养温度，在
20
～
25
℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2)
使用一些特殊菌株，如
Sure
菌株，它缺失了一些重组酶，如
rec
类等，使得质粒复制更加稳定。
3)
质粒抽提酶切不完全的可能原因是溶液Ⅱ中的
NaOH
浓度过高造成的。
5
．试剂盒提取质粒纯度不高，如何解决？可能存在的原因和解决方法：
1)
混有蛋白：
应在加入去蛋白液后，以足够高的转速离心，使沉淀紧密，并小心地吸取上清液，避免吸入沉淀。
另外，不要使用过多菌体。经悬浮液、裂解液、中和液处理，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮
物可再次离心去除后再进行下一步骤。
2)
混有
RNA
：
RNase A
CNAS 实验室认可常见问题 一、关于认可规则 1．某实验室工作人员以CNAS-RL01 第10.1.1 条“变更通知”中“c）认可范围内的检测/校准依据……工作范围……发生重大改变；”为依据，认为校准能力的扩大属于变更，而不是扩项。为种说法是否正确？应如何解释？ 答：这种说法不正确。CNAS-RL01 第10.1.1 条所述变更，是指认可范围内的变化，校准能力扩大，扩大部分不在认可范围内，所以不能按变更处理，应按扩大认可范围（简称扩项）处理。 二、关于CL10 1.CL10 中规定的技术管理者不具备，是否此领域不予认可？ 答：是，化学领域不予认可。 https://www.doczj.com/doc/ae9101944.html,AS-CL10 中的“注”与正文是否有等同作用？ 答：CL10 中的“注”是对正文的解释，或举例。 3.CL10 在定期使用中间点的校准标样检查校准曲线会造成误导实验室以为制作一条校准曲线只要满足上述要求可长期使用，不正确使用方法！不符合分析化学基本要求！如何处理？ 答：CNAS 认可的实验室，有境内实验室，也有境外实验室，CL10 规定的是最低要求，也是采用国际上的通用规则。如果相应国家标准中有明确规定的，实验室应执行国家标准。 4.申请的化学领域的授权签字人如都达不到CL10 要求怎么办？是否可以推荐了其化学技术能力，但没有推荐化学领域的授权签字人？ 答：如果实验室某个领域没有符合要求的授权签字人，则该领域的能力不予认可。 https://www.doczj.com/doc/ae9101944.html,AS-CL10:2012 5.2.1 条款要求实验室从事化学检测的人员具有化学或相关专业专科以上的学历，或者具有10 年以上化学检测工作经历,该条款在某些实验室的化学检测人员的工作年限会达不到，能否有个比例，使没有相关专业专科以上学历而从事化学检测的人员，通过学习、培训取得上岗证，在工作中学习积累工作经验和工作年限。如评审中出现该不符合项，实验室除招有资质的人员难于整改。如招不到符合条件的人员，该不符合项关闭不了，评审组难于限制化学检测能力。 答：此条款是强制性要求，比例是100%。对于人员不能满足要求，或相关不符合项不能在规定时间内完成整改的，则相应项目不予认可。此类不符合项的整改验收，应安排现场跟踪验证，包括安排现场试验。6．CNAS-CL10：2012 于2012 年6 月11 日发布，2013 年1 月1 日实施。在2013 年1 月1 日前，评审时发现实验室未按照CNAS 要求进行自查，和实验室的做法不符合新的应用说明要求，应如何处理。 答：①现场发现实验室没有进行自查的，评审组应提醒实验室进行自查。②如果评审依据是旧版文件，即使实验室没有按照新版文件操作，评审组也不能开不符合项，只能是提醒实验室。 7.化学实验室的标准物质按CL10 要求是要按计划进行核查。但在CL01 中只要技术和经济条件允许，应进行…,按哪个要求进行评定。 答：应执行CL10 文件，因为应用说明文件是对通用认可准则（CL01）要求的明确和细化，允许其要求高于通用认可准则。 8.CL10 对技术负责人的要求，在司法鉴定机构中，如公安司法鉴定机构中其角色是要求理化室技术负责人，还是机构的技术负责人之一？ 答：是认可实验室的技术管理层中的1 人，如果理化室只是司法鉴定机构中的1 个部门，则应是机构的技术负责人之一。 三、关于检测经历 1.认可说明中关于检测经历，如何理解？对于同类产品，其中没经历产品的检测项目能被有经历的产品检测项目覆盖，可不可以视其为有经历？ 答：①如果实验室从没做过该产品的检测，即使能被其他产品覆盖，也不能认可。CNAS-EL-01 中明确规定认可的是实验室经常开展的检测活动。②如果实验室以前做过该产品的检测，只是由于客观原因，近两年没有检测经历，而且实验室也能提供通过试验证明其他有检测经历的产品的检测能够覆盖此产品的证据，可
ISO IEC 17025-2017校准实验室认证认可常见不符合 项及不符合项分析 在实验室认可中，校准实验室是一类特殊的实验室，是检测实验室设备的量值溯源机构。校准实验室通过量值传递将国家基准所复现的计量单位传递到测量标准再传递到测量设备（工作用计量器具），保证了测量设备测得量值的准确性和一致性。因此，校准实验室的管理水平和技术能力就会直接影响检测实验室出具结果的准确性。做好校准实验室的质量管理，提高校准实验室的技术能力，对保障测量结果的准确有重要意义。 校准实验室认可中的不符合项可以明确指出实验室在哪些方面存在不足或者需要改进，使实验室管理体系改进更具目的性，也能为下一步的认可活动提供依据。同时校准实验室在不符合项的整改过程中也能加深对CNAS的相关要求的理解，从而不断改进质量管理体系。分析总结校准实验室不符合项的分布能发现校准实验室在质量管理体系运行中的一些共性问题，对校准实验室和评审组都有重要的借鉴意义。 本文分析了60家校准实验室60次现场评审的不符合项数据，根据不符合项的类型进行了分类，针对其中出现频次高的不符合项进行了详细分析，并给出了切实可行的解决措施。
一、不符合项样本概况 样本量：本文随机抽取了60家以校准为主要业务的实验室，涵盖了省级计量院、地市级计量院、企业内部计量中心、民营校准实验室、国防计量机构等校准机构，评审任务为复评、初评、复评+扩项等三类评审任务，不符合项共计339个，评审依据为CNAS-CL 01：2006《检测和校准实验室能力认可准则》、CNAS-CL 06：2014《测量结果的溯源性要求》（新版文件为CNAS-CL 01-G002）、CNAS-CL 07：2011《测量不确定度的要求》（新版文件为CNAS-CL 01-G003）、CNAS-CL 25：2014《检测和校准实验室能力认可准则在校准领域的应用说明》（新版文件为CNAS-CL 01-A025）、CNAS-CL 52：2014《CNAS-CL 01检测和校准实验室能力认可准则应用要求》（新版文件为CNAS-CL 01-G001）以及CNAS-RL02：2015《能力验证规则》。 鉴于ISO/IEC 17025：2017已于2017年11月发布，本文将结合ISO/IEC 17025：2017的新要求，按照类别将不符合项分为18类，如表1所示：
浅谈当前工地试验室检测存在的问题与建议摘要：工地试验检测是公路、航道工程质量控制的主要手段。然而,随着近年来航道工程的迅猛发展，工地试验检测工作却出现了诸多与之不相适应的问题。笔者结合几年工地试验检测工作实践，对当前工地试验检测工作中普遍存在的问题进行了深入分析,并提出建议。 abstract: site experimental detection is the primary means of highway and waterway engineering quality control. however, with the rapid development in recent years, there are many incompatible problems occuring.based on years of practice, the author would like to conduct in-depth analysis and recommendations against current common problems. 关键词：工地试验室；检测；问题；建议 key words: site laboratory, detection, problems, suggestions 中图分类号：ts736+.2 文献标识码：b文章编号：2095-2104（2011）12-0000--02 工地试验室承担了工程项目大量的试验检测工作，而能反映工程建设质量的数据均是通过工地试验检测得来的。然而，工地试验检测往往会受到工程资金、进度、施工形象要求等方面的影响而不能很好地开展，甚至有的工程项目工地试验室形同虚设，试验检测工作只流于形式。笔者结合多年航道工程工地试验检测工作实践；
报批细节 1、技术档案： 技术人员简历表、培训档案、要求有实质性文件如每人的学历证书、上岗证、科研成果（课题）、技术文章、获奖证书等的复印件 2、仪器档案： 实验室所有仪器的购买、使用、校正、放置地点、出厂编号、说明书复印件等 实验室所有仪器维护校正记录如：加样器、温度计、温湿度计需出具计量局校正报告文件（可每种只校正一套作为标准）。 扩增仪需有仪器厂家专业技术人员维护校正报告，和校正后的参数。 加样器的出厂编号、使用时间、校正记录。 5700维护后验证记录—用同一公司或校准试剂或用自制质控血清并记录数值 3、其他细节: 垃圾处理：按生物污染性制品，交医院统一处理。 仪器简单操作流程 标记笔、枪头盒等一些小物品都要标明分区。 仪器的申请、采购、使用、验证程序 样本采集（针对临床医护人员）、运输、收集程序 样品的唯一编号原则—应区分开不同天、不同种类的标本 标本的保存程序—包括处理前、刚处理后、报告发放后的原始标本（原则上至少保留一周）应有专人负责。 检测结果的保存、备份记录、质控记录保存，除电脑记录外应有相应的手抄记录（类似于基因日检测统计表类型的）。 抱怨记录—应有时间、事件（项目）、接待人、处理方法、处理结果、处理人签字确认
注意事项 1、回答任何问题都应与自己写的SOP文件相一致."写你所做的,做你所写的". 2、SOP文件不能写的太虚,无法做到的东西不要写,比如公司版的SOP文件里的加样器的校准一般实验室就做不到.模棱两可也不要写,比如"消毒时间一到两小时"不能这样写,多少就是多少. 3、处理标本要在生物安全柜内,而加样则在柜外. 4、各区门口要贴有各区的工作制度,限入标志.还要准备两个登记本,一个来记录紫外消毒,一个来记录工作人员出入.区内还要有一个工作记录本,用来记录各区每天的工作内容,便于监测每天的工作全过程. 5、每把枪的用途要清楚,不能弄乱.比如稀释阳模的枪和处理标本的枪不可混用. 6、普通离心机处理分泌物标本时应在离心后静置20分钟才能开盖.(许斌这样认为) 7、所有仪器、设备都要有档案卡. 8、所有的清洁消毒要在实验结束后马上进行,尤其是仪器、设备.像扩增仪，每天都要清洁，做完的反应管决对不能留在样品槽内。 9、各区的拖把、抹布不得混用,标记清楚. 10、生物防护意识要强,手套要随时更换.生物防护安全的保证要从三个方面:制 度、硬件、意识。 11、爆管如何处理:立即停止实验,水浴里的水要倒掉,冲洗.所有可能污染的地方 要用消毒液擦洗,紫外照射,通风排风. 12、各区应有日常工作核查表,做为每天工作记录的补充. 13、各区要有泡有消毒液的生物污物桶,用来处理生物垃圾. 14、验收组带来的标本要按平时对待临床标本一样处理,要有接收记录,结果登记 等. 15、拒绝电话或代领等非正常方式发放报告单. 16、存放标本的冰箱要上锁,钥匙及电脑资料的密码要由本科室人员专人保管. 17、报告单上要注明试剂的检测下限,不能写成参考范围.除了有操作者,还要有 核校者,且两者姓名除了电子打印还要用手签.定量结果不能有阴阳性提示,
实验室CNAS评审常见问题精编 1. 企业内部实验室通过CNAS认可，可否作为第三方对外出具证书报告? 答：CNAS认可，是对实验室能力的认可，可否作为第三方机构对外出具证书报告，还要符合国家法律法规的要求。例如国家计量法规定作为第三方检测机构对外出具检测报告要通过计量认证。 2. 如何定义“多地点实验室”?同城，但试验场所分散在几个地点的，是否算“多地点实验室”? 答：CNAS-RL01中有“多场所实验室”定义，可以查看。不同的地址，就是不同的场所，即使是同城，也是多场所。 3. 定期监督评审时，未安排某领域的技术评审员(譬如电磁兼容)，是否可以不监督该领域? 答：可与项目主管沟通确认。因为监督评审有可能是涉及认可的部分技术能力。 4. 检测报告后面附有企业广告。 答：作为第三方检测机构，此举不妥。但是作为第一方检测机构，检测报告后面附有本企业的广告，可以。 5. 初次和扩项评审申请是否应要求实验室提供方法验证记录复印件给认可委?以便顺利评审。 答：目前只要求实验室在申请非标方法时提供方法确认记录，申请标准方法的暂没要求提供方法验证记录，将来是否还需要提供，将视情况而定。评审组长在审查申请材料时，如有需要，可要求实验室提供。
6. 经CNAS认可的第一方和第二方实验室能否开展外部客户委托检测服务?这些实验室认为通过CNAS的实验室认可有对外出具的检测报告的资质? 答：实验室认可只是对能力的认可，实验室能否对外开展检测服务，提供检测报告，还应符合国家相关法律法规的要求。并不是通过实验室认可就可以对外开展检测服务了。 7. 如果企业把某已经建设好的实验室(具备合格的场地、设备、人员)送给一个公司，有书面的赠送文件，场地在该企业厂区内，该实验室本来是该企业的内部实验室，为产品出产把关用的。该公司申请认可，这样可以吗? 答：只要满足CNAS-RL01《实验室认可规则》中的认可条件，就可以认可。CNAS 需要判断该赠与合同的法律效力，以及其实施情况。 8. 关于监督评审的设想：目前3年2次的评审，对实验室的负担比较大，建议CNAS 制订实验室监督评审的具体规则(SOP)，可以将实验室对认可准则、规则执行情况进行考核分类，对执行好的实验室可免除现场监督评审，只进行文件评审。这样也是对表现好的实验室的一个激励措施。 答：首先3年认可周期中只有次监督评审，而非2次。其次定期监督评审时要进行现场评审，是ISO/IEC17011标准的要求，CNAS遵照执行。对于分级管理，CNAS一直在考虑和研究这个问题，待时机成熟后才能实施。 9. 实验室认可评审工作指导书B版与A版的区别。 答：2012年，CNAS组织机构调整，所有体系文件均由A版升级为B版，其他无变化。 - 1 -
一文汇总实验室出现的日常问题及其解决办法 实验室出现的诸多小问题解决技巧汇总： 在酸性或碱性条件下做的反应，如果可能的话，产品后处理的时候，尽量中和一下。否则，产品放久之后可能会分解。 我们这儿用完重氮甲烷后，总会加点酸去破坏剩余的重氮甲烷。有位哥们胆子大直接用浓盐酸（应该用稀的盐酸或醋酸），结果和残余的碱剧烈放热，重氮甲烷的乙醚溶液呀~~~~就这样把他征服~~爆炸了！还有一位老师就是分液漏斗的塞子上没涂真空脂，一摩擦就把乙醚给烧起来了好恐怖呀。 大家用重氮甲烷时一定要千万注意，第一次最好有个有经验的人在旁指导，不要自己随便做，量也不要太大，亚硝基甲基脲最多25 克别贪多，要是需要量大就分几批去做。 夏天用乙醚的时候一定要注意。我今年8 月用乙醚萃取，只在分液漏斗里轻摇了一下，正要准备放气，炸了，还好没伤到我。我的产品阿！！！ 有一次我做分液萃取，先是用50ml HCl 洗涤有机相（含产品），然后再用50ml 5% NaHCO3 洗涤产品，结果振摇的时候，塞子被冲开了，产品全部喷出来了。原因是没有放气。 大家洗涤产品的时候一定要小心，如果洗涤会生成气体的话，一定要注意放气。 在有机所的五年，耳闻目睹了很多安全事故，深感多一份细心，多一份保障。现将我所知道的实验室里面的潜在危险总结如下：欢迎大家就自己知道的进行补充： 一、溶剂处理方面的潜在危险： A、溶剂无水处理前，一定要预处理 对于低沸点的溶剂，如乙醚，正戊烷等一定要先用干燥剂预先干燥，然后再加入钠丝进行回流，并且加热不能过快过高。因为，一旦溶剂里面的含水量过大，那么生成氢气很剧烈的话，溶剂极易冲出体系，然后遇见明火或正在加热的电阻丝，发生爆炸。这一点在有机所是有先例的，当时的惨状是，爆炸的冲击波从三楼冲到顶楼，把通风装置炸的粉碎。包括对面实验室的整扇窗都被推倒。 对于醚类溶剂，如果生产时间较长，或者久置不用的话，一定不要震动，同时要加入还原剂，除掉生成的过氧化合物。也是一个博士生，在处理久置不用的处理THF 的装置的时候，刚一拔磨口活塞，就发生爆炸，满脸血肉模糊。 用钠处理的溶剂和卤代烷溶剂处理装置不能公用一个与大气相连的装置。有些同学为省事或节约空间，把所有溶剂处理装置中保证与大气相通的装置相连，这样做的危险是很可能如果卤代烷，特别是二氯甲烷，加热的时候温度较高，无法冷凝下来，这样，有可能密度较大的卤代烷就会顺着相同的管道，进入用钠丝干燥的溶剂的体系。一旦出现这样的事情，肯定是爆炸。大家知道，卤代烷在金属钠的作用下的偶联反应非常剧烈。 B、废溶剂的处理，绝对不要发生酸性液体和碱性液体，氧化性液体和还原性液体的混装，这样非常危险。在有机所，废液桶爆炸不是一次两次。对于SOCl2, PCl5, PCl3 绝对不能未经处理就放入废液桶，后果也很危险。 二、实验操作方面的潜在危险： 1、对于加热、生成气体的反应，一定要小心不要成了封闭体系。 2、应该小心滴加、冷却的反应，一定要严格遵守，不要图省事。 3、反应前，一定要检查仪器有无裂痕。对于反应体系气压变化大的反应，大家一般都会注意。但是，有些问题就是在你想不到的时候出现。我在一次萃取的时候，量在2 升左右，发现分液漏斗有一个裂痕，以为没有问题。结果，在手中
由于ELISA(酶联免疫试验)具有灵敏度较高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝炎、爱滋、优生优育等。虽然洗板只是ELISA实验重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我们必须对影响ELISA实验结果各因素有一定的认识。优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。尤其是花板现象（就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的OD值却明显偏高）是各个厂家洗板机调试中经常遇到的问题。现将ELISA实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。 1 标本及采集、贮运因素 严重溶血，以HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不彻底、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。 血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。一般说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需－20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存；最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。 2、试剂的影响 ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA 反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学地对待反应结果。基因工程抗原较合成肽抗原有无可比拟的优越性，就HCV-ELISA 试剂盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是HCV 特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV 的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV 特异性抗原。第三代试剂的敏感度大大提高了。基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下： 基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点： a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。 b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的试剂盒效期只有3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。
实验室常见岗位职责大全 检测实验室有哪些岗位？这些岗位又有什么职责呢？13种实验室常见的岗位职责，但每个实验室情况不一样，此职责不必生搬硬套，仅参照使用。 1实验室主任 1.1 实验室主任为本公司最高管理组，负责贯彻执行国家有关的方针政策和贯彻执行CNAS-CL01（即《检测和校准实验室能力认可准则》）、《检验检测机构资质认定评审准则》及相关要求和持续改进管理体系有效性； 1.2 确立质量方针、质量目标，领导建立管理体系，为体系建立和运行提供资源保障，并确保管理体系在策划和实施变更时的完整性； 1.3 审批《质量手册》、《程序文件》等管理体系重要文件； 1.4 确定实验室的组织结构与人员配备，明确岗位职能分工，任命技术负责人和质量负责人，聘任专业技术人员和部门负责人，任命关键岗位人员，指定关键管理岗位的代理人； 1.5 规定岗位任职资格条件，确定人员技能发展目标； 1.6 在实验室内部建立适宜的沟通机制，并就确保与管理体系有效性的事宜进行沟通，充分发挥各职能部门的作用，协调各部门的工作； 1.7 负责设备配置，确保满足检测工作需要； 1.8 审批管理评审计划，主持管理评审会议； 1.9 最高管理者应将满足客户要求和法定要求的重要性传达到组织。
2.1 全面负责本公司技术工作管理，贯彻执行CNAS-CL01（即《检测和校准实验室能力认可准则》）、《检验检测机构资质认定评审准则》及相关要求和持续改进管理体系有效性； 2.2 负责本公司技术作业指导文件、技术记录表格、第三层文件的批准及相关体系文件的审核； 2.3 负责新开展项目的提出、论证审批工作； 2.4 组织有关人员解决检测活动中的技术问题，并保证资源的提供； 2.5 制定本公司员工年度培训、考核计划； 2.6 审批年度质量监控计划、参加能力验证计划与实验室间比对计划； 2.7 审批期间核查计划、方案、作业指导书及不确定度报告； 2.8 制订技术改造的措施和方案，并负责规划措施的论证和审定工作； 2.9 负责检验人员技术能力和水平及其资格的确认； 2.10 负责环境设施的配置、改造或维修报告的审批； 2.11 批准允许偏离的申请，批准仪器设备量值溯源计划，批准标准物质报废申请； 2.12 主持选择合格的分包方，审批分包方评审结论和合格分包方名册； 2.13 审核供应品和服务采购申请中的技术内容； 2.14 主持不符合工作的评价； 2.15 审批仪器设备周期检定、校准计划，确保量值溯源。
浅谈试验操作中的常见问题 中交一局海外公司亚的斯公司（张君） 摘要：试验检测技术已经作为一门新的学科出现在现代工程建设中。不仅作为工程施工质量过程控制的技术手段，还作为对工程运营过程的使用性能的监测依据。通过分析试验监测技术中的常见问题，提高试验检测的技术水平。 关键词：试验检测；仪器设备；常见问题；影响 一、引言： 试验检测任务在工程建设项目中，始终贯穿于整个项目过程。包括项目前期的原材料的料源确定，品种规格的取舍，混合材料的配合比设计；项目实施过程中的质量检验控制，原材料的定期检验调校；项目后期的产品质量验收与评定。在整个试验过程中，对试验真值的取舍一直是困扰试验检测人员的关键问题。样品的不均匀性、不同试验设备的差异性、不同试验操作人员的主观操作性等，以及结果计算过程中，数位、数字的取舍与进位等。都是影响施工质量与进度的关键问题。 在以往的关于试验检测的教材中，大多对样品的不均匀性和结果计算过程中数字修约的问题着重的介绍与讲解。这里我就不再过多的探讨。在试验操作讲解中主要介绍一些相关的使用设备和大致的试验步骤。相对于刚刚接触试验检测工作的新人来讲，这样的介绍，只是在他们的头脑中形成了一个系统的、抽象的、模糊的概念。在实际的操作过程中，由于试验设备与教材中的差异，试验环境的改变，试验样品的多样化等不同的因素。常常会使年轻的试验检测员们遇到很多细小甚微的细节问题。困扰着新人对试验操作的标准化、规范化、合理化的认识。从而影响了试验结果的真实性和有效性。根据在以往的试验过程中遇到的细小问题，通过具体的实例反应出在今后的试验过程中试验检测人员应该注意的细节。 二、常见问题实例 2.1熟悉和掌握设备的性能及操作 作为一名合格的试验检测人员，进入试验室后首先要对今后工作的试验仪器有所了解。包括其性能，工作额定电压，试验量程等基本参数。在进行试验检测操作之前，要对试验设备进行简单的检查和开机试运行。当确认试验设备运转正常之后再进行正式的试验操作。 2.2天平的正确使用习惯 常规试验中最长应用的设备应属天平。在现代试验室中大多数天平都采用了电子天平。其使用简单，读数便捷快速，大大地提升了试验检测的效率。电子天平的方便快捷给试验检测的技术进步提供了长足的发展，但是往往在其使用过程中，出现纰漏，误操作或是野蛮操作的问题。降低了一起设备的使用寿命，也对试验数据的真实有效性产生了影响。早期的电子天平大多为三角螺旋调节天平的水平，外置圆水准泡。新近出产的电子天平多为四角螺旋，更有利于天平的调节。在天平的使用过程中，往往使用者经常忽略水准螺旋的调节，也不愿意检查水准气泡是否居中。拿来样品就直接放在天平上称量，对于精度要求不高的试验项目，这样的称量方法对结果的影响不会产生很大的影响，但相对于称量精度高的试验
实验室认可常见问题 一、关于认可规则 1. 某实验室工作人员以CNAS-RL01第10.1.1条“变更通知”中“c）认可范围内的检测/校准依据……工作范围……发生重大改变；”为依据，认为校准能力的扩大属于变更，而不是扩项。为种说法是否正确？应如何解释？ 【答】这种说法不正确。CNAS-RL01第10.1.1条所述变更，是指认可范围内的变化，校准能力扩大，扩大部分不在认可范围内，所以不能按变更处理，应按扩大认可范围（简称扩项）处理。 二、关于CNAS-CL10 1．CL10中规定的技术管理者不具备，是否此领域不予认可？ 【答】是，化学领域不予认可。 2．CNAS-CL10中的“注”与正文是否有等同作用？ 【答】CL10中的“注”是对正文的解释，或举例。 3．CL10在定期使用中间点的校准标样检查校准曲线会造成误导实验室以为制作一条校准曲线只要满足上述要求可长期使用，不正确使用方法！不符合分析化学基本要求！如何处理？ 【答】CNAS认可的实验室，有境内实验室，也有境外实验室，CL10规定的是最低要求，也是采用国际上的通用规则。如果相应国家标准中有明确规定的，实验室应执行国家标准。 4．申请的化学领域的授权签字人如都达不到CL10要求怎么办？是否可以推荐了其化学技术能力，但没有推荐化学领域的授权签字人？ 【答】如果实验室某个领域没有符合要求的授权签字人，则该领域的能力不予认可。 5．CNAS-CL10:2012 5.2.1条款要求实验室从事化学检测的人员具有化学或相关专业专科以上的学历，或者具有10年以上化学检测工作经历,该条款在某些实验室的化学检测人员的工作年限会达不到，能否有个比例，使没有相关专业专科以上学历而从事化学检测的人员，通过学习、培训取得上岗证，在工作中学习积累工作经验和工作年限。如评审中出现该不符合项，实验室除招有资质的人员难于整改。如招不到符合条件的人员，该不符合项关闭不了，评审组难于限制化学检测能力。 【答】此条款是强制性要求，比例是100%。对于人员不能满足要求，或相关不符合项不能在规定时间内完成整改的，则相应项目不予认可。此类不符合项的整改验收，应安排现场跟踪验证，包括安排现场试验。
工地试验室检查中常见的78个问题 2016-01-08陈海东 作者陈海东本站原创，禁止转载 陈海东，监理检测网试验检测公益讲师。男1969年4月出生；江苏盐城人。盐城路桥建设工程有限公司中心试验室主任。 我们公路工程施工，目前第三方检测还没全面普及，特别是施工方、监理方，中标后成立试验室，这个工地试验室的性质隶属于中标单位自己。所有的检测是自检，自己建的试验室在很大的程度上要为各自己的利益说话了。当然业主现在一般是第三方检测了。加强工地试验室的管理就显得非常必要。 总结了两个方面78点，欢迎大家到监理检测网论坛中交流。 内业资料 1、工地试验室是由母体试验室授权的。工地试验室主任是由母体试验室任命的。 2、工地试验室有没有经过省厅、市局的质监部的备案。备案有没有过期 3、现场的试验人员与备案上的人员有没有变化，变化率为多大，有没有经过审批。 4、工地上的试验人员是否是母体公司注册人员。很多试验人员的证书不注册，就放在自己身上。江苏已在治理这些事。 5、作为母体的试验室，有没有对工地试验室进行监管检查，检查的记录如何。 6、试验室的仪器设备与投标书是否相符，能否达到工程检测的要求。 7、工地试验室不能检测的试验，外委什么单位做，有没有相关单位的资质、合同。监理检测网 8、上墙的制度要加盖受控章。 9、高速公路的持证试验人员，一个亿要有5~6个，二个亿要有9~10个。挂证也算啊。师证要全啊，路材桥全要。不然根本完不成大量的试验检测任务。相当还要辅助人员。 10、挂证人员的签字和资料的上签字核对一下笔迹就能发现问题。 11、台帐和试验记录要一致。 12、一个试验人员，同一天不可能做很多事，不能到处签字。 13、同一次的几个试验数理雷同太厉害。
实验中可能出现的常见问题与解决办法 一．污染 污染是指由于微生物的侵染，在组织培养容器中滋生大量菌斑，使组培材料不能正常生长和发育的现象，主要有以下5方面的原因： 1.器具灭菌：实验的所有器具都要在121°C消毒25min，若灭菌温度不够 或者时间不足，都会导致污染。灭菌时要求冷空气完全排除，否则会达不到指定温度。其次，要做好灭菌登记，杜绝出现人为失误造成的污染。此外，在接种过程中，每用一次都要在火焰上彻底灼烧，特别在接触到污染物时极易引起器具污染。 2.外植体：很多材料在灭菌后其实还是带菌的，不过量比较少，短期应该 观察不到被感染的现象。 3.接种操作：首先，接种人员的手，手腕要用酒精棉球好好擦拭。其次， 对于放置在外的培养物（灭菌好的培养基）其瓶子外壁上有灰尘与微生物，放入超净台前可以用酒精消毒一下。再者，很容易出现瓶口的污染，所以接种人员的技术要娴熟，干练。 4.环境条件：加强环境的灭菌消毒。若有污染的材料不可以就地清洗，必 须高压杀菌后再清洗，否则会导致大量孢子弥漫。此外，要及时打扫卫生，定期蒸熏消毒。保证环境的干净。 5.超净工作台：要定期对初过滤器进行清洗和更换。此外，每次使用前要 提前20min打开机器预处理，并对台面进行酒精喷雾消毒。 二．材料死亡 实验过程中，很可能出现材料死亡，主要有以下几个方面： 1.外植体灭菌过度：一旦材料太小或灭菌时间太长，剂量太大，就会导致 材料死亡，所以要严格控制时间。 2.污染：大量污染会造成材料死亡。 3.培养基配置出现问题：在激素配置或营养成分配置出现问题时，材料易 死亡，常常发生在无生长点的材料和愈伤组织中。 4.培养环境的恶化：温度过高，透气不好，培养过于密集，久不转移，有
实验室认可审核常见提问问题100个
1、为什么要建立质量管理体系？ 2、最高管理者、技术管理层和质量主管在实验室中各担负哪些职责？ 3、纠正措施的实施有谁负责？ 4、质量主管是否应对检测/校准质量承担领导责任？ 5、在检测/校准活动中，实验室员工应对顾客的什么信息承担保密责任？ 6、什么是二级法人实验室？ 7、如何绘制组织结构图？ 8、实验室可分配的资源有哪些？ 9、二级法人的实验室如何保证质量活动的公正性？ 10、如何进行实验室的组织设计？ 11、质量管理和全面质量管理的目标是什么？ 12、实验室如何加强质量管理？ 13、ISO/IEC 17025中监督主要指什么？ 14、质量管理部门和监督员的工作有何不同？ 15、怎样做到足够的监督？ 16、监督员由谁担任合适？ 17、授权签字人的数量多少较为合适？ 18、如何制定实验室质量方针？
19、如何制定实验室质量目标？ 20、质量承诺应包括什么内容？ 21、实验室有哪些质量管理体系文件？ 22、如何对文件进行受控管理？ 23、如何获得外来法规性文件发布或更新的信息？ 24、如何获得外来技术文件的文本？ 25、如何获得国际标准？ 26、为什么要进行文件的定期评审？ 27、如何进行文件的定期评审？ 28、外来文件的评审包括哪些内容？ 29、哪些文件应该进行受控管理？ 30、过期的技术文件是否一定不能使用？ 31、技术文件的格式是否需要经过批准？ 32、受控的文件是否一定要改“受控”印章？ 33、如何建立文件的受控编号？ 34、如何建立文件的识别编号？ 35、网上发布文件应注意什么？ 36、表格的制定应注意什么？ 37、怎样进行要求、标书和合同的评审？ 38、在检测/校准分包活动中，发包方和接包方分别承担什么法律责任？
实验记录常见问题 1、实验室记录分为哪两大类？ 质量控制记录、技术记录。 2、记录可以是哪些格式？ 记录可以是文字、表格、图片、视频、音频等格式。必须保存纸质原始记录和电子记录。 3、您实验室的记录由谁保管？该岗位人员是否需要授权？ 1、根据实验室内部规定，无强制规定。 2、未强制规定授权，实验室可自行决定是否授权。 4、记录保管员应接受哪些培训？ 1.实验室体系文件培训（重点强调保密性、记录保存和借阅相关内容）； 2.岗位职责和权利； 3.安全相关内容，包括灭火器的选择和实际操作； 4.相关记录的填写。 5、是否需要设置专门的资料室存放记录？ 没有文件规定必须要有资料室。可设置专门的资料室，也可共用。但是都要满足存放条件。建议实验室设置专门的房间存放文件和记录。 6、记录的存放环境有哪些要求？ 存放环境应防火、防水、防盗、防鼠、防震、防日晒、防虫蛀、防霉、防磁； 1.防火：应远离火源，配备干粉或二氧化碳灭火器； 2.防水：资料存放柜附近不应有水，楼上不应该是容易漏水的房间；
3.防盗：资料柜应有锁，钥匙专人保管； 4.防鼠：文件柜应能承受鼠类啃咬，必要时放置灭鼠装置； 7、记录更改有哪些注意事项？ 1.禁止涂改，修改后能可识别修改前的内容； 2.应可识别修改的人员，注明修改日期； 3.必要时注明修改的原因； 4.仅记录人和授权人员可更改记录，未经授权不可改别人的记录； 5.电子记录的修改应满足以上要求； 6.若记录不具备划改的条件，可换一张记录表写明，保留原来的记录； 7.报告若有错误，不可划改，应重新编辑、打印（报告没发出去，审核时发现错误，就从新打印，旧报告无需保存。如果是已经发出去的报告，需要更改，那就得保存原报告，注明新报告是对原报告的替代，原报告作废）。 8、电子记录有哪些注意事项？ 1.加密，加权限； 2.定期备份，备份的记录应存放在不同位置/服务器； 3.定期检查； 4.尽量使用图片或PDF，避免使用word、excel、txt等易修改的格式； 5.电子记录的修改应满足记录修改相关所有的要求。 9、如何确保记录在满足保密性的前提下易于获得？您实验室是怎么做的？ 纸质记录：专人保管，批准查阅； 电子记录：设置权限，实时更新权限。
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种实验室常用的检测方法，广泛应用于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。与其他基于抗体的检测方法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和非特异性相互作用的分离，并可通过最终有色产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。 ELISA 实验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以及组织裂解物等为样品。该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测方法。 该实验可迅速分析大量平行样品，在基础研究和临床诊断实践中广泛使用。 一、直接ELISA 原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。加酶标抗体进行孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反应。直接法主要用于测定抗原。 优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。 缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高。 二、间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，加底物显色。 优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗；不直标一抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使用标记抗体更少。 缺点：交叉反应几率升高。 三、双抗夹心法ELISA 原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加入待检样品，保温孵育。样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体（检测抗体）保温孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。加底物反应。 双抗原夹心法测抗体的反应模式与测抗原相似，用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。
实验室认可中常见问题 2013-07-09 、关于认可规则 1.某实验室工作人员以CNAS-RL01第10.1.1条“变更通知”中“c）认可范围内的检测/校准依据……作范围……发生重大改变；”为依据，认为校准能力的扩大属于变更，而不是扩项。为种说法是否正确？应何解释？ 答：这种说法不正确。CNAS-RL01第10.1.1条所述变更，是指认可范围内的变化，校准能力扩大，大部分不在认可范围内，所以不能按变更处理，应按扩大认可范围（简称扩项）处理。 、关于CL10 1.CL10中规定的技术管理者不具备，是否此领域不予认可？ 答：是，化学领域不予认可。 https://www.doczj.com/doc/ae9101944.html,AS-CL10中的“注”与正文是否有等同作用？ 答：CL10中的“注”是对正文的解释，或举例。 3.CL10在定期使用中间点的校准标样检查校准曲线会造成误导实验室以为制作一条校准曲线只满足上述要求可长期使用，不正确使用方法！不符合分析化学基本要求！如何处理？ 答：CNAS认可的实验室，有境内实验室，也有境外实验室，CL10规定的是最低要求，也是采用国际上通用规则。如果相应国家标准中有明确规定的，实验室应执行国家标准。 4.申请的化学领域的授权签字人如都达不到CL10要求怎么办？是否可以推荐了其化学技术能力，没有推荐化学领域的授权签字人？ 答：如果实验室某个领域没有符合要求的授权签字人，则该领域的能力不予认可。 https://www.doczj.com/doc/ae9101944.html,AS-CL10:2012 5.2.1条款要求实验室从事化学检测的人员具有化学或相关专业专科以上的历，或者具有10年以上化学检测工作经历,该条款在某些实验室的化学检测人员的工作年限会达不到，能否个比例，使没有相关专业专科以上学历而从事化学检测的人员，通过学习、培训取得上岗证，在工作中学习累工作经验和工作年限。如评审中出现该不符合项，实验室除招有资质的人员难于整改。如招不到符合条件人员，该不符合项关闭不了，评审组难于限制化学检测能力。 答：此条款是强制性要求，比例是100%。对于人员不能满足要求，或相关不符合项不能在规定时间完成整改的，则相应项目不予认可。此类不符合项的整改验收，应安排现场跟踪验证，包括安排现场试验。 https://www.doczj.com/doc/ae9101944.html,AS-CL10：2012 于2012年6月11日发布，2013年1月1日实施。在2013年1月1日前，审时发现实验室未按照CNAS要求进行自查，和实验室的做法不符合新的应用说明要求，应如何处理。 答：①现场发现实验室没有进行自查的，评审组应提醒实验室进行自查。②如果评审依据是旧版文件，使实验室没有按照新版文件操作，评审组也不能开不符合项，只能是提醒实验室。 7.化学实验室的标准物质按CL10要求是要按计划进行核查。但在CL01中只要技术和经济条件允许，进行…,按哪个要求进行评定。 答：应执行CL10文件，因为应用说明文件是对通用认可准则（CL01）要求的明确和细化，允许其要求于通用认可准则。
Xxx试验室检查发现问题整改说明 2013年X月X日，XXX到我部检查工作,发现我部在试验室管理方面存在诸多问题。检查结束后，我部立即召开施工管理专题会,分析问题出现的原因，对试验室人员进行了处罚和教育，并要求试验室对照检查中发现的问题限期整改。同时，项目部要求其它职能部门以此次XXX检查为契机，全面展开自查自纠，举一反三，切实提高项目管理水平。现对检查发现的问题作简单说明： 问题一：混凝土拌和站配合比标识牌含水率填写未及时更新；标识牌上的监理人员在监理部名册中无法查到。 原因说明：试验人员疏于现场管理，没有及时对拌和站配合比标识牌进行更新；张东明为监理部年初聘请的监理工程师，后因故离职，目前试验监理工程师也姓张，填写错误是由于拌合站人员对监理人员不熟，工作疏忽所致。 整改情况：更新配合比标识牌内容，及时填写施工配合比。 问题二：砂石料堆放区标识牌检验日期为X月XX和X月XX 日，但工地试验室未能提供上述时间的检验合格报告。 原因说明：X月份，我部喷射混凝土回弹量很大，经讨论分析，认为是由于碎石生产线刚安装调试，材料粒径不稳定所致。为减少混凝土回弹量，试验室在检测频率符合要求的情况下，只对材料的粒径增加了试验，但对表观密度、针片状等指标未一一
作检测，因此，部分样品未出检验报告。审计组检查发现的24日和29日就属于这类情况，试验室对原材料做了筛分试验，但因检验指标不全，没有出试验报告。 整改情况：对照检测报告填写原材料标示标牌,保证试验资料的严肃性和准确性。 问题三：工地试验室养护室内温湿度自控仪、空调未使用，养护条件不能满足规范要求。 原因说明：养护室温湿度自控仪XX月XX日发生故障，不能使用。试验人员已报厂家维修，但因工地较偏僻，交通不便，检查时仪器尚未维修好。 整改情况:现养护室内温湿度自控仪已经维修好，现已正常使用，养护室内温度、湿度达到规范要求。 问题四：压力机台帐记录X月XX日使用了仪器，但未找到相对应的记录。 原因说明：经查询，X月XX日试验室为附近正在施工的XXXX 工程送来的试件进行了检测，因其不属于XXXX工程，故试验人员没有出具抗压强度报告。 整改情况：重新梳理了各类仪器的使用台账和试验记录，设专人统一管理。 审计组此次检查使我们认识到项目试验管理存在较大问题，其根本原因在于试验人员思想松懈，工作疏忽，对试验工作的重要性认识不足。项目部现已组织了为期一周的试验培训工作，力