烟草遗传转化实验报告实验目的烟草是遗传转化的模式植物,已经建立了一套完善的转化再生体系｡本实验以烟草为实验材料,了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤, 掌握遗传转化的基本操作技术｡实验要求:掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法;理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理:了解转基因植物筛选的方法｡实验原理:根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌,根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒,简称为Ti质粒｡野生型农杆菌的Ti质粒,含有两个与致瘤有关的区域: 一个是T-DNA区,含致瘤基因;另一个是毒性区,在T-DNA的切割､转移与整合过程中起作用｡用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建,是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除,并在T-DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点｡p BI121载体是常用的植物表达载体,载体的骨架是pUC18,以CaMV3SS启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素(kan) 抗性选择标记基因,含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因｡β一葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因,转化的获得的转基因细胞､组织或植株,具有抗卡那霉素的特性,经组织化学染色呈蓝色｡实验器材摇床､超净工作台､小型离心机､冰箱､移液抢､镊子､手术刀､酒精灯､棉球､培养皿､三角瓶､滤纸､牛皮纸､牙签｡实验材料植物材料:烟草无菌苗农杆菌与载体:农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基:牛肉膏(5 g/L)､蛋白胨(5 g/L)､酵母提取物(1 g/L)､蔗糖(5 g/L)､MgSO4(0.5g/L)､pH 7.0烟草分化培养基: MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA烟草生根培养基: MS + 0.5mg/L IAA卡那霉素(Kan) 母液: 50mg/ml, 过滤除菌,分装,-20°C保存｡头孢霉素(cef) 母液: 300mg/ml, 过滤除菌,分装,-20"C 保存｡利福平(rif): 50mg/ml,过滤除菌,分装,-20"C保存｡。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。
2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。
3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。
4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。
一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。
4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。
5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。
6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。
7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。
转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥一、实验目的1.了解浸花法(floral tip)转化的机理；2.掌握拟南芥浸花法(floral tip)转化的技术二、实验原理拟南芥的花序大量产生时，将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡20秒，3-4周后对转化植株收种子。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株。
三、实验材料及仪器材料：生殖期的拟南芥植株，含目的基因质粒的农杆菌(PCAMIBIA 3301-ZEP)，无菌滤纸仪器设备：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式高速离心机，涡旋仪，抽滤器，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，培养室用具：微量移液器，金属药匙，牙科手术钩或细菌涂布器，100 ml无菌三角瓶，直径9 cm 培养，200 ml及1ml tip枪头，枪形镊四、实验步骤1)当野生型株系的拟南芥植株生长了个月左右。
将其主薹剪掉，待其次生薹长出，浸染前剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花；2)将农杆菌菌液扩大培养接入到250 ml含有50 μg/ml的Kan和Rif的YEP的液体培养基中:3)将装有250 ml YEP液体培养基的500 ml三角瓶置于28℃ 200 rpm下振荡培养24 h;4)分批次将250 ml YEP液体培养基装在50 ml离心管中多次离心，每次7500 rpm离心5 min,直到把所有的农杆菌都聚集在管底；5)用5%的蔗糖溶液。
其中加了0.02%-0.05% (VV)的silwet L-77来重新悬浮聚集在管底的农杆菌，直到把浓度稀释到OD600为1.5左右即可；6)把蔗糖溶液重悬的农杆菌菌液放入50 ml 离心管中，将花盆倒转过来，将花序浸入农杆菌中20 s，轻轻转动和晃动植物，保证腋芽生长的花都能浸到液体溶液中，取出后能看见植物上有一层水膜，轻轻晃动植物3-5 s抖掉过多的液体(花在液体中浸泡时间过长有所伤害)。
7)浸染过得植株放置在塑料盆中并用一个高的遮光的袋子遮住植株以保持其湿度,并将盆置于弱光或黑暗的条件下一天；8）将其遮光袋拿去，移到智能气候室培养，并定期补浇营养液，直到角果成熟收获种。
