实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥

烟草叶片瞬时转化实验试验方法一、实验材料及药品pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等二、载体构建及农杆菌转化烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。

通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。

三、材料的准备1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：0.5M MES 200ul 0.976g1M MgCl2100ul 2.03g100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）四、操作步骤1、农杆菌转化2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）3、确定不同农杆菌所加菌液的量：计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。

农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。

2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。

3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。

4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。

一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。

4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。

5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。

6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。

7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。

转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。

Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。

农杆菌转化拟南芥1．农杆菌感受态制备①从YEB平板培养基上挑取农杆菌单克隆，接种于5 mL YEB （含50µg/mL 利福平）液体培养基中，28ºC，200 rpm，过夜培养；②取2 mL过夜培养液接种于50 mL上述含有利福平的YEB液体培养基中，28ºC，200 rpm，摇床培养至OD达到0.5；③菌液冰浴30 min，转至预冷的50 mL离心管中，4ºC，5000 rpm，离心10 min，收集菌体；④ 2 mL预冷的50 mM 无菌CaCl2溶液（含15%甘油）悬浮菌体，即为感受态细胞；以100 µl/管分装，液氮速冻后，保存于-70ºC冰箱，备用。

2．质粒转化农杆菌感受态①吸取构建好的表达载体质粒5 µl，加入到100 µl感受态细胞中，混匀；②冰浴30 min，液氮冷冻5 min，37ºC热击5 min；③加入800 µl YEB液体培养基，28ºC，200 rpm，摇床培养5 h；④离心，留200 µl上清重悬沉淀，将菌液涂于YEB固体培养基（含质粒对应的抗生素），28ºC培养2 d，挑取单克隆，检测筛选阳性克隆，摇菌后-70ºC保存，用于下一步植物转化。

3．农杆菌侵染拟南芥花序①将筛选的阳性农杆菌在YEB（抗生素）固体培养基划板培养，至长出单克隆后挑3-5个单克隆，于5 mL YEB（抗生素）液体培养基中，28ºC，200 rpm培养16 h，（以培养基变得很浑浊为准），保菌之后全部接到250-500 mL的培养基中，培养16 h以上；②5000 rpm离心20分钟，然后用转化液（1/2MS（只用大量和微量元素），添加50 g/L的蔗糖，调pH为5.8左右，然后加200 ul/L的Silwet L-77混合），剧烈悬浮沉淀至完全悬起；③在拟南芥盛花期，将悬浮液直接浸泡地上部分约1分钟，然后用保鲜膜完全包裹以保湿，放回培养室12小时以上打开保鲜膜；④待种子成熟后（半个月左右），收取种子用于下一步筛选工作。

农杆菌花序侵染法转化拟南芥
侵染液制备
1、将保存的农杆菌拿出按1：100的比例接种与5ml含抗生素的液
体YEP培养基中。

28°C、220rpm过夜培养。

农杆菌2h左右繁殖一代，培养时间较大肠杆菌长。

2、将活化好的农杆菌按1：100的比例加入100ml含抗生素的液
体YEP培养基中继续28°C、220rpm培养16h左右。

3、次日中午测菌液OD600值，用含抗生素的液体YEP培养基作为
空白对照。

OD600值达到1.0-1.3之间时，用50ml离心管，
室温4000rpm离心10min集菌。

倒掉上清，加入悬浮液重悬
菌体，调节OD600达到0.8-1.0.
悬浮液100ml为例：ddH2O 1OOml、MS 0.216g、蔗糖5g、
L-77 30ul，调节PH=5.8
4、拟南芥有花序、花蕾的植株浸入悬浮好的菌液40-50s ,确保
所有的花都浸在农杆菌培养液中。

浸染后避光过夜，第二天
揭开覆膜。

正常光照培养。

每隔七天转化一次。

可转化3次
提高转化效率。

第1篇一、实验背景基因转化是分子生物学领域的一个重要技术，它通过将外源基因导入宿主细胞中，使宿主细胞表达外源基因所编码的蛋白质。

基因转化技术在基因工程、生物制药、农业等领域具有广泛的应用前景。

本实验旨在探究基因转化技术在微生物中的可行性，以期为后续研究提供参考。

二、实验目的1. 了解基因转化技术的基本原理和操作步骤；2. 掌握基因转化实验的操作方法；3. 评价基因转化技术在微生物中的可行性。

三、实验材料1. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、离心机、显微镜等；2. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂、质粒载体、抗生素等；3. 实验菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）。

四、实验方法1. 提取目的基因：采用DNA提取试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA，通过PCR技术扩增目的基因；2. 构建重组质粒：将目的基因插入到质粒载体中，通过连接酶将两者连接，得到重组质粒；3. 转化宿主细胞：采用热冲击法将重组质粒转化到大肠杆菌中；4. 挑选转化子：在含有抗生素的培养基上培养转化子，观察菌落生长情况；5. 验证转化子：通过PCR技术检测转化子中的目的基因，并通过测序验证其正确性。

五、实验结果1. 提取目的基因：通过PCR技术成功扩增出目的基因，片段大小与预期相符；2. 构建重组质粒：通过连接酶将目的基因与质粒载体连接，得到重组质粒；3. 转化宿主细胞：通过热冲击法将重组质粒转化到大肠杆菌中，得到转化子；4. 挑选转化子：在含有抗生素的培养基上培养转化子，观察到部分菌落生长；5. 验证转化子：通过PCR技术检测转化子中的目的基因，结果与预期相符；通过测序验证，目的基因正确插入到质粒载体中。

六、实验讨论1. 本实验成功实现了基因转化，证明了基因转化技术在微生物中的可行性；2. 实验过程中，热冲击法是一种有效的转化方法，转化效率较高；3. 实验结果表明，通过PCR技术和测序验证，目的基因已成功导入宿主细胞，为后续研究提供了基础。

农杆菌注射烟草转化编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（农杆菌注射烟草转化）的内容能够给您的工作和学习带来便利。

同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。

本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为农杆菌注射烟草转化的全部内容。

农杆菌注射烟草实验步骤农杆菌转化1. 取1µl 质粒加入50µl 刚冻解的农杆菌感受态中（提前准备1mlLB 培养液，1.5ml 灭菌管,电击杯，移液枪，枪尖等）.★感受态易失效，准备工作须充分2.吸取菌液打入电击杯，（不要产生气泡)，放入电击仪（调manal 至1。

6—1。

7）。

3.电击完立即加入1mlLB 培养基，混匀，并吸至新的离心管中。

4.28℃,摇2h （过程中可以准备抗性板子，或提前准备)。

5.涂板，(使用kan+rif 双抗板）28℃培养36h 。

6. 可做菌落PCR 检测是否转化成功,同时做菌种保藏（根据实验需要）.接菌注射1. 挑菌转接3ml 双抗培养基，27℃摇菌过夜。

★玻璃试管摇菌效果要好些2. 取20µl 菌液到20 mlLB 培养基中，(20mlLB + 100ml/L MES + 20µmol/L AS+500µlkana/L ）摇菌过夜至OD 值为1.0-1.5.●不加Rif ★准备两份，最后调OD 值会用到。

3. 3560r/min ，10min 弃上清.4. 配缓冲液MMA （H 2O+MES 10ml +MgCl 2 10ml +AS 1ml ），现配现用。

用等量缓冲液重悬菌液。

一份等量,一份少量5. 调菌液OD 值至1。

0，室温放置1h 。

将需要混合的菌液等体积混合,可注射。

中国农业大学博士学位论文转Ｍｎ－ＳＯＤ基因拟南芥、烟草与耐盐性的研究摘要盐、渍、干旱和低温等逆境胁迫是农业减产的重要原因。

长期而严重的环境胁迫会引起植物体内活性氧的积累，导致氧化胁迫，给细胞乃至整个植株带来严重伤害。

ＳＯＤ被认为是细胞内的维持活性氧平衡的关键酶，它能快速清除超氧阴离子，防止毒性最强的羟自由基的生成，清除活性氧的毒害。

Ｍｎ—ＳＯＤ位于真核细胞的线粒体中，尽管人们早己认识到线粒体是盐胁迫下最易受到伤害的细胞器之一，但是对于植物的线粒体内Ｍｎ．ＳＯＤ在盐胁迫条件下的适应性调节及其在植物耐盐性中作用还未有详尽的报道，而且在目前有限的研究结果中还存在很多的分岐。

为此本研究构建了ＣａＭＶ３５Ｓ启动子控制下的Ｍｎ．ＳＯＤ重组质粒，通过农杆菌的介导获得了转Ｍｎ－ＳＯＤ的拟南芥和烟草。

通过比较野生型与转基因的拟南芥和烟草的耐盐性、Ｍｎ—ＳＯＤ和其它抗氧化酶类活性和ＭＤＡ含量的差异、以及它们在盐适应反应中的变化，阐明Ｍｎ．ＳＯＤ在维持细胞内活性氧的平衡、保护细胞免受活性氧的伤害中的作用，为进一步改造植物耐盐品种提供理论依据。

／～√采用ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆得到拟南芥Ｍｎ－ＳＯＤｅＤＮＡ全序列，并构建Ｍｎ－ＳＯＤ片段的原核表达载体，获得融合蛋白并制备抗体，抗体效价为１：１００００。

同时以Ｍｎ－ＳＯＤｅＤＮＡ全序列构建真核生物表达载体，分别转化拟南芥和烟草，通过ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＳＯＤ活性鉴定，得到阳性转基因植株。

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定转基因植株的线粒体中有外源的Ｍｎ—ＳＯＤ的表达。

野生型拟南芥和烟草组培苗经不同浓度ＮａＣＩ胁迫处理１５天后，发现拟南芥在】５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ下烟草在２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ下植株遇到明显伤害，生长受到抑制。

检测叶片Ｍｎ．ＳＯＤ活性，结果表明拟南芥和烟草叶片中Ｍｎ．ＳＯＤ活性受盐胁迫调节，在一定盐浓度范围内（烟草１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、拟南芥１００ｍｍｏｌ／Ｌ）Ｍｎ—ＳＯＤ活性与盐胁迫程度正相关。

第1篇一、实验目的1. 掌握拟南芥转基因技术的基本原理和方法。

2. 熟悉转基因操作流程，包括目的基因的克隆、转化、筛选和鉴定等步骤。

3. 了解转基因技术在植物基因功能研究中的应用。

二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛应用的植物模式生物，具有生长周期短、繁殖速度快、基因组序列已完全解析等特点，使其成为研究植物生长发育、基因调控和生物技术的理想材料。

转基因技术是将外源基因导入植物基因组中，使其在植物细胞中表达，从而改变植物性状或赋予其新的功能。

本实验采用农杆菌介导的转基因方法，将目的基因导入拟南芥基因组中。

实验流程包括以下步骤：1. 目的基因的克隆：从基因库或基因组DNA中提取目的基因，通过PCR技术扩增目的基因片段。

2. 载体构建：将目的基因克隆到载体上，如T载体或pBI121载体。

3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。

4. 植物再生：将感染了重组载体的拟南芥叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。

5. 鉴定：通过PCR、Southern blotting等方法对转基因植株进行鉴定。

三、实验材料1. 拟南芥野生型植株（Col-0）2. 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株E. coli JM1093. 目的基因片段4. T载体或pBI121载体5. PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶等6. 培养基、抗生素、琼脂糖等四、实验步骤1. 目的基因的克隆：根据目的基因的序列设计引物，进行PCR扩增。

将扩增产物与T载体连接，转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。

2. 载体构建：将目的基因克隆到pBI121载体上，进行酶切和连接反应。

将连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。

3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥叶片。

将感染后的叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。

农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。

通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。

实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。

实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。

同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。

结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。